基于網絡藥理學探析復方菝葜治療非小細胞肺癌的機制*

朱立華，周融融，黃生武，何 丹，3，張海潮，3，謝 誼

（1.湖南國華制藥有限公司，湖南 長沙 410013；2.湖南省中醫藥研究院，湖南 長沙 410013；3.湖南中醫藥大學研究生院，湖南 長沙 410208）

肺癌是全球發病率最高的惡性腫瘤之一，也是導致癌癥相關死亡的主要原因，每年約有200萬新發病例和176萬死亡病例[1]。肺癌發病率在多數國家呈升高趨勢，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的75%~85%。大多數NSCLC臨床病例確診時已屬中晚期，失去了手術切除機會，而目前傳統放療、化療效果欠佳，5年生存率僅為5%~10%[2]。因此尋找新的更有效的治療方法顯得尤為重要。

近年來，中藥復方在控制腫瘤增殖、減毒增效、預防復發、延長生存期、改善生活質量等方面具有獨特的優勢。越來越多臨床醫生采取中西醫結合的方法治療腫瘤患者，如在西藥化學治療后，通過中藥調理，延長生存期并改善生活質量。復方菝葜（Fufang Baqia，FFBQ）為國華制藥有限公司自主研發，由菝葜、魚腥草、貓爪草、土鱉蟲、款冬花、枸杞子、大棗（去核）、鮮鱧魚8味藥材組成，具有清熱解毒、軟堅散結、滋陰益氣、扶正培本之功，輔助治療肺癌、子宮頸癌等多種癌癥具有較好的療效[3]。研究表明，復方菝葜能穩定腫瘤瘤體，抑制腫瘤生長，其治療肺癌的臨床有效穩定率達88.24%[4]。前期研究通過HPLC-Q-TOF-MS技術，從復方菝葜組方中分析得到29種化學成分，并對其物質基礎進行了初步探索，然而復方菝葜組成藥味較多、化合物構成復雜，且關于其抗NSCLC的藥效物質基礎及分子機制尚未探明，限制了復方菝葜進一步開發利用。網絡藥理學的應用提供了一種將中醫整體理念與藥物發現相結合的新模式，使復方研究實現了從“一靶、一藥”模式轉向“網絡靶點、多組分治療”模式。

本研究結合前期物質基礎分析，通過成分數據庫平臺豐富復方菝葜成分數據庫，采用網絡藥理學篩選并構建“藥物-靶點-疾病”網絡，挖掘和預測復方菝葜多成分、多靶點協同參與抗NSCLC的潛在物質基礎、作用途徑，旨在為其抗NSCLC的臨床應用及開發提供參考和科學依據。

1 方 法

1.1 數據庫及軟件 （1）藥材及化合物信息平臺：PubChem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；中國知網（https://www.cnki.net/）；中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP, http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）；2020年版《中華人民共和國藥典》。（2）非小細胞肺癌數據平臺：GeneCards數據庫（https://www.genecards.org/）；人類孟德爾遺傳數據庫（Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM，https://www.omim.org/）；DisGeNET數據庫（A database of genedisease associations, http://www.disgenet.org）。（3）靶標預測平臺：Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）。（4）化合物結構繪制軟件：ChemDraw 14.0。（5）蛋白質標準化數據平臺；UniProt數據庫（http://www.rcsb.org）。（6）網絡可視化平臺及軟件：STRING數據平臺（https://string-db.org）；Cytoscape 3.7.1軟件。（7）靶標GO功能及KEGG富集平臺：DAVID平臺（The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, https://david.ncifcrf.gov/）。

1.2 藥材成分信息及靶標預測 依次檢索復方菝葜中菝葜、魚腥草、貓爪草、土鱉蟲、款冬花、枸杞子、大棗、鮮鱧魚8味藥材，在2020年版《中華人民共和國藥典》、TCMSP數據庫、中國知網、PubChem中收集歸納各藥材成分、歸經及靶標信息。復方菝葜抗NSCLC的潛在候選成分需滿足吸收、分布、代謝和排泄標準（Absorption，Distribution，Metabolism，Elimination；ADME）：即類藥性（drug like, DL）≥0.18；口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%。針對數據庫或文獻中有活性而無直接關聯靶標信息的成分，則按照如下步驟預測靶標：在PubChem數據庫中檢索成分的SMILES字符串或下載成分結構文件，將結果上傳至Swiss Target Prediction平臺進行靶標預測，其中排名前10的靶標被視為成分潛在靶標。

