一株雞源致病性大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性檢測

陶宏衛，杜榮雪，郭廣富，練國俊

（1.江蘇農牧科技職業學院動物醫學院，江蘇泰州 225300；2.晟寵國際動物醫院，北京朝陽 100020）

大腸埃希菌（E.coli）俗稱大腸桿菌，為埃希菌屬的代表菌。 大腸桿菌在腸道菌鑒別培養基，如麥康凱瓊脂培養基上生長，因發酵乳糖產酸，使指示劑變紅，形成紅色菌落。 大腸桿菌對多種消毒藥敏感，對各種廣譜抗菌藥也敏感，但易產生耐藥性。 多數大腸桿菌為人和動物腸道內的正常菌群成員之一，少數為致病性細菌。 致病性大腸桿菌對動物具有致病性， 能引發人和動物的敗血癥、腹瀉、肺炎、心內膜炎、泌尿道感染、幼畜或幼兒腹膜炎、腦炎等。 筆者在學校獸醫實驗室分離鑒定了一株致病性雞源大腸桿菌，并進行耐藥性檢測，現予以介紹。

1 材料與方法

1.1 材料

普通營養肉湯、 伊紅美藍瓊脂和藥敏試驗的藥敏紙片中的環丙沙星均購自于杭州天和微生物試劑有限公司； 營養瓊脂和藥敏試驗的藥敏紙片中的青霉素G、 氨芐西林、頭孢曲松、頭孢唑啉、頭孢噻肟、林可霉素、慶大霉素、四環素、強力霉素（多西環素）、紅霉素、多黏菌素B、復方新諾明均購自于杭州濱和微生物試劑有限公司；麥康凱瓊脂、氧化酶試驗試劑、生化試驗腸桿菌科細菌生化鑒定管（11 種×10 支）和其配套試劑（補充試劑）、藥敏試驗的藥敏紙片中的阿莫西林、鏈霉素均購自于杭州微生物試劑有限公司。 試驗動物選用的健康小白鼠由江蘇農牧科技職業學院實驗動物房提供； 病料來自于泰州某雞場一病死雞的肝臟。

1.2 方法

1.2.1 培養基制備及細菌分離

按說明書完成麥康凱培養基、 營養瓊脂培養基、營養肉湯及伊紅美藍培養基的制備。 用滅菌的接種環取病料， 采用三線分區畫法接種于麥康凱瓊脂培養基上， 倒置于37℃恒溫箱中培養24 小時后取符合大腸桿菌培養特性的紅色菌落，接種營養瓊脂培養基予以純培養。

1.2.2 染色及生化試驗

1.2.2.1 革蘭染色

采集菌落， 制備細菌標本片， 進行革蘭染色。 染色方法：（1）初染：草酸銨結晶紫，1～3 分鐘，水洗；（2）媒染：革蘭氏碘液，1～3 分鐘，水洗；（3）脫色：95%酒精，30 秒，水洗；（4）復染：復紅染液，1～3 分鐘，水洗，顯微鏡油鏡觀察。

1.2.2.2 氧化酶試驗

將析濾紙剪成三角形，沾取菌落后，滴加一滴氧化酶試驗試劑，10 秒后觀察結果。

1.2.2.3 腸桿菌科細菌生化鑒定管試驗

將生化試驗腸桿菌科細菌生化鑒定管（11種×10 支）和其配套試劑（補充試劑）、37℃恒溫箱已培養24 小時的營養瓊脂培養基和接種針等置于超凈臺。 將腸桿菌科細菌生化鑒定管用磨砂輪打開，接種針滅菌后，打開營養瓊脂培養基沾取菌落，接種于鑒定管中，接種完成后，將鑒定管整齊放在滅菌后平皿中，37℃恒溫箱24小時后觀察結果。

1.2.3 動物致病性試驗

取營養瓊脂純培養物接種到營養肉湯中，37℃培養18 小時后接種小白鼠， 腹腔注射0.2毫升/只；對照組予以腹腔注射無菌生理鹽水，劑量相同。 在12～36 小時內觀察對照組和實驗組小白鼠的發病情況。 若有小白鼠發病或死亡，則解剖取其肝臟， 接種于伊紅美藍培養基進行菌種回收試驗，其培養出菌落的特性、形態和染色反應都符合大腸桿菌時， 判定為致病性大腸桿菌。

