液相色譜串聯質譜法測定牛奶中黃體酮殘留量的不確定度分析

鄭雪雪 王淑霞 黃鵬 張輝 唐文杰 周叢

摘 要：本文采用液相色譜串聯質譜法對牛奶中黃體酮殘留量進行分析測定。結果表明，當牛奶中黃體酮殘留量測定含量為6.93 μg·kg-1時，其擴展不確定度達到1.82 μg·kg-1（k=2）。該方法的不確定度主要來自校準過程產生的不確定度，可對相關計量器具進行檢定以改善。

關鍵詞：黃體酮；液相色譜串聯質譜；牛奶；不確定度

Abstract： This article uses a liquid chromatography tandem mass spectrometry method to determine the residual amount of progesterone in milk. The results showed that when the content of progesterone residue in milk was?6.93 μg·kg-1， the expanded uncertainty reached 1.82 μg·kg-1（k=2）. The uncertainty of this method mainly comes from the uncertainty generated during the calibration process， and relevant measuring instruments can be verified to improve the accuracy

Keywords： progesterone; liquid chromatography tandem mass spectrometry; milk; uncertainty

黃體酮是由雌性的卵巢黃體分泌，是一種孕激素。為保障生育所需要，黃體酮在生物體內對維護子宮內膜正常功能發揮著重要作用，在生理臨床治療中應用廣泛[1-2]。研究表明，長期食用含孕激素的食品，易造成內分泌紊亂，損害生殖器官，增加子宮內膜發生病變及患上乳腺腫瘤的風險[3-4]。牛奶作為廣受人們歡迎的消費品，其膳食攝入占比較大，由此帶來的風險不容忽視，因此合理、準確地評估乳制品黃體酮殘留量顯得尤為必要，而合理準確的評估就需要對其測量不確定度的大小進行評價。

目前，黃體酮檢測分析一般采用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）、高效液相色譜-質譜聯用（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）等方法[5-7]。其中，高效液相色譜-質譜聯用法憑借其高度靈敏性以及高準確度而被廣泛用于各類樣品中黃體酮的測定[8-9]。但關于采用液相色譜質譜聯用法測定牛奶中黃體酮的殘留量的不確定性評價方法鮮見。本文參照《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[10]、《化學分析中不確定度的評估指南》（CNAS—GL006： 2019）[11]以及農業部1031號公告-1-2008《動物源性食品中11種激素殘留檢測 液相色譜-串聯質譜法》[12]等，對牛奶中黃體酮殘留含量測量的不確定度進行評估，希望對評估檢測結果的準確性提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛奶樣品，淘寶網購買。

黃體酮標準品（壇墨質檢標準物質中心）；氘代睪酮（壇墨質檢標準物質中心）；乙腈（色譜純，美國tedia公司）；甲酸（色譜純，美國Supelco公司）；甲醇（色譜純，美國tedia公司）；甲醚（色譜純，上海安譜公司）。

1.2 儀器與設備

高效液相質譜聯用儀，賽默飛（中國）有限公司；TG16-WS型臺式離心機，cence湘儀；電子分析天平，美國新澤西的奧豪斯公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

參照農業部1031號公告-1-2008《動物源性食品中11種激素殘留檢測 液相色譜-串聯質譜法》進行樣品前處理操作。準確稱取實驗樣品5.0 g，放入50 mL離心管中，準確加入10 ng氘代睪酮內標，用5 mL水稀釋樣品，加入10% Na2CO3溶液3 mL與甲基叔丁基醚25 mL，振蕩提取10 min，離心，取上層，殘渣重復提取1次。合并兩次提取液，40 ℃下氮吹至近干，加入1 mL乙腈水（體積比V/V=1∶1）溶液將殘渣溶解，快速渦旋混勻后，轉移至離心管中，冷凍離心后，取上清液過0.22 μm的有機濾膜，用于HPLC-MS/MS測定。樣品空白按同方法處理。

