原發性肝癌根治術后惡性胸腹水患者T淋巴細胞及NK細胞水平觀察

李姣姣 趙永昌 武軍霞

原發性肝癌發病率在世界各國常見惡性腫瘤中位居前列,同時原發性肝癌也是癌癥死亡的第2大原因[1]。外科治療如射頻消融術、肝癌根治術等是原發性肝癌患者延長生存時間的重要方法,隨著精準肝切除技術的發展和應用,護理水平的提高,肝癌根治術的價值越來越受到重視[2-3]。惡性胸腹水是肝癌切除術后的常見并發癥,胸腹水不僅增加患者的痛苦、影響患者的康復,嚴重時還可能引起呼吸衰竭、肺部感染甚至威脅患者生命,并增加其經濟負擔[4-5]。目前國內有關惡性胸腹水的研究較少,但有報道指出惡性胸腹水患者存在明顯的免疫抑制,自然殺傷(Natural killer, NK)細胞具有識別和清除變異細胞的作用,可用于腫瘤監視[6-7]。本研究納入100例原發性肝癌根治術后胸腹水患者,觀察胸腹水T淋巴細胞及NK細胞水平并探究其臨床意義。

資料與方法

一、一般資料

陜西省榆林市第二醫院收治的100例原發性肝癌根治術后胸腹水患者,納入時間2019年3月—2022年3月,男性58例、女性42例;年齡34～58歲,平均(44.1±8.8)歲。患者均符合原發性肝癌相關診斷標準[8]。排除標準:①合并嚴重心、腎等器官功能障礙;②合并神經、免疫及血液系統疾病;③預計生存時間不足3個月;④妊娠或哺乳期婦女;⑤凝血功能障礙。胸腹水標本經細胞學檢查檢出惡性腫瘤細胞,穿刺活檢或手術病理學診斷為惡性腫瘤,符合其中任意一條則診斷為惡性胸腹水,不符合任意一條則診斷為非惡性胸腹水,根據胸腹水良惡性將患者分為惡性組(24例)和非惡性組(76例)?；颊呒凹覍僦橥?研究獲得本院倫理委員會批準(2019-23號)。

二、指標檢測

采集患者胸腹水5 mL,將其置于肝素抗凝管中保存,上下顛倒使之混合均勻,之后在30 min內處理標本。另取一支流式管,分別向其中加入CD3、CD4、CD8(鼠抗人單克隆抗體,均購自上海信裕伊赫生物科技有限公司),各10 μL,已經過熒光素標記,之后取胸腹水標本700 μL加入流式管中,混合均勻后,在避光、室溫環境下孵育1 h。對肝素抗凝管中余下的胸腹水進行離心處理。將紅細胞裂解液和三蒸水以1∶9的比例進行配制,將配置完成的紅細胞裂解液1000 μL加入流式管中,10 min混勻,離心后去上清液,將管口吸干。向流式管中加入PBS緩沖液3 mL,混合均勻后在室溫環境下離心處理,離心后去上清液,將管口吸干。最后將300 μL PBS緩沖液加入流式管中,立即送檢,使用貝克曼FC500流式細胞儀檢測胸腹水CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+表達。收集胸腹水單個核細胞于1.5 mL滅菌EP管中,離心后去上清,加入培養基、重懸,之后依次進行細胞培養、收獲、質控,并檢測NK細胞表達。

三、統計學分析

結 果

一、兩組T淋巴細胞亞群與NK細胞水平比較

與非惡性組相比,惡性組CD3+、CD3+CD4+、NK細胞水平較低,CD3+CD8+細胞水平較高(P<0.05),見表1。原發性肝癌根治術后惡性胸腹水、非惡性胸腹水CT圖像見圖1。

A:原發性肝癌根治術后惡性胸腹水CT圖像,B:原發性肝癌根治術后非惡性胸腹水CT圖像

表1 兩組T淋巴細胞亞群與NK細胞水平(±s)比較

二、CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、NK細胞水平診斷原發性肝癌根治術后惡性胸腹水的ROC分析

經ROC分析,CD3+≤69.2%、CD3+CD4+≤70.8%、CD3+CD8+≥31.5%、NK≤22.1%是原發性肝癌根治術后惡性胸腹水的最佳截斷值(P<0.05,表2);CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、NK細胞水平診斷原發性肝癌根治術后惡性胸腹水的ROC曲線見圖2。

