胃癌P2RX7表達狀態與中醫脾虛毒蘊證的相關性研究*

王小娟，鄒 晨，戴小軍,,3，劉延慶,3，張曉春，吳永健，王珊珊

（1.揚州大學臨床中醫學院，江蘇 揚州 225009；2.揚州市中醫院，江蘇 揚州 225012；3.國家中醫藥管理局胃癌毒邪論治重點研究室，江蘇 揚州 225009）

胃癌是消化系統最常見的惡性腫瘤之一，較強的腫瘤異質性與較高的復發率、轉移率是胃癌預后較差的重要原因[1]。中西醫結合治療胃癌是我國惡性腫瘤綜合治療的特色與優勢，中醫辨證論治能夠有效改善患者的臨床癥狀與預后。隨著腫瘤分子生物學研究的不斷深入，了解不同中醫證型的分子病理特征有助于深化對胃癌中醫理論的基礎研究與抗腫瘤中藥的精準選擇[2]。P2RX7（Purinergic Receptor P2X, Ligand-Gated Ion Channel, 7）是一種跨膜受體蛋白，廣泛分布于細胞膜表面。研究表明，P2RX7在實體癌和血液系統惡性腫瘤中具有廣泛的生物學功能，能在腫瘤細胞的發育和擴散中發揮關鍵作用，為腫瘤發生和進展的重要介質[3-4]。

本研究采用免疫組化檢測胃癌組織中P2RX7蛋白的表達狀態，并結合患者的中醫辨證分型，以及患者的年齡、性別、腫瘤家族史、Lauren分型和TNM分期等臨床特征，分析P2RX7蛋白的表達及各臨床因素與中醫脾虛毒蘊證之間的相關性，旨在探討胃癌脾虛毒蘊證的分子生物學基礎。

1 資料與方法

1.1 研究對象 納入2021年1—12月在揚州市中醫院就診的未經任何治療的新發胃癌患者80例。所有患者均根據《胃癌診療規范（2018年版）》[5]中胃癌診斷標準進行診斷，以患者的胃鏡或手術病理報告為明確診斷的依據。臨床病理分期依據美國癌癥聯合會（AJCC）胃癌TNM分期第八版。本研究經過揚州市中醫院倫理審查（編號：2021-26）。

1.2 中醫辨證分型標準 根據《惡性腫瘤中醫診療指南》[6]的診斷要點，并在課題組專家指導下擬定胃癌脾虛毒蘊證辨證標準。（1）主癥：①納呆食少；②胃脘疼痛；③腹脹；④口臭。（2）次癥：①肢體倦怠乏力；②形體消瘦或浮腫；③面色晦暗無華；④便溏。（3）舌脈：舌淡胖或紅或暗，苔黃或白膩，脈細數或弦滑。凡具備3項主癥，或2項主癥和2項次癥，結合舌脈即可診斷為脾虛毒蘊證。非脾虛毒蘊證包括肝胃不和證、胃熱陰虛證、氣血虧虛證、脾胃虛寒證等。

1.3 納入標準 （1）病理診斷為胃腺癌；（2）TNM分期明確；（3）發病年齡18～75歲；（4）KPS評分≥60分；（5）依從性較好，同意提供組織學樣本，并簽署知情同意書。

1.4 排除標準 （1）多重癌癥患者；（2）合并有心肌梗死、腦梗死、嚴重肝腎功能不全等急慢性疾病的患者；（3）妊娠、哺乳期婦女；（4）精神病患者。

1.5 主要試劑與設備 山羊抗人P2RX7多克隆抗體（1∶100）（美國Abcam公司，批號：GR50237-25）；SP法免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號：17A07F21L0623）；DAB顯色試劑（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：224020110）；蘇木素染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號：20211230）；免疫組化專用粘附載玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司，批號：80312-3161）；自動脫水機（型號：TP1020）、石蠟包埋機（型號：EGHH50H）、切片機（型號：RM2235）均購自美國Thermo公司；電熱鼓風恒溫烤箱（上海醫用恒溫設備廠，型號：DGX-9143B-21）；電熱恒溫水浴箱[邦西儀器科技（上海）有限公司，型號：HH-2]；微波爐（美的集團股份有限公司，型號：MM823EE2-PS00000472）；正置熒光相差顯微鏡（日本Olympus公司，型號：ECLIPSE 801）。