1.3.2 標準曲線配制

準確稱取黃體酮標準物質10 mg裝入至100 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容，得到黃體酮標準儲備液，其濃度為100 μg·mL-1。再準確移取1.0 mL標準儲備液于100 mL容量瓶中，同時采用甲醇稀釋并定容，得到黃體酮標準中間溶液，其濃度為1 μg·mL-1，再分別準確移取不同體積的標準中間溶液，加入10 ng氘代睪酮內標，得到濃度為2.0 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、20.0 μg·L-1和50.0 μg·L-1，內標濃度為100 μg·L-1的黃體酮系列標準工作溶液。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18（100 mm×2.1 m×3 μm）；樣品進樣量：10 μL；流速：0.4 mL·min-1；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；流動相梯度洗脫程序見表1。

1.3.4 質譜條件

電噴霧離子源；多反應監測；正離子掃描；被測物監測離子見表2。

2 結果與分析

2.1 數學模型的建立

測定牛奶中黃體酮殘留量的數學模型為

式中：X為試樣中黃體酮濃度，μg·kg-1；c為試樣溶液含量，μg·L-1；V為試樣定容體積，mL；m為稱樣量，g；fr為回收率校正因子；fQ為儀器定量校準影響因子。

2.2 不確定度來源分析

針對HPLC-MS/MS法檢測牛奶中黃體酮含量的分析過程進行分析，可以判斷出該實驗中各分量不確定度的主要來源為校準過程、測量重復性以及回收率等。

2.3 各分量不確定度的計量

2.3.1 校準過程產生的相對標準不確定度ulrel（b）

（1）黃體酮標準儲備液產生的不確定度分量包括以下內容。①準確稱取質量為10 mg的黃體酮標準物質于100 mL容量瓶中，加入甲醇溶解后，定容。由黃體酮標準品純度所帶來的不確定度，記為u（p）。由標準物質證書可知，黃體酮純度為99.0%±0.5%，其中，偏差為±0.5%，按照均勻分布方法計算，由純度所產生的相對不確定度為

②根據電子天平檢定合格證書，天平允許偏差為±0.1 mg，按均勻分布方法計算，由標準品稱量所帶來的不確定度與相對標準不確定度依次為

③A級單標線的100 mL容量瓶（V1）體積容差為±0.1 mL，據矩形分布計算，其帶入的不確定度為

實驗室的溫度在（20±5）℃波動，溫度的不斷變化隨之會引起體積的變化，呈現出均勻分布，其中k=，甲醇體積膨脹系數為1.19×10-3/℃，故可計算出容量瓶（100 mL）因溫度變化引起的體積不確定度為

容量瓶（100 mL）定容體積引入的合成相對不確定度為

（2）標準溶液配制過程因容量瓶所引入的不確定度u（VL）。①依據《常用玻璃量器檢定規程》（JJG 196—2006）中[13]所要求的，當溫度為20 ℃時，A級單標線容量瓶（100 mL）體積容差為±0.10 mL，10 mL A級單標線容量瓶體積容差為±0.02 mL，按矩形分布，則容量瓶本身引入的相對標準不確定度分別為

②溫度波動引起的容量瓶體積變化。溫度波動范圍為（20±5）℃，呈均勻分布，k=，50%乙腈水溶液體積膨脹系數為1.37×10-3/℃，故溫度波動引起的容量瓶體積變化引入的不確定度為

100 mL容量瓶和10 mL容量瓶所引入的相對標準不確定度分別為

則100 mL容量瓶和10 mL容量瓶體積的合成相對標準不確定度為

（3）移液器引入的相對標準不確定度urel（Vq）。按照《移液器檢定規程》（JJG 646—2006）的要求[14]，100 μL移液器中20 μL刻度處、50 μL刻度處、100 μL刻度處的檢定體積的容量允許誤差依次是±8.00%、±3.00%、±2.00%，1 000 μL的移液器中200 μL刻度處、500 μL刻度處測定點的容量允許誤差依次是±2.00%、±1.00%。依據矩形分布，k=，則采用不同體積規格的移液器移取不同體積溶液所引入的相對不確定度urel（Vqi）為