1.3 非小細胞肺癌靶標數據庫 以“non-small cell lung cancer”為關鍵詞在OMIM、GeneCards、DisGeNET3個疾病信息平臺中檢索NSCLC發生發展密切相關的蛋白靶標；采用Uniprot數據庫對疾病靶標名稱進行規范化。

1.4 GO和KEGG富集分析 將預測到的復方菝葜活性靶標與NSCLC相關靶標進行比對遴選，進一步得到復方菝葜成分與疾病的共調控靶標。通過DAVID在線平臺對共有靶標進行GO功能注釋和KEGG通路富集。分別采用靶標富集數量、通路富集P值進行排序和可視化。

1.5 網絡構建及拓撲分析 通過Cytoscape 3.7.1軟件對上述收集的藥材成分、藥材靶標、藥材歸經、疾病靶標進行關聯與可視化，分別構建復方菝葜-歸經網絡、藥材-活性成分-靶標網絡、蛋白-蛋白互作網絡（protein-protein interaction network,PPI）。采用Merge工具進行網絡間的關聯，并通過Network Analyzer統計各靶標的中介中心度（BetweennessCentrality，BC）和連接度值（Degree），對各節點（node）的網絡中心度和重要度進行評價。

1.6 分子對接 為進一步驗證網絡預測結果，通過Autodocks 4.2.6軟件對關鍵活性分子與關鍵靶標進行虛擬分子對接。從PDB（http://www.pdb.org）平臺下載關鍵蛋白的3D結構，在PubChem數據庫中收集關鍵活性分子（配體）的3D結構，采用Autodocks 4.2.6軟件對蛋白和配體進行去水，加氫，加電荷等前處理。

2 結 果

2.1 復方菝葜-歸經分析 以復方菝葜7味藥材為關鍵詞，從TCMIP、2020年版《中華人民共和國藥典》及文獻中收集并分析該方的歸經信息，構建復方菝葜-歸經網絡。（見圖1）依據連接度值（Degree）大小對歸經網絡的各臟腑重要度進行排序，依次為：肺經（degree=4）、肝經（degree=4）、腎經（degree=3）、胃經（degree=3）、脾經（degree=2）、心（degree=1）。結果表明，復方菝葜對機體肺經和肝經的選擇性較高，其主要通過干預上述經絡到達病位發揮治療作用。

2.2 復方菝葜抗NSCLC的網絡分析

2.2.1 復方菝葜“藥材-活性成分-靶標”網絡 從文獻調研及數據庫中共收集復方菝葜641個活性成分，依據ADME標準對各成分進行篩選和去重，共獲得99個潛在活性成分（菝葜9個、魚腥草5個、貓爪草10個、土鱉蟲4個、款冬花16個、枸杞子35個、大棗20個）。基于上述活性成分共預測到313個潛在靶標。（見表1）通過Cytoscape軟件中的Merge工具對藥材-成分及成分-靶標信息進行綜合關聯，構建復方菝葜藥材-活性成分-靶標網絡。（見圖2）復方菝葜的組方藥材均表現出多成分調控多靶標的特性。槲皮素（quercetin）、β-谷甾醇（βsitosterol）、落新婦苷（astilbin）、花旗松素（taxifolin）、阿托品（atropine）、山奈酚（kaempferol）、7-O-甲基毛綱草酚（7-OMethyleriodictyol）、千金藤堿（stepholidine）、腺苷（adenosine）和光千金藤堿（stepharine）在網絡分析中被選定為復方菝葜抗NSCLC的潛在關鍵性活性成分。上述成分在網絡中呈現較高的Degreee值，可同時參與二十余個生物靶標的調控。結果表明，復方菝葜全方合用具有多成分、多靶標協同參與抗NSCLC的優勢。

