組織特異性基因敲除小鼠生產的動物遺傳學綜合實驗設計

熊 燕， 熊顯榮， 李志雄， 付 偉， 王 利， 林亞秋

（西南民族大學畜牧獸醫學院，成都 610041）

0 引言

在“雙一流”高等教育背景下，學生對課程知識的掌握程度只是評價教學質量好壞的標準之一，學生的應用能力和創新思維培養才是關鍵［1］。實驗教學是理工農醫等學科專業課教學必不可少的實踐環節［2］。高質量的實驗教學不僅要實現對理論教學內容的內化，而且更要注重學生實踐能力、創新能力及解決復雜問題綜合能力的培養［3］。目前動物遺傳學課程實驗教學主要以“教師演示+學生照做”的教學模式進行授課［4-5］。教師提前準備好實驗相關試劑耗材；按照實驗指導書給學生進行講解和指導，缺乏多元化和現代化教學手段，學生的參與度有限，較難提高學生對實驗的興趣和主動性。隨著信息技術的快速發展，針對上述實驗教學中的普遍存在的問題，融合線上線下的教學平臺［6］，教學設計體現學生的主體地位，采用混合式教學模式將極大提高學生的參與度和積極性。

高等教育教學活動和科學研究相輔相成，2019 年教育部發布《關于深化本科教育教學改革全面提升人才培養質量的意見》，鼓勵教師將最新科研成果轉化為教學內容［7-8］。可見高校科研與教學相結合進行創新人才培養是時代的需要，也是高校堅持“以本為本”的體現，同時亦是提高實驗教學水平的有效途徑［9］。本教學團隊成員長期圍繞組蛋白去甲基化酶KDM2A基因探索其在胚胎發育、骨骼肌生長和脂肪沉積中的生物學功能［10］，構建了KDM2Aflox／-基因編輯小鼠，保存有卵母細胞［11］、骨骼肌（Pax7）［12］和脂肪組織（Adipoq）特異表達基因啟動子介導Cre 表達的工具鼠［13］。以教研團隊的基因編輯小鼠（KDM2Aflox／-）和Adipoq-Cre工具鼠科為材料，通過設計3 代雜交實驗方案，提取小鼠基因組DNA，采用PCR 技術檢測KDM2A和Cre 的基因型，旨在獲得脂肪組織特異的KDM2A基因敲除小鼠。該實驗教學設計采用線上線下混合的模式，融入經典遺傳學與本學科前沿知識與技能，具有綜合性、設計性、研究性及趣味性的特點；教學設計以學生為中心，充分提高學生的參與度及主動性，真正培養了學生實踐能力、創新能力及解決復雜問題的綜合能力。

1 實驗教學設計

隨著基因編輯技術的快速發展及應用優勢的不斷突顯，該技術已加入最新版《動物遺傳學》教材中，在生物技術其他相關課程作為獨立章節進行介紹。在動物生產中，研究者利用該技術制備了基因編輯豬、羊等家畜動物，在生物醫學和動物分子育種領域取得了重大突破［14］。因此緊密結合學科發展前沿及產業需求，本實驗教學設計了基于基因編輯技術及檢測手段的綜合實驗（見圖1），實驗內容豐富、新穎有趣；在教學方式上，融合線上和線下實踐平臺，在課前、實踐課堂和課后多個維度調動學生的積極性及參與度。

圖1 KDM2A基因脂肪組織特異敲除小鼠獲得及基因型鑒定實驗教學設計

1.1 課前學習

通過小規模專有在線課程（Small Private Online Course，SPOC）平臺學習基因編輯、Cre-Loxp 等實驗相關前沿技術原理、熟悉實驗操作手冊、發布獲得脂肪組織特異KDM2A敲除小鼠的任務，引導學生利用KDM2Aflox／-和Adipoq-Cre 小鼠設計雜交原理獲得Adipoq-Cre+-KDM2Aflox／flox小鼠的實驗方案，滿足學生的個性化學習的需求［15］；小鼠雜交實驗操作相對簡單，但整個周期較長，鑒于本教學團隊在科研項目實施過程中已獲得F3 代的小鼠，教師僅需課前準備F3 代小鼠即可。

1.2 課堂學習

首先實驗小組以PPT形式匯報小鼠雜交方案，學生互動，教師給予點評指導，優化實驗方案，以期快速高效、最低成本獲得脂肪組織特異KDM2A 基因敲除小鼠；然后教師解析小鼠DNA純化及基因型分型關鍵步驟，并強調注意事項；學生正式開始實驗，教師及時指導學生的實驗過程，并做好學生實踐情況的詳細記錄，作為實驗成績的評價指標之一。

1.3 課后學習

學生完成實驗后，分析實驗數據并按要求撰寫實驗報告；將實驗報告上傳至SPOC的作業模塊，每份實驗報告至少由5 位同學進行互評，系統自動去掉最高分與最低分，獲得平均分；教師根據實驗課的過程記錄、結果討論及分析，對實驗成績進行確認；最后反思整個教學設計及實施過程，線上補充薄弱知識點，進行線上互動和討論。