1.6 免疫組織化學染色 胃癌病理標本來自于2021年1—12月在揚州市中醫院就診的未經任何治療的80例新發胃癌患者。患者同意提供組織學樣本，并簽署知情同意書。胃癌組織離體后立即沖洗，修剪，固定，脫水，透明，浸蠟，包埋，連續切片厚度約4 μm，45 ℃水浴鍋中展片，撈片。溫箱60 ℃烤片2 h，脫蠟復水；滴加3%H2O2溶液覆蓋組織，避光，室溫中孵育10 min，PBS清洗；將組織浸入0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液中高溫煮沸6 min，PBS清洗；免疫組化標記筆固定組織范圍，用兔血清封閉液覆蓋組織，置于濕盒內于37 ℃孵育20～30 min，不洗；孵一抗，濕盒內4 ℃冰箱過夜；PBS清洗，孵二抗，濕盒置于37℃的恒溫箱內孵育30 min；PBS清洗，滴加SABC（鏈霉親和素-生物素復合物）覆蓋組織，37 ℃，孵育30 min；PBS清洗，DAB顯色，顯微鏡實時觀察細胞狀態以確定最終顯色時間，用雙蒸水充分清洗終止顯色；用含乙醇的蘇木精復染；脫水及透明；中性樹脂封片；拍照。

1.7 結果判定 在光學顯微鏡下，根據切片腫瘤細胞染色強度計算分值；在Image J中分析陽性細胞比例計算分值。分值標準如下。（1）染色強度：無著色，計0分；淡黃色，計1分；棕黃色，計2分；黃褐色，計3分。（2）腫瘤細胞中陽性細胞比例：未染色，計0分；0%～≤10%，計1分；10%～≤50%，計2分；50%～≤75%，計3分；＞75%，計4分。評分=染色強度評分×陽性細胞百分率評分。評分范圍為0～12分。結果判定標準：0～1分為陰性；2～3分為弱陽性；4～6分為中等陽性；＞6分為強陽性。0～3分為低表達；4～12分為高表達。

1.8 統計學方法 采用SPSS 24.0統計軟件進行數據分析，計數資料采用χ2檢驗，采用Pearson分析系數進行相關性分析，采用Logistic回歸進行脾虛毒蘊證的危險因素分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 胃癌患者的臨床特征 脾虛毒蘊證胃癌患者腫瘤家族史、P2RX7表達、TNM分期與非脾虛毒蘊證胃癌患者比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；年齡、性別、腫瘤部位、Lauren分型比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見表1）

表1 80 例胃癌患者的臨床基本特征

單因素Logistic回歸分析顯示脾虛毒蘊證胃癌患者的腫瘤家族史（P=0.000）、P2RX7高表達（P=0.000）、TNM分期（P=0.000）與非脾虛毒蘊證胃癌患者比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；年齡（P=0.215）、性別（P=0.194）、腫瘤部位（P=0.109）、Lauren分型（P=0.695）比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。P2RX7蛋白高表達、腫瘤家族史和TNM分期均是影響胃癌脾虛毒蘊證的危險因素，而年齡、性別、腫瘤原發部位、Lauren分型不是危險因素。

2.2 胃癌組織中P2RX7表達分布特征 在40倍的光鏡下觀察，胃癌P2RX7蛋白定位于細胞膜和細胞質，免疫組織化學染色呈棕褐色。（見圖1）80例胃癌患者中，P2RX7蛋白表達陰性者9例（11.25%），弱陽性表達24例（30.00%），陽性表達31例（38.75%），強陽性表達16例（20.00%）。本研究將P2RX7蛋白表達陰性和弱陽性者視為低表達，陽性表達和強陽性表達視為高表達。其中，低表達者33例，高表達者47例。

圖1 P2RX7 蛋白在胃癌組織中的表達情況（免疫組化，×40）

2.3 P2RX7與胃癌脾虛毒蘊證的關系

2.3.1 脾虛毒蘊證患者P2RX7表達與非脾虛毒蘊證比較 胃癌脾虛毒蘊證患者的P2RX7蛋白表達水平顯著高于胃癌非脾虛毒蘊證患者（P＜0.05）。（見表2）

2.3.2 胃癌脾虛毒蘊證與P2RX7表達的相關性 Pearson相關性分析顯示P2RX7與胃癌脾虛毒蘊證具有一定的相關性（R2=0.253，P＜0.01）。將年齡、性別、腫瘤家族史、P2RX7蛋白表達水平、腫瘤部位、Lauren分型及TNM分期7個因素納入多因素Logistic回歸模型分析，進行變量篩選。P2RX7蛋白高表達和腫瘤家族史是胃癌患者脾虛毒蘊證的獨立危險因素，而TNM分期中的Ⅲ、Ⅳ期比Ⅰ期更容易使胃癌患者發生脾虛毒蘊。（見表3）