表1 復方菝葜“中藥-化合物-活性成分-潛在靶標”信息

表2 復方菝葜有效成分信息

圖2 復方菝葜“藥材-活性成分-靶標”網絡

2.2.2 蛋白-蛋白互作網絡 為篩選復方菝葜抗NSCLC的潛在靶標，進一步構建復方菝葜成分與疾病的靶標蛋白互作網絡，本研究以“non-small cell lung cancer”為關鍵詞，在GeneCards、OMIM和DisGeNET 3個數據庫平臺分別檢索到241、182和115個NSCLC相關靶標，設為疾病背景數據庫。通過比對藥材的313個潛在靶標，得到63個復方菝葜成分-疾病共有靶標（見圖3），并將其視為GO、KEGG富集分析的候選靶標。采用STRING平臺分析63個共有靶標間的生物關聯，構建蛋白-蛋白互作網絡（PPI）。（見圖4）拓撲數據顯示，Degree值排名前10的靶標依次為MYC、TP53、EGFR、AKT1、CTNNB1、CASP3、CCND1、ERBB2、GAPDH、HIF1A，其在PPI網絡中的拓撲分數見表3。

表3 10 個核心靶標的信息

圖3 復方菝葜成分-疾病共有靶標圖

圖4 PPI 網絡篩選圖

2.3 復方菝葜抗NSCLC的靶標及通路富集

2.3.1 GO富集 采用DAVID平臺對復方菝葜治療NSCLC的63個共有靶標進行GO功能富集，依據靶標富集數量排序，篩選到前30項GO功能富集條目。（見圖5）結果顯示，復方菝葜主要通過細胞核、細胞質、細胞外間隙、胞質溶膠、核質、胞外區、線粒體等細胞元件（Cellular component），參與RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄調控、凋亡過程調控、蛋白質磷酸化的正調控、細胞周期調控、信號轉導、細胞增殖調控、對外源刺激的反應等生物學過程（Biological process），起到蛋白質結合、酶結合、蛋白激酶結合等分子功能（Molecular function），從而發揮抗NSCLC的功效。

圖5 63 個共有靶標的GO 生物功能富集分析

圖6 KEGG 通路富集分析

2.3.2 KEGG富集 通過KEGG注釋63個共有靶標的富集通路，共得到34條與NSCLC發展或治療相關的生物途徑（P＜0.01）。（見表4）KEGG富集結果提示，復方菝葜治療NSCLC的途徑主要為多靶標協同調控多條生物通路。

表4 復方菝葜治療NSCLC的34 條相關通路信息

2.4 分子對接 分子對接可以預測其結合模式的強弱，也就是結合能。兩者之間結合能越小，說明配體與受體的構象越穩定，通常結合能＜-5 kcal/mol時，結合活性較好。因此，本研究選擇自由度高的成分槲皮素、花旗松素和落新婦苷，與關鍵靶點MYC、TP53和EGFR進行分子對接。（見表5、圖7）結果顯示，復方菝葜的關鍵活性成分與治療NSCLC的關鍵作用靶點具有較好的結合活性，但是其具體作用機制和相關靶點還有待于進一步驗證。

表5 關鍵活性成分與關鍵靶點對接的結合能 （kcal/mol）

圖7 分子對接的結果

3 討 論

NSCLC的治療及機制探索雖取得了重要進展，但其總體治愈率和生存率仍然較低。NSCLC仍是目前致死率最高的肺癌類型之一[5]。因此繼續尋求新藥或聯合療法，以將臨床益處擴大到更廣泛的患者群體，并改善NSCLC的預后是目前亟待解決的問題。復方菝葜聯合諸藥對于肺癌尤其是NSCLC中晚期，以及肺癌伴咳嗽、胸痛等癥具有顯著改善作用，但缺乏與之相關的機制探索[6-7]。網絡藥理學分析從中藥整體性出發，可實現藥物“多藥味、多成分、多靶標、多途徑”作用模式的可視化和系統化展示。近年來網絡藥理學被廣泛應用于復雜中藥的機制研究中，為闡明中藥及其復方作用機制作用提供了新思路[8]。

