高效液相色譜法測(cè)定飼料中5種磺胺類(lèi)藥物

陳海燕，張慧寧，馬春芳，陳 娟，楊俊華，謝榮國(guó)，楊 奇

（寧夏回族自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所，銀川 750001）

目前有效的抗生素很多，但磺胺類(lèi)藥具有抗菌譜廣、性質(zhì)穩(wěn)定、品種多、價(jià)格低、使用簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[1]，在控制急性泌尿系統(tǒng)感染中有重要價(jià)值。所以在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中常被用作治療動(dòng)物腸道感染等疾病，若以預(yù)防為目的在飼料中長(zhǎng)期添加，會(huì)使致病菌產(chǎn)生耐藥性，磺胺類(lèi)藥物也因此會(huì)殘留在動(dòng)物的肌肉等組織中，影響人的身體健康[2]。磺胺類(lèi)抗生素還可以通過(guò)沉降、吸附等作用蓄積在地表水沉積物中[3]，造成水體污染。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號(hào)公告頒布后，磺胺類(lèi)藥物禁止作為飼料藥物添加劑被使用，其檢測(cè)對(duì)飼料質(zhì)量安全控制十分必要。高效液相色譜檢測(cè)法能夠?qū)︼暳现械幕前奉?lèi)藥物含量進(jìn)行快速檢測(cè)，且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，誤差小，利于相關(guān)人員開(kāi)展飼料中磺胺類(lèi)藥物含量測(cè)定[4]。本研究采用高效液相色譜法，對(duì)飼料中磺胺類(lèi)藥物進(jìn)行測(cè)定，將GB/T 19542—2007[5]《飼料中磺胺類(lèi)藥物的測(cè)定高效液項(xiàng)色譜法》中稱(chēng)樣容器錐形瓶改為離心管，提取液乙腈體積減半，驗(yàn)證建立更加合理、利于操作的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀（型號(hào)為Agilent 1260 infinity Ⅱ），安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；離心機(jī)（型號(hào)為CR22G），日本日立公司產(chǎn)品；旋渦混勻器（型號(hào)為IKA MS3），德國(guó)艾卡公司產(chǎn)品，分析天平（型號(hào)為AX-205）、電子天平（型號(hào)為L(zhǎng)D202-L），梅特勒-托利多公司產(chǎn)品；超聲清洗器（型號(hào)為KQ-400KDB），昆山舒美超聲儀器有限公司產(chǎn)品；固相萃取裝置（型號(hào)為SepLine-S4），萊伯泰科有限公司產(chǎn)品；振蕩器（型號(hào)為WSZ-100-A），上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；純水儀（型號(hào)為Milli-Q Integral 5），默克密理博公司產(chǎn)品。

1.2 儀器條件

色譜條件：紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；色譜柱，Agilent C18柱，柱長(zhǎng)250 mm，內(nèi)徑4.6 mm；流動(dòng)相：乙腈∶4%冰乙酸水=25%∶75%，流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量20 μL。

1.3 檢出限與定量限

該方法的定量限，磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶為5 mg·kg-1；磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺喹惡啉為2 mg·kg-1。

1.4 試劑

乙腈（色譜級(jí)，批號(hào)為178563）、甲醇（色譜級(jí)，批號(hào)為175614），F(xiàn)isher chemical 產(chǎn)品；冰乙酸（優(yōu)級(jí)純，批號(hào)為180219），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；超純水，德國(guó)默克密理博Milli-Q Integral 5 制得；堿性氧化鋁SPE 小柱（批號(hào)為029639192A），沃特世Waters Spe-Pak 1 000 mg·（12 mL）-1。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)品

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制

標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制過(guò)程見(jiàn)表1。配制好后在-16 ℃避光保存，有效期6個(gè)月。

1.5.2 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液

表1 標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制

表2 5種磺胺類(lèi)藥物的回收率及精密度

分別量取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)貯備液置于同一25 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，使其成為濃度100 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。4 ℃避光保存，有效期1個(gè)月。

1.5.3 繪制混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)

準(zhǔn)確量取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液10、20、50、150 μL和500 μL，分別置于10 mL 的棕色容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，使?jié)舛确謩e0.1、0.2、0.5、1.5 μg·mL-1和5.0 μg·mL-1，繪制混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)。

1.6 樣品制備及處理

樣品制備：選具有代表性的飼料500 g，粉碎過(guò)40目篩，混勻備用。

提取：準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g（精確至0.001 g）試樣于50 mL離心管中，加入25 mL乙腈，渦旋1 min，振蕩30 min，9 000 r·min-1離心5 min，備用，同時(shí)做空白對(duì)照。

凈化過(guò)程：堿性氧化鋁SPE小柱，取10 mL乙腈淋洗，準(zhǔn)確移去10 mL樣品試液過(guò)濾，流出后吹干。分別用2 mL 流動(dòng)相洗脫2 次，收集洗脫液混勻，過(guò)0.22 μm濾膜后上機(jī)測(cè)定。

1.7 陽(yáng)性添加樣品

向稱(chēng)取的樣品中分別加入20、40、100 μL 和300 μL濃度為100 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液，制成濃度為1、2、5mg·kg-1和7.5mg·kg-1的陽(yáng)性添加樣品，上機(jī)濃度分別為0.2、0.4、1.0 μg·mL-1和1.5 μg·mL-1，每個(gè)濃度陽(yáng)性添加做6個(gè)平行，連續(xù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖

