一株鵪鶉大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

趙洪杰

（山東省肥城市潮泉鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，山東 肥城 271614）

禽大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的禽多病型的總稱，嚴重者可導致病禽的死亡[1]。其中鵪鶉大腸桿菌病的發(fā)生無明顯的季節(jié)性，各日齡均可感染，飼養(yǎng)條件不良、飼養(yǎng)管理不善和應激反應等均可導致鵪鶉免疫力的下降，引發(fā)鵪鶉發(fā)病[2]，臨床表現(xiàn)為食欲不振、機體消瘦、羽毛蓬松、產(chǎn)蛋量下降，主要病理變化為多器官組織的實質性損傷并伴有氣囊炎、心包炎、卵泡液化和卵黃性腹膜炎等癥狀。鵪鶉的大腸桿菌病感染率高，給鵪鶉養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失[3]。目前治療該病的主要手段為使用抗菌藥物，但隨著抗生素在養(yǎng)殖生產(chǎn)中的廣泛應用，致病性大腸桿菌對常用抗生素的耐藥性日益增強，多重耐藥性菌株不斷增多，為該病的防控和治療帶來困難[4]。因此，對分離菌株進行藥物敏感性分析，可為該病的藥物防治提供借鑒與參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例來源 山東省一鵪鶉養(yǎng)殖場發(fā)病死亡的42日齡產(chǎn)蛋鵪鶉。

1.1.2 主要儀器與試劑 MALDI-TOF質譜儀（德國BRUKER）；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基購自青島海博生物技術有限公司；革蘭染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；細菌藥敏試紙購自杭州濱和微生物有限公司；超凈工作臺購自蘇州凈化設備有限公司。

圖1 剖檢病理變化A. 口腔有黏液；B. 氣管環(huán)出血；C. 心包炎；D. 腸黏膜脫落；E. 心包積液；F. 心臟干酪樣壞死。

圖2 細菌的分離鑒定及鏡檢結果A. 麥康凱培養(yǎng)基上培養(yǎng)形態(tài)；B. 可疑菌鏡檢圖片（1000 X）。

圖3 疑似菌落的質譜測定

1.2 方法

1.2.1 病理剖檢觀察 對病死鵪鶉進行病理剖檢，觀察各臟器的病理變化。

1.2.2 病原學檢測 （1）細菌的分離培養(yǎng)。于超凈臺內(nèi)無菌采集病死鵪鶉的肝臟，用滅菌接種環(huán)進行取樣，分別劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h。（2）革蘭染色。挑取上述（1）步驟中培養(yǎng)基所長菌落進行革蘭染色，具體操作步驟參照北京索萊寶科技有限公司革蘭染色試劑盒說明書進行，染色后于顯微鏡下觀察細菌染色情況及形態(tài)特征。

1.2.3 質譜測定 挑取麥康凱培養(yǎng)基上的單菌落，利用MALDI-TOF細菌質譜儀進行質譜測定。

1.2.4 藥敏試驗 將分離到的菌落擴大培養(yǎng)，然后稀釋均勻涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基，最后將藥敏試紙有序貼至培養(yǎng)基上，于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h，觀察抑菌效果。

2 結果

2.1 剖檢結果

剖檢可見病死鵪鶉機體干癟呈脫水狀，口腔嗉囊有黏液分泌，氣管環(huán)渾濁出血，腸道壁變薄，腸黏膜脫落，內(nèi)容物呈黃褐色，彌漫性條帶狀出血。卵泡液化變性，卵黃性腹膜炎，肝臟充血壞死，心臟、肝臟有纖維滲出、干酪樣分泌物。具體病變見圖1。

2.2 細菌的分離鑒定及鏡檢結果

將病料用接種環(huán)接種于麥康凱培養(yǎng)基上，可見粉紅色的菌落（圖2 A）。革蘭染色后于顯微鏡下觀察，見紅色短小桿狀菌（圖2 B），初步判斷為大腸桿菌。

2.3 細菌質譜檢測

質譜測定結果顯示，麥康凱培養(yǎng)基上的紅色菌落為大腸桿菌。

2.4 藥敏結果

藥物敏感性試驗見圖4，可見1、2、5、6、9、12號藥物周圍具有抑菌圈，結果統(tǒng)計如表1所示，分離到的大腸桿菌對阿米卡星敏感，對慶大霉素、頭孢他啶、氨芐西林、頭孢噻吩、鏈霉素、頭孢噻肟、頭孢唑林、頭孢哌酮、氧氟沙星、卡那霉素和妥布霉素耐藥。

表1 藥敏試驗結果

圖4 大腸桿菌分離株的藥物敏感性試驗結果

3 討論

鵪鶉是家禽中體型較小的品種，在國內(nèi)外家禽養(yǎng)殖業(yè)中占據(jù)重要地位，具有較高的經(jīng)濟價值[5]。鵪鶉大腸桿菌病是由埃希氏大腸桿菌引起的鵪鶉常見病，各日齡鵪鶉均易感染發(fā)病，感染鵪鶉常表現(xiàn)為精神萎頓、羽松翅垂、閉眼昏睡、站立不穩(wěn)、食欲不振或廢絕、飲水增加、腹瀉下痢甚至死亡，同時對產(chǎn)蛋率及蛋的品質影響很大，給鵪鶉養(yǎng)殖帶來巨大的經(jīng)濟損失。大腸桿菌在環(huán)境中常在，且絕大多數(shù)大腸桿菌不會影響動物的健康，但當機體因各種原因出現(xiàn)免疫力下降和應激等情況下，大腸桿菌就會成為影響動物健康的“罪魁禍首”。在經(jīng)詢問病史、臨床癥狀觀察及剖檢檢查后，初步確定發(fā)病原因為大腸桿菌感染。因此，采集病死雞肝臟進行細菌的病原學檢測，分離物在特定培養(yǎng)基上的菌落特點及革蘭染色結果符合大腸桿菌的特征。常規(guī)的細菌鑒定方法可通過生化試驗來確證，為實現(xiàn)疾病的及時診斷，采用微生物MALDI-TOF質譜儀進行了細菌的快速鑒定。微生物MALDI-TOF質譜儀檢測方法具有操作簡單、快速、通量高、靈敏度高、準確度好的優(yōu)點[6]，在本次診斷中，將質譜儀檢測運用到大腸桿菌的鑒定中，快速獲得了陽性結果，為疾病的控制贏得了時間。通過剖檢變化、細菌分離鑒定，特別是質譜快速測定，該鵪鶉場產(chǎn)蛋鵪鶉大量死亡的原因可判定為致病性大腸桿菌的感染導致。建議飼養(yǎng)場加強飼養(yǎng)管理，保持籠舍干燥通風，定期進行消毒，同時減少對動物的應激。

目前治療鵪鶉大腸桿菌病的常用方法為使用抗生素，但隨著抗生素在鵪鶉養(yǎng)殖中的廣泛應用，大腸桿菌對常用抗生素的耐藥性日益增強，本試驗對分離到的大腸桿菌做了藥物敏感性測定。結果顯示分離株只對阿米卡星敏感，對其他11種抗生素均耐藥，因此建議該飼養(yǎng)場可選擇阿米卡星進行治療。

4 結論

本文利用臨床診斷、細菌分離鑒定，特別是質譜快速測定方法，對發(fā)病產(chǎn)蛋鵪鶉的病原做了快速檢測，并分析了大腸桿菌分離菌株的藥物敏感性，為鵪鶉大腸桿菌病的及時防治提供了借鑒與參考。