刺猬線粒體基因組密碼子偏好性分析

韓 君

（北京康仁堂藥業有限公司，北京 101301）

猬科在我國共有5 個屬7 個種。刺猬一直被用作傳統藥物，具有較高的藥用價值[1-3]。研究表明，刺猬皮膚的刺主要由角蛋白構成，而皮膚下層的真皮主要由彈性蛋白和脂肪等物質構成[4-5]。刺猬肉甘平無毒，具有降逆和胃、涼血止血的作用[6]。猬脂具有止血殺蟲的功效，可用于治療瘰疬、惡瘡等[7]。猬膽則有清熱解毒和明目的作用。除了傳統功效之外，還有人將刺猬用于治療前列腺肥大，且療效顯著[8]。其中，遠東刺猬起源于朝鮮半島，廣泛分布在中國、俄羅斯和朝鮮半島，是一種小型的夜間動物，生活在森林中。

最近研究表明，刺猬皮含有豐富的礦物質元素，其中鉀、鈉和鈣的含量最高。刺猬皮藥用價值與其礦物質元素含量密切相關[9]。不同種類和含量的礦物質元素，對于藥效發揮具有重要意義，但目前仍然缺少分子層面上的研究與驗證。因此，本研究擬以遠東刺猬線粒體mtDNA 編碼蛋白質基因序列為研究對象進行密碼子偏好性分析，以期為預測遠東刺猬未知蛋白的基因所在基因組位置、提高特定基因的表達效率打下理論基礎，同時為促進其藥用價值的分子機制探究提供基礎材料。

1 材 料

本研究所用的遠東刺猬線粒體基因組基因序列，均來源于美國國立生物技術信息中心GenBank數據庫。登錄NCBI 數據庫，并下載完整遠東刺猬線粒體基因組序列及其編碼序列（CDS），序列總長16 941 bp。為了準確分析遠東刺猬線粒體基因密碼子偏好性，本研究選擇遠東刺猬線粒體mtDNA 編碼蛋白質的基因序列中長度大于300 bp的非重復編碼序列（CDS）12條進行研究。

2 方 法

2.1 密碼子偏好參數（CBI）計算

使用CodonW1.4.2軟件和在線程序CUSP（http://imed.Med.ucm.es/EMBOSS/）對所選擇的CDS 進行密碼子使用偏好參數分析[10]，包括相對同義密碼子使用度（RSCU）、有效密碼子數目（ENC）、密碼子適應指數（CAI）、最優密碼子使用頻率（Fop）、氨基酸數（L_aa）、同義氨基酸數（L_sym）、平均親水性值（Gravy）、密碼子偏愛指數（CBI）、GC、GC1、GC2、GC3和GC3s，其中GC、GC1、GC2和GC3的數字表示密碼子的位數（第1、2、3位），GC3s為同義密碼子第3位的GC含量。

2.2 中性分析

通過中性分析，可以初步確定影響密碼子偏好的因素。該分析是通過計算GC1和GC2的平均值（即GC12），將其作為縱坐標，并以GC3作為橫坐標，繪制散點圖。每個點代表1個不同的基因，通過結合中性繪圖的結果來分析密碼子在這3 個位點上的GC 含量之間的關系，從而推斷影響密碼子使用偏好的因素。若密碼子這3 個位點上GC 含量存在內在關系，則表明相關基因在進化與遺傳時受突變作用；若密碼子這3 個位點上的GC 含量之間沒有相關性，那么可以推斷該基因受到選擇的影響，從而判斷導致密碼子使用偏好的因素[11]。

表1 遠東刺猬的線粒體基因組不同位置的GC含量

2.3 ENC-plot繪圖

以GC3s為橫坐標，ENC 為縱坐標，將各基因根據橫縱坐標進行定位繪制散點圖，并在圖中構建ENC 的標準曲線。根據基因相對標準曲線的分布位置，從而判定密碼子偏好性的影響因素。基因位于標準曲線附近或上方，表示突變是影響密碼子偏好性的主要因素；而基因位于標準曲線下方，則表示自然選擇是影響密碼子偏好性的主要因素。

2.4 對應性分析

利用CodonW1.4.2 軟件中的RSCU 對應分析功能，可以對遠東刺猬線粒體基因組密碼子進行分析，推測密碼子偏好性規律。

2.5 最優密碼子的確定

通過按照ENC 參數從大到小對參與分析的基因進行排序，可以將這些基因分成高低偏性兩個集合，分別取兩端各10%的基因序列，然后篩選同義密碼子相對使用度差值（△RSUA）大于0.08 且同義密碼子相對使用度（RSUA）大于1 的密碼子，將其確定為最優密碼子[12]。