圖2 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、NK細胞水平診斷原發性肝癌根治術后惡性胸腹水的ROC曲線

表2 CD3+、CD3+CD8+、NK細胞水平診斷原發性肝癌根治術后惡性胸腹水的ROC分析

三、原發性肝癌根治術后惡性胸腹水風險與T淋巴細胞亞群及NK細胞水平的相關性分析

原發性肝癌根治術后惡性胸腹水風險與CD3+、CD3+CD4+、NK細胞水平成負相關(r=-0.625、r=-0.517、r=-0.573,P<0.05),與CD3+CD8+水平呈正相關(r=0.582,P<0.05)。

討 論

作為惡性腫瘤的一種常見并發癥,惡性胸腹水也是許多中晚期癌癥患者的常見臨床表現,也是惡性腫瘤遠處轉移的常見表現[9-11]。T淋巴細胞和NK細胞是機體天然免疫系統的重要細胞,在機體識別和清除腫瘤細胞方面具有重要作用,胸腹水中通常聚集了大量淋巴細胞,主要為CD4+T細胞亞群,而NK細胞也參與了胸腹水的發生和發展[12-13]。

本研究結果顯示,與非惡性組相比,惡性組CD3+、CD3+CD4+、NK細胞水平較低,CD3+CD8+細胞水平較高,提示與非惡性胸腹水患者相比,惡性胸腹水患者存在嚴重T淋巴細亞群失調。T淋巴細胞在機體免疫應答的負調節和患者自身免疫耐受中具有關鍵作用[14]。T淋巴細胞亞群中CD4+、CD8+在抗腫瘤免疫中具有不同的作用。CD4+能夠同時誘發自身免疫、產生腫瘤免疫。CD8+具有殺傷作用,直接接觸到腫瘤細胞后,CD8+能夠釋放細胞毒性物質,如顆粒酶、穿孔素等,這些毒性物質可作用于靶細胞使之發生溶解,CD8+釋放的細胞因子還能在一定程度上誘導靶細胞凋亡[15]。惡性胸腹水是其他部位腫瘤向胸腹膜轉移或腫瘤直接侵襲胸腹膜造成,胸腹水中通常存在大量CD4+細胞,輔助T淋巴細胞1(Helper T lymphocyte 1, Th1)的抗腫瘤免疫作用主要是通過大量釋放γ干擾素(Interferon-γ, IFN-γ)實現的[16]。研究顯示[17],與結核性胸腹水相比,惡性胸腹水中IFN-γ的表達水平顯著較低,結核性胸腹水微環境的免疫應答接近Th1類淋巴細胞,有利于清除病原菌。與之相比,惡性胸腹水患者雖然受到腫瘤相關炎癥的影響也存在CD4+細胞聚集情況,但更傾向于Th2類,未能充分發揮CD4+細胞的免疫功能,為腫瘤細胞的侵襲和逃避免疫識別創造了條件。

NK細胞在過去的研究中多被用于各種肝細胞癌、肝炎的診斷和鑒別,能用于反映患者的細胞免疫平衡狀態。此外,作為一種廣譜殺傷性細胞,NK細胞具有識別并清除變異細胞的作用,但許多研究顯示[18-19],原發性肝癌等腫瘤患者機體中的NK細胞功能多處于受損狀態,因此NK細胞的功能減弱多被認為是腫瘤發生和進展的原因之一。NK細胞中CD56dimNK亞群是發揮細胞毒性功能的主體,本研究中惡性胸腹水的NK細胞比例低于非惡性胸腹水,其原因可能為CD56dimNK亞群的比例降低,并且CD56dimNK亞群比例降低也是惡性胸腹水患者免疫功能減弱的原因之一。

綜上,原發性肝癌根治術后惡性胸腹水患者存在明顯的免疫功能低下,主要表現為CD3+、CD3+CD4+、NK細胞比例的下調和CD3+CD8+細胞比例的上調,原發性肝癌患者發生惡性胸腹水的風險越高,此外與非惡性胸腹水相比,惡性胸腹水免疫功能紊亂更嚴重,臨床可參考以上指標對惡性胸腹水進行篩查。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。