2 實驗部分

2.1 實驗目的

（1）深入理解基因編輯技術的原理及在動物生產中的應用；

（2）正確設計動物雜交實驗方案，獲得基因敲除動物；

（3）熟練運用PCR 技術對動物進行基因分型及個體鑒定。

2.2 實驗動物、儀器及試劑

實驗動物 KDM2A 基因編輯雜合小鼠（KDM2Aflox／-）和Adipoq-Cre小鼠。

試劑 組織DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）、引物、Rapid Taq PCR Master Mix、瓊脂糖、TAE、核酸染料、DNA Marker等。

儀器組織超聲破碎儀、離心機、水平電泳儀、凝膠成像系統、PCR 儀、超微量紫外分光光度計（NanoPhotometer）。

2.3 KDM2A基因編輯純合小鼠雜交方案設計

根據現有兩個品系小鼠基因型分別為KDM2Aflox／-和Adipoq-Cre小鼠，利用孟德爾的基因分離定律和自由組合定律原理，通過設計3 代的雜交實驗，最后獲得基因型為Adipoq-Cre+-KDM2Aflox／flox，并畫出遺傳圖譜。

2.4 小鼠耳組織基因組DNA純化

小鼠耳組織的DNA 純化按照天根生化科技有限公司（貨號：DP304）的操作手冊進行實驗，關鍵步驟如下：

（1）小鼠耳組織超聲打碎為細胞懸液，然后10000 r／min離心1 min，去上清，加入200 μL 的GA緩沖液，振蕩至徹底懸浮。

（2）加入Proteinase K混勻后，在56 ℃放置，直至組織溶解。

（3）加入200 μL 緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃放置10 min，溶液應變清亮。

（4）加入200 μL 無水乙醇，充分振蕩混勻15 s，此時可能會出現絮狀沉淀。

（5）將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3 中，12000 r／min離心30 s，棄廢液。

（6）向吸附柱CB3 中加入500 μL 緩沖液GD，12000 r／min離心30 s，棄廢液。

（7）向吸附柱CB3 中加入600 μL 漂洗液PW，12000 r／min離心30 s；并重復洗滌一次；棄廢液后，吸附柱室溫放置數分鐘晾干。

（8）將吸附柱CB3 轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50 ～200 μL 洗脫緩沖液TE，室溫放置2 ～5 min，12000 r／min離心2 min，將溶液收集到離心管中。

2.5 基因組DNA的質量檢測

以洗脫緩沖液TE 為空白，用NanoPhotometer 分光光度計測純化DNA溶液的濃度和吸光度值，OD260／OD280比值應該在1.8 ～2.0。超過該范圍意味著DNA樣品中可能存在蛋白質或RNA污染。將DNA質量符合要求的樣品，稀釋到濃度為50 ng／μL。

2.6 KDM2Aflox／flox和Adipoq-Cre基因型PCR檢測

以提取的基因組DNA 為模板，采用KDM2Aflox／flox和Adipoq-Cre的檢測引物（見表1）進行PCR擴增，對KDM2Aflox／flox、KDM2Aflox／-、KDM2A-／-、Adipoq-Cre+和Adipoq-Cre-的基因型進行鑒定。PCR 擴增體系25 μL：2 ×Rapid Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA 3 μL，ddH2O 7.5 μL，PCR反應程序見表2。

表1 基因分型檢測的引物序列

表2 KDM2Aflox／flox和Adipoq-Cre的PCR反應程序

2.7 瓊脂糖凝膠電泳檢測

取10 μL PCR反應的擴增溶液，加入2%的瓊脂糖凝膠（含核酸染料）的點樣孔，設置DNA maker（點樣5 μL）孔，用1 ×TAE 緩沖液進行電泳，120 V 下電泳30 min，電泳結束后利用凝膠成像系統觀察并照相。

3 結果與分析

3.1 雜交方案及遺傳圖譜

利用Cre-Loxp系統獲得脂肪組織特異敲除小鼠，即Cre 重組酶特異識別KDM2A 基因兩側的Loxp 位點，切除KDM2A 基因序列［見圖2（a）］。現有KDM2Aflox／-和Adipoq-Cre 小鼠品系，設計可行的雜交方案，獲得脂肪組織特異的KDM2A敲除小鼠，即基因型為Adipoq-Cre+-KDM2Aflox／flox（見圖3）。如圖2（b）所示，首先選擇KDM2Aflox／-的公母小鼠交配獲得KDM2Aflox／flox純合小鼠（F1 代）；然后將KDM2Aflox／flox純合小鼠與Adipoq-Cre+雜交篩選Adipoq-Cre+-KDM2Aflox／-小鼠（F2 代）；最后將Adipoq-Cre+-KDM2Aflox／-小鼠與KDM2Aflox／flox純合小鼠交配，篩選Adipoq-Cre+-KDM2Aflox／flox小鼠（F3 代）。