3 結果與分析

3.1 密碼子組成分析

本研究共篩選出12 條以ATG 為起始密碼子且長度大于300 bp 的序列，并利用CodonW1.4.2 軟件與CUSP程序對篩選出的12條基因進行分析。結果見表1，顯示遠東刺猬的線粒體基因組密碼子第1位GC（GC1）平均含量為41.4%、第2 位（GC2）為34.4%、第3 位（GC3）為24.3%。結果表明，遠東刺猬線粒體基因密碼子的前2位GC含量明顯高于第3位，而第1 位的GC 含量最高，這表明其偏好于以A 和U 結尾的密碼子。ENC 的范圍為31.83～50.67，平均值為43.37。根據Jiang Y.等[13]的研究，當ENC值大于35 時說明密碼子偏好性弱、小于35 時密碼子偏好性強的標準，說明遠東刺猬線粒體基因密碼子偏好性較弱。

密碼子相關性分析結果見表2，顯示GC1、GC2、GC3與GC之間，均未呈顯著相關，相關系數為分別為-0.018、0.029、0.039，表明對遠東刺猬線粒體基因組而言，GC1、GC2、GC3不可以決定GC的含量。同時，GC1、GC2、GC3三者之間，均呈顯著正相關，相關系數均大于0.98，說明三者含量具有正向的互相影響作用。此外，ENC 與GC1、GC2、GC3、GC 均呈非顯著負相關，這表明GC 含量對密碼子的使用偏好性具有一定的負面影響。

表2 各基因相關參數的相關性分析

RSCU 分析結果見表3，發現遠東刺猬線粒體RSCU值大于1.00的密碼子數目為32個。其中，密碼子第3位堿基為A的有14個；第3位為U的有14個；第3 位為C 的有4 個。綜上說明，遠東刺猬線粒體基因組密碼子偏好以A 或U（T）結尾，不偏好以C或G結尾。

表3 遠東刺猬線粒體各氨基酸相對同義密碼子使用度

3.2 中性繪圖及ENC-plot分析

遠東刺猬線粒體基因中性繪圖分析（見圖1）顯示，GC12的取值范圍為0.336～0.440，GC3的取值范圍為0.216～0.254，所有基因的分布均位于對角線上方，且沒有沿對角線或在對角線附近的分布情況。利用SPSS 25.0 對GC12與GC3進行相關性分析，結果表明，兩者相關系數為0.443，雙尾檢測未達到顯著水平。

圖1 中性繪圖分析

ENC-plot繪圖分析（見圖2）顯示，在遠東刺猬線粒體基因組中，大部分基因的對應點與標準曲線存在不同程度的偏離，這表明這些基因在進化過程中受到了環境選擇壓力等其他因素的影響，從而導致其線粒體基因密碼子的偏性發生了改變。為了更好地顯示這種差異性，可以通過計算（ENCexp-ENCobs）/ENCexp的數值，并對結果進行頻率分布統計。統計結果顯示，所有基因的（ENCexp-ENCobs）/ENCexp 比值集中分布在-0.12～0.26，其中0.05～0.15 區間內所占例為66.67%，這說明雖然選擇壓力對大部分基因產生了作用，但并沒有較大程度地改變這些基因的密碼子偏好性。遠東刺猬線粒體基因密碼子偏好性主要受到突變的影響，而自然選擇對其的影響相對較小。

圖2 ENC-plot繪圖分析

3.3 對應性分析

基于RSCU進行對應性分析，得到各基因在59維向量空間的分布情況。結果表明，第1、2、3、4軸向量所占比例分別為35.64%、16.22%、10.26%和9.13%，前4 軸向量累計占比71.24%，其中第1 向量軸（Axis1）為主要影響因素。進行了各基因的ENC、CAI 及GC3s等偏好性參數與Axis1 之間的相關性分析，結果顯示GC3s（R=0.609）、ENC（R=0.743）與Axis1 呈顯著正相關；CAI（R=-0.375）與Axis1 呈負相關。這說明GC1、GC3s及CAI 對遠東刺猬線粒體基因密碼子的使用偏好性起重要作用。為進一步觀察密碼子偏好性，以Axis1為橫坐標，Axis2為縱坐標，將所有試驗基因分布區于坐標系中。通過觀察結果（見圖3）可知，ND1、ND2、ND3、ND4和ND5等5個基因分布相對集中，說明其偏好性較為接近；其他7 個基因分布較為分散，偏好性也相差較大。