式中：Vi為不同移液點所對應的體積，μL；ti為容量所允許的誤差；Vq為移液器體積規格，即所允許量取溶液的最大體積，μL。

移液器所引入的具體參數（含數值）以及所計算出的相對不確定度結果匯總見表3。

則移液器引入的合成相對標準不確定度為

綜合上述，標準物質配制過程所引入的合成不確定度為

（4）擬合校準工作曲線所帶來的相對標準不確定度urel（c0）。分別移取表3中5種不同濃度的標準溶液供HPLC-MS/MS進行分析，檢測結果見表4。

采用最小二乘法原理擬合出曲線方程為

Ai=0.073 225 6cj+0.020 90，R2=0.999 9。采用該曲線方程對試樣溶液進行3次平行測定，最后根據直線方程得到的試樣溶液中黃體酮含量為c0=6.93 ng·mL-1，則黃體酮含量c0引入的不確度為

式中：S（A）為標準曲線所引入的標準偏差；

N為標準溶液所對應的平行測定次數，N=9；P為試樣溶液的測定次數，P=3；a為標準校準曲線的截距；b為標準曲線所對應的斜率；c0為由標準曲線方程計算得出試樣溶液中黃體酮的濃度，μg·L-1；c為各標準工作溶液濃度配制濃度所計算出來的算術平均值，μg·L-1；ci為各校準標準工作溶液的濃度點的配制值，μg·L-1；cj為由線性方程所計算得出的標準溶液測定值，μg·L-1；Ai為單次標準工作溶液的響應值。

則擬合校準工作曲線所帶來的相對標準不確定度為

則校準過程產生的合成相對標準不確定度為

2.3.2 測量重復性產生的相對不確定度urel（X）

稱取7份陰性牛奶樣品（不含黃體酮）進行加標回收試驗，加標量均為10.00 μg·kg-1，測定結果見表5。黃體酮的平均含量為X=9.50 μg·kg-1，標準偏差

S（X ）=0.245 μg·kg-1，故重復實驗所帶來的不確定度以及相對不確定度分別為

2.3.3 回收率產生的相對不確定度urel（R）

由表5計算出牛奶中黃體酮的回收率的標準偏差為S（R）=2.445%，按A類不確定評定，回收率所帶入的不確定度與相對不確定度分別為

2.3.4 實驗過程稱量樣品所帶來的相對不確定度urel（m）

準確稱取5 g奶粉試樣，所使用電子分析天平的允許誤差為±0.01 g，按矩形分布進行計算，其標準不確定度和相對標準不確定度依次為

2.3.5 樣品定量體積所帶來的相對不確定度urel（Vy）

按《移液器檢定規程》（JJG 646—2006）[14]所明示的要求，當實驗室溫度處于20 ℃時，1 mL移液器所對應容量允許誤差為±1.0%，按矩形分布計算可得移液器容量引入的不確定度為

實驗室溫度處于（20±5） ℃內，一般來說，溫度的改變同時伴隨著體積的變化，并且呈現出均勻分布，其中k=，50%乙腈水溶液所對應的體積膨脹系數為1.37×10-3/℃，故因溫度變化所引入的不確定度為

樣品在定量分析時，由樣品定量體積所帶來的相對不確定度為

2.3.6 HPLC-MS/MS校準引入的相對不確定度urel（Q）

根據儀器校準證書，儀器的不確定度u=5%，取均勻分布（k=），則儀器校準引入的相對標準不確定度為

2.4 合成相對標準不確定度ucrel（X）

對于黃體酮不確定度的貢獻大部分來自校準過程產生的不確定度與液相色譜串聯質譜儀校準帶入的不確定度。

則黃體酮測定過程引入的合成相對標準不確定度為

當樣品中黃體酮的含量為6.93 μg·kg-1，則黃體酮含量測定不確定度為

2.5 擴展不確定度及測定結果

按照《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）中所規定[10]，取置信區間P=95%（k=2），把2.4中所求的合成不確定度與包含因子二者進行相乘從而得到測量結果的擴展不確定度U=uc（X）×k=0.908×2=1.82 μg·kg-1。故采用HPLC-MS/MS測定牛奶中黃體酮的含量結果報告表示為（6.93±1.82）μg·kg-1，k=2。

3 結論

本文利用HPLC-MS/MS對牛奶中黃體酮殘留量進行檢測，結果表明其不確定度主要來自校準過程產生的不確定度，其次為液相色譜串聯質譜儀校準帶入的不確定度、測量重復性及加標回收率。因此，試驗過程中可通過提升檢驗技術人員的作業技術水平和完善試驗儀器設備的維修保養等來降低測量不確定度，保障檢測結果的準確性。

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