圖2 獲得Adipoq-Cre +-KDM2Aflox／flox小鼠的雜交方案

圖3 Adipoq-Cre +-KDM2Aflox／flox為KDM2A脂肪組織特異敲除小鼠

3.2 DNA純化質量檢測

提供20 只F3 代小鼠的耳組織樣品，按照試劑盒操作手冊純化DNA，采用微量分光光度計測定其濃度及純度。首先用洗脫緩沖液TE 校正儀器，吸取1 μL樣品進行測定。如表3 所示DNA 的濃度在50 ng／μL左右，OD260／OD280比值均在1.8 ～2.0 之間，測定峰值為單峰（見圖4），說明提取的DNA質量滿足后續PCR實驗的需求。

表3 DNA樣品濃度及純度檢測

圖4 純化DNA濃度測定結果

3.3 瓊脂糖凝膠電泳圖譜

根據設計引物目的條帶大小，判斷小鼠基因型。針對KDM2A 小鼠的基因型，擴增片段大小僅510 bp為KDM2Aflox／flox，出現510 bp和397 bp 兩條帶為雜合小鼠（KDM2Aflox／-），擴增片段大小僅397 bp為野生型小鼠（KDM2A-／-）。針對Adipoq-Cre 小鼠的基因型，出現410 bp 的條帶，即為Adipoq-Cre+小鼠，否則為Adipoq-Cre-小鼠。如圖5 所示，3、5、10、12、19 號是Adipoq-Cre+-KDM2Aflox／flox小鼠，也是本實驗所需要獲得的脂肪組織KDM2A 基因特異敲除的小鼠。2、9、11、16、17 號是Adipoq-Cre+-KDM2Aflox／-小鼠；1、13、14號為KDM2A 雜合小鼠（KDM2Aflox／-），4、6、7、8、15、18、20 為KDM2A 純合小鼠（KDM2Aflox／flox）。表明通過3 代的雜交實驗可獲得組織組織KDM2A基因特異敲除小鼠，其比例為25%。

圖5 瓊脂糖凝膠檢測小鼠基因分型的結果

4 實驗教學效果

“KDM2A基因脂肪組織特異敲除小鼠生產及基因型鑒定”實驗教學設計及教學過程具有高階性、創新性和挑戰度，充分調動學生的積極性與參與度，提高學生解決復雜問題的綜合能力，培養學生實踐和創新能力。

4.1 “三個維度”調動學生的積極性與參與度

該實驗教學設計在課前、實踐課堂及課后體現了“以學生為中心”的教學理念。課前學習內容緊扣學科發展前沿及行業需求，小鼠雜交方案設計的任務驅動環節具有探究性，提高了學生的主動性及課程的趣味性。實踐課堂教學，小組成員全程參與雜交方案匯報、方案優化研討及實驗操作，教師加強每個小組的過程記錄，及時給予反饋；此外，所提供小鼠的基因型教師亦未知，實驗具有挑戰性與研究性，實驗結果使學生更有獲得感。課后，學生積極參與同學實驗報告的互評及討論交流。以上教學設計與實施充分利用線上線下平臺融合，從多個維度讓學生忙起來，提高學生的參與度。

4.2 提高學生解決復雜問題的綜合能力

該實驗涉及遺傳學的多個經典與前沿知識，包括孟德爾分離定律和自由組合定律、分子遺傳學的基本理論、分子生物學檢測技術、基因編輯技術、Cre-loxp組織特異性基因敲除技術等。實驗本身具有很強的綜合性與設計性，加上檢測小鼠的基因型事先未知，提高實驗的挑戰度與探究性。在整個雜交實驗設計及操作過程中，需要學生有理論聯系實際、化繁為簡、有機整合的工作與學習思路，鍛煉了學生解決復雜問題的綜合能力。

4.3 培養學生實踐與創新能力

該實驗內容源于本教學團隊的科研成果，KDM2Aflox／-基因編輯小鼠由團隊首次構建［16］，實驗內容具有前沿性；在雜交實驗設計環節，每組的設計方案不拘一格，鍛煉了學生的創新思維；課前、課中和課后都有不同形式的討論環節及作業互評，極大地鍛煉學生的辯證與批判思維。

5 結語

“脂肪組織KDM2A 基因特異敲除小鼠獲得及基因型鑒定”的綜合實驗設計，已在動物遺傳學的實驗教學取得較好的教學效果。鑒于該實驗動物為小鼠、實驗內容前沿，實驗具有綜合性、挑戰性及創新性，同樣可作為生物技術、生物工程、醫學等專業遺傳學課程的實驗教學內容進行推廣。此外，本實驗教學設計基于線上線下混合的教學模式，融合線上線下平臺資源，體現學生的主體地位，極大提高學生的主動性及參與度，這種模式為其他實驗課教學提供了借鑒。