表3 Logistic 回歸分析參數估計值

3 討 論

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，其發病率位列全球惡性腫瘤發病率第五，相關死亡率位列第四[7]。國家腫瘤中心預測2022年我國將有50.9萬人確診胃癌，相關死亡人數預估有40萬，發病率和死亡率在常見癌癥中均排第三位[8]。盡管近些年來胃癌的發病率在下降，綜合治療策略在不斷更新發展，但胃癌的預后仍然較差。

中醫學中雖無胃癌病名的記載，但關于其證候描述、病因病機的記載卻十分豐富。根據其臨床表現，胃癌可歸屬于中醫學中“噎膈”“胃反”“翻胃”“積聚”等范疇。陰虛痰凝毒結是晚期胃癌的核心病機，胃陰不足為疾病進展之根本，痰凝毒結、聚散流竄為標且貫穿其始終[9]。經過歷代中醫學家的不斷豐富發展，目前多數研究者從“健脾益氣”“清熱解毒”“化痰散結”“化瘀解毒”等治法出發，在基礎研究和臨床研究中取得了豐富的成果[10-14]。在本研究的80例胃癌患者中，脾虛毒蘊證36例，占45.00%，顯著高于其他證型，與多位醫家的辨治思路存在一致之處[15-17]。

慢性炎癥和免疫抑制是腫瘤微環境形成的核心特征，是激發腫瘤發生與發展的重要因素。韓欽芮等[18]通過梳理文獻發現，脾虛患者存在慢性炎癥，癌癥患者在脾虛狀態下存在免疫抑制反應。程海波等[19]認為腫瘤微環境中的炎癥微環境可能是熱毒的表現，而痰濕毒邪也與腫瘤微環境中黏附因子的表達密切相關；劉磊等[20]認為惡性腫瘤中的“痰毒”與腫瘤微環境中腫瘤相關成纖維細胞（cancer associated fibroblasts,CAFs）分泌多種因子的病理過程密切相關。此外，腫瘤患者的血液普遍存在高凝狀態，與癌細胞特異性促血栓形成特性及宿主細胞炎癥反應有關[21]。這可能是瘀毒內阻的表現。瘀毒內阻導致氣血津液運行不暢，機體能量利用與代謝障礙，產生低氧微環境。低氧微環境會增加低氧誘導因子（HIF-1α）的分泌，進而誘導新生血管形成，有利于腫瘤細胞的生長與轉移。研究顯示，中藥能夠調節癌癥患者的免疫功能，提升機體抗癌能力。中藥對胃癌機體免疫的影響主要體現在降低Treg細胞的免疫抑制，提高CD4+、CD8+效應細胞表達，調節細胞因子及免疫球蛋白等方面[22]。BAROJA-MAZO A等[23]發現P2X7激活后，可抑制NK細胞的抗腫瘤效力。綜上所述，脾虛毒蘊可能是腫瘤微環境形成的關鍵病機。有研究[24]表明調節腫瘤微環境的生化成分是癌癥治療的新前沿。在生理條件下，ATP在體內的濃度較低，不足以激活P2RX7。當惡性腫瘤發生時，腫瘤細胞會向細胞外基質中釋放大量ATP，導致TME中ATP濃度升高，過度激活P2RX7。由于P2RX7在構成TME的不同細胞類型中廣泛表達，P2RX7的過度激活會導致細胞膜上的離子通道開放，使Na+和Ca2+流入，K+流出，進一步激活參與細胞內信號轉導通路的酶和激酶（如c-Jun、PKA、PKC、PLA、ATK、JNK、MAPK、ERK1/2和p38等），誘導炎癥因子（如TNF-α、IL-10、IL1β、NALP3和Caspase-1/2等）的釋放，最終促進腫瘤細胞的生長、增殖、遷移和侵襲[25]。目前P2RX7與腫瘤之間的內在聯系已被廣泛認識，其中胃癌的預后也與其相關[26-27]。

本研究中，P2RX7高表達47例，占58.75%（47/80），表明胃癌組織中P2RX7處于高表達狀態。此外，本研究結果證明了脾虛毒蘊是胃癌最常見的病理因素，且發現P2RX7表達狀態與脾虛毒蘊證相關。P2RX7高表達可能是胃癌脾虛毒蘊證的分子機制之一，P2RX7高表達和有腫瘤家族史是胃癌患者有脾虛毒蘊證的獨立高風險因素，并且晚期胃癌更容易發展成脾虛毒蘊證。

綜上所述，P2RX7可作為免疫組化的檢測指標協助胃癌的臨床診斷，并可作為胃癌脾虛毒蘊證的監測指標，有助于更好地協助胃癌的臨床治療。