1.2.4 藥敏試驗

先在玻璃板背后標上數字， 將菌液接種到培養基上，均勻涂開后，按對應數字用小鑷子夾出藥敏試驗紙片貼與培養基上， 貼完后放置于37℃恒溫箱中培養24 小時后觀察結果。

2 結果

2.1 細菌分離

37℃恒溫箱中培養24 小時后， 在麥康凱培養基上可見符合大腸桿菌培養特性的紅色菌落（見圖1）。

圖1 麥康凱培養基分離結果

2.2 染色及生化試驗

2.2.1 革蘭氏染色

將分離菌株進行涂片、 革蘭氏染色及油鏡觀察，結果顯示革蘭陰性中等大小的桿菌。

2.2.2 氧化酶試驗

由圖2 可看出， 氧化酶試驗的結果呈現陽性。

圖2 氧化酶試驗試劑結果

2.2.3 腸桿菌科生化鑒定

分離菌株接種腸桿菌科細菌生化鑒定管，獲得該菌株生化鑒定結果（見表），編號為A632，在編碼鑒定表中查到答案為：大腸埃希氏菌。

2.3 動物致病性試驗

大腸桿菌分離株肉湯培養物腹腔接種小白鼠后，在24 小時左右發病死亡。 剖檢死亡小白鼠， 取其臟器， 用伊紅美藍培養基進行細菌分離， 結果培養基上呈現黑色、 有金屬光澤的菌落，符合大腸桿菌生物學特性的菌落，革蘭氏染色結果也一致。

根據以上試驗的結果， 判定為該分離菌為雞源致病性大腸桿菌。

2.4 藥敏試驗

根據CLSI 標準, 對抑菌圈直徑按照 “耐藥”、“敏感”、“中度”的判斷。 藥敏結果的判定標準：＜10 毫米為低度敏感，10～20 毫米為中度敏感，＞20 毫米為高度敏感。 結果顯示分離菌株對多種抗生素均有不同程度的耐藥， 其中對頭孢噻肟高度敏感，對慶大霉素、頭孢曲松和多粘菌素B 均中度敏感， 對其他藥物呈現低度敏感或者無敏感性。

3 分析與討論

麥康凱培養基或伊紅美藍平板培養基在實驗室常用于大腸桿菌的分離。 本次試驗首先使用麥康凱培養基從病死雞的肝臟中分離到符合大腸桿菌生長特性及形態染色特點的細菌，然后借助生化試驗完成大腸桿菌的鑒定。 對致病性試驗發病的小白鼠取肝臟， 接種于伊紅美藍平板培養基進行菌種回收試驗， 獲得了較好結果。

當前家禽養殖業大腸桿菌存在一定程度的耐藥情況。 林安等報道，某鴨場分離的大腸桿菌呈四重耐藥；劉萍等報道，某雞場分離的大腸桿菌對氨芐青霉素、四環素和氧氟沙星等10 種以上藥物具有耐藥；白茹等報道，一雞群大腸桿桿菌分離株對大部分藥物的敏感性較低， 表現為多重耐藥。 本次試驗對分離到大腸桿菌菌株進行14 種藥物的藥敏試驗，結果：對青霉素G、氨芐西林、 阿莫西林等7 種藥物耐藥， 且對四環素、 頭孢曲松、 慶大霉素等6 種藥物敏感度很低，僅對頭孢噻肟高度敏感。 這可能與臨床上藥物使用種類繁多、藥物濫用等因素有關。

分離菌株的生化試驗結果

從整體來看， 大腸桿菌的多重耐藥性十分嚴重，有實驗證明，飼養場內多重耐藥的大腸桿菌在人體與動物之間傳播， 有擴散的現象。 因此，建議臨床上使用抗生素時，采用聯合用藥、輪換用藥和科學給藥等措施， 降低耐藥性的產生。 另外，根據藥敏試驗的結果，合理選擇藥物，有利于獲得良好的治療或預防效果， 也避免因使用耐藥性的抗生素而增加養殖的成本。 根據結果選擇抗菌性高的藥物， 嚴格控制藥物劑量和使用時間， 也能在一定程度上減少細菌耐藥性的產生。