復方菝葜-歸經網絡分析顯示，肺經和肝經（degree=4）是該方各藥味選擇性較高的經絡，提示復方菝葜作用的主要病位在于肺和肝。同時該方對腎、胃、脾、心經也有較好的富集。中醫古籍并無NSCLC病名記載，現代中醫學家依其特征將其歸為“肺積”“肺巖”“肺萎”等范疇。病機為正氣虛損，邪毒入肺，久則耗氣傷陰，造成脾胃虛弱，肝膽疏泄不暢[3,9-10]。復方菝葜中菝葜、魚腥草清熱解毒；貓爪草、土鱉蟲軟堅散結；枸杞子、大棗、鱧魚具有扶正祛邪之功；款冬花潤肺下氣；枸杞子滋補肝腎；大棗益氣健脾，調和諸藥[3]。復方菝葜全方合用，可能通過靶向多個經絡，發揮扶正祛邪、提高脾胃運化和肝膽疏泄的作用。

復方菝葜“藥材-活性成分-靶標”網絡篩選得到10個潛在活性成分，包括1個四環三萜類化合物、3個生物堿類化合物、5個黃酮類化合物和1個腺苷。上述成分均可參與多個生物靶標的調節從而發揮治療作用。研究顯示，菝葜總黃酮提取物可通過調控p53介導的凋亡信號通路，激活人NSCLC細胞A549的凋亡[11]。落新婦苷是菝葜中含量較高的黃酮類成分，具有抗炎、抑制免疫、保肝護腎等藥理活性[12]。其可通過上調Bax、cleaved-Caspase-3，下調Bcl-2蛋白表達來增強順鉑促進A549細胞凋亡的作用[13]。研究表明，槲皮素可通過介導PI3K/Akt、AMPK/mTOR、Stat3/Mcl-1和NF-κB等多條通路，促進NSCLC細胞凋亡，抑制癌細胞遷移與侵襲[14-16]。β-谷甾醇[17]、花旗松素[18-19]、山奈酚[20]和腺苷[21]均可顯著降低NSCLC細胞的增殖、侵襲與遷移能力。千金藤堿能抑制A549細胞血紅素加氧酶-1（heme oxy-genase-1, HO-1）和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）的基因表達，發揮抗癌細胞增殖作用[22]。這些化合物可能是復方菝葜治療NSCLC的潛在物質基礎，也提示復方菝葜具有多成分、多靶標協同參與抗NSCLC的作用。這些化合物共同發揮增強抗炎、抗癌細胞增殖等作用來達到治療NSCLC的功效，但是其藥效成分和機制還有待進一步研究。KEGG通路富集結果顯示，MAPK、PI3K-Akt和JAK-STAT信號通路（node·15）可能是復方菝葜治療NSCLC網絡中的關鍵信號通路。研究表明，上述通路作為細胞內重要信號轉導途徑，能通過影響下游眾多效應分子的活化狀態，控制腫瘤的發生發展，包括細胞凋亡、轉錄、翻譯、代謝、血管新生及細胞周期的調控[23-25]。下調JAK/STAT或PI3K/Akt被證實可抑制NSCLC細胞的增殖和遷移[26-27]。這為后續基于信號通路從分子生物水平研究復方菝葜治療NSCLC提供了方向。

綜上所述，復方菝葜中槲皮素、花旗松素、落新婦苷、山奈酚、腺苷、千金藤堿和光千金藤堿等核心成分，可能通過MYC、TP53、EGFR、AKT1 和CTNNB1 等 關 鍵 靶 點 及MAPK、PI3K-Akt、JAK-STAT、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、TNF等信號通路來控制NSCLC的發生發展。復方菝葜可通過“多成分、多靶標、多途徑”協同治療NSCLC，為復方菝葜后續治療NSCLC的臨床應用及開發利用提供了參考和依據。