5 種磺胺類(lèi)藥物0.2 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)圖譜，1 mg·kg-1陽(yáng)性添加回收及空白樣品圖譜見(jiàn)圖1～3。

圖1 5種磺胺類(lèi)藥物0.2 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)圖譜

圖2 5種磺胺類(lèi)藥物1 μg·mL-1回收?qǐng)D譜

因飼料中粗蛋白等含量較高，基質(zhì)復(fù)雜容易對(duì)目標(biāo)物形成干擾，選用乙腈做流動(dòng)相，可以沉淀蛋白質(zhì)；流動(dòng)相的pH 會(huì)影響磺胺類(lèi)藥物在色譜柱中的分離，水相選用4%的冰乙酸水利于不同磺胺類(lèi)藥物的分離。試驗(yàn)結(jié)果表明：5種磺胺類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)圖譜與添加回收?qǐng)D譜的色譜峰保留時(shí)間一致，且峰形良好，分離度好，互不干擾，說(shuō)明流動(dòng)相比例合理；由添加回收?qǐng)D譜可以看出，樣品基質(zhì)對(duì)添加回收影響小，說(shuō)明試驗(yàn)條件及方法可行。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

以含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，見(jiàn)圖4～8。

圖4 磺胺嘧啶的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

圖6 磺胺二甲基嘧啶的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

圖7 磺胺甲惡唑的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

圖8 磺胺喹惡啉的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

由圖4～8可以看出，5種磺胺類(lèi)藥物回歸方程分別為：磺胺嘧啶y=87.484 9x-0.874 3，磺胺間甲氧y=72.653 2x-0.765 0，磺胺二甲基嘧啶y=75.852 7x-0.717 9，磺胺甲惡唑y=75.664 7x-0.816 4，磺胺喹惡啉y=66.821 4x-1.231 0，5 種藥物5 個(gè)濃度（0.1、0.2、0.5、1.5 μg·mL-1和5.0 μg·mL-1）的線(xiàn)性均在0.999 9以上，線(xiàn)性良好。

2.3 回收率

陽(yáng)性添加濃度為0.2、0.4、1.0mg·kg-1和1.5mg·kg-1四個(gè)濃度時(shí)，平均回收率為85.8%～113.0%，變異系數(shù)（RSD）為0.2%～7.6%，說(shuō)明該方法精密度良好，符合方法學(xué)要求。

2.4 注意事項(xiàng)

磺胺類(lèi)藥物屬于酸堿兩性物質(zhì)[6]，標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制過(guò)程中，磺胺喹惡啉超聲后若有混濁不溶現(xiàn)象，可適量加0.1%氫氧化鈉溶液50～100 μL，直至溶解后定容。標(biāo)準(zhǔn)品配制過(guò)程中，所用的容量瓶均建議采用棕色。

3 應(yīng) 用

2022 年對(duì)寧夏區(qū)內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)、經(jīng)營(yíng)店、養(yǎng)殖場(chǎng)的豬雞配合飼料38 批次牛、羊精料補(bǔ)充料44 批次、自配料38批次，共計(jì)120批次飼料樣品，應(yīng)用該方法進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出上述5 種磺胺類(lèi)藥物，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

4 討 論

自飼料中禁止使用抗生素公告頒布后，飼料中抗生素檢測(cè)成為檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)的主要任務(wù)，磺胺類(lèi)藥物為抗菌藥品種數(shù)量最多的人工合成藥物。飼料中磺胺類(lèi)藥物分析測(cè)定方法有多種，例如高效液相色譜法[7-9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-11]、酶聯(lián)免疫法、放射受體分析法等，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法成本較高，酶聯(lián)免疫法易出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性反應(yīng)，需用高效液相色譜法或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行確證，放射受體分析法有時(shí)會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)及假陽(yáng)性反應(yīng)，樣品處理復(fù)雜，其中高校液相色譜法較成熟并被廣泛應(yīng)用。本研究針對(duì)《飼料中磺胺類(lèi)藥物的測(cè)定高效液相色譜法》中的前處理方法進(jìn)行了改進(jìn)，改進(jìn)后的方法更加便捷、高效，更有利于進(jìn)行大批量飼料樣品中常見(jiàn)磺胺類(lèi)藥物的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)。

5 結(jié) 論

利用高效液相色譜法測(cè)定飼料中5種磺胺類(lèi)藥物，將GB/T 19542—2007方法中稱(chēng)樣容器錐形瓶改為離心管，利于樣品旋渦、振搖、離心等操作。提取液體積由50 mL乙腈改為25 mL，降低有機(jī)試劑的使用量，減少環(huán)境污染及對(duì)操作人員的毒性作用。改進(jìn)后的方法更為簡(jiǎn)單，利于操作和樣品的批量處理。經(jīng)驗(yàn)證，改進(jìn)的方法各項(xiàng)參數(shù)均符合方法學(xué)要求，可用于飼料中非法添加磺胺類(lèi)藥物的檢測(cè)，對(duì)飼料禁止使用磺胺類(lèi)藥物的篩查具有重要意義。