圖3 基于RSCU的對應性分析

3.4 最優密碼子分析

以ENC 參數為標準將所有基因的CDS（是指編碼一段蛋白產物的序列，是與蛋白質密碼子一一對應的序列）進行排序，而后在兩端各取2 個基因序列分別建立高低偏性集合；計算兩庫中的RSCU值，并計算兩庫△RSUA。結果見表4，顯示確定出了24 個遠東刺猬線粒體基因組高表達優越密碼子，其中7個以A結尾、5個以U結尾、2個以G結尾和10個以C結尾。

表4 遠東刺猬線粒體基因組高/低表達樣本組的密碼子用法

通過將上述24 個高表達優越密碼子與得出的高頻密碼子進行比較，最終得出了14 個遠東刺猬線粒體基因組的最優密碼子，分別為CUA、AUA、GUU、UCU、CCC、ACA、GCU、CAU、AAA、GAA、UGA、CGC、GGC 和GGA，其中有7 個以A 結尾、3個以C結尾、4個以U結尾。

4 討 論

密碼子編碼形成氨基酸，是生物體遺傳信息傳遞過程中一個重要環節。同義密碼子是指可以編碼同一種氨基酸的密碼子，由于密碼子具有簡并性，因此對于同一種氨基酸，會存在多個對應的密碼子。通常密碼子的簡并性表現在第3位堿基上，本研究在遠東刺猬線粒體基因組堿基組成中發現，GC1 平均含量為41.4%、GC2為34.4%、GC3為24.3%。RSCU分析結果顯示，RSCU值大于1.00的遠東刺猬線粒體密碼子數目為32個。密碼子第3位堿基為A的有14個，第3位為U的有14個，第3位為C的有4個。綜上說明，遠東刺猬線粒體基因組密碼子偏愛以A 或U（T）結尾，不偏好以C 或G 結尾。這與多數動物的密碼子偏好性特點相一致，如文蛤屬貝類[14]、對蝦[15]和菜蝽[16]等。

物種在長期進化過程中，其基因會隨著進化程度而逐漸形成一種特定密碼子用法，用以適應基因組[17]。密碼子偏性是同義密碼子在生物體中非均衡使用的現象，突變和自然選擇是主要形成密碼子偏好的原因。ENC-plot 分析可用于確定影響密碼子偏好性的主要因素。本研究表明，遠東刺猬線粒體基因組中大部分基因密碼子偏離標準曲線，說明這些基因受環境選擇壓力等其他因素的影響而發生改變。中性繪圖分析顯示，遠東刺猬線粒體基因組中的基因分布在對角線上方，沒有呈現出沿對角線或接近對角線分布的趨勢，這表明密碼子的使用更多受到自然選擇影響。綜合中性繪圖和SPSS結果發現，遠東刺猬線粒體基因密碼子第1、第2位和第3位的堿基組成存在較大差異，可能受到突變壓力影響，從而導致密碼子使用偏好性發生變化。對應性分析結果顯示，第1、2、3和4軸向量所占比例分別為35.64%、16.22%、10.26%和9.13%，前4 軸向量累計占比71.24%，其中Axis1為主要影響因素。因此，遠東刺猬線粒體基因密碼子偏好性受到自然選擇影響，但更多是受到了突變作用，這與真白鮭[18]、落葉松楊柵銹菌[19]、茄腐鐮孢[20]等研究結果一致。

5 結 論

在本研究中，通過構建遠東刺猬線粒體基因的高/低表達庫，并利用△RSCU 和RSCU 的綜合指標來篩選最優密碼子，有效地避免了因單方面缺陷而導致結果出錯的問題。最終確定了CUA、AUA、GUU、UCU、CCC、ACA、GCU、CAU、AAA、GAA、UGA、CGC、GGC 和GGA 等14 個密碼子作為遠東刺猬線粒體基因組最優密碼子。在對遠東刺猬線粒體基因密碼子偏好性研究的基礎上，可以通過優化目標基因的密碼子，探究其皮等組織入藥機制，同時也可為遠東刺猬野生群體的保護策略及養殖群體育種等方面，提供理論依據和實踐指導。