健腦解郁方對腦小血管病并發抑郁癥大鼠海馬突觸可塑性的影響

戴 玲，駱 妍，侯光菡，王 樂，李 歡，孟 盼*

健腦解郁方對腦小血管病并發抑郁癥大鼠海馬突觸可塑性的影響

戴 玲1，駱 妍2，侯光菡3，王 樂2，李 歡2，孟 盼2*

1. 湖南科技職業學院藥學院，湖南 長沙 410200 2. 湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208 3. 長沙市第四醫院，湖南 長沙 410200

探討健腦解郁方對腦小血管病并發抑郁癥（cerebral small vessel disease related with depression，CSVDD）模型大鼠海馬突觸可塑性的干預作用及機制。將40只SHR大鼠隨機分為模型組、尼莫地平（21.6 mg/kg）＋丁苯酞（54 mg/kg）＋氟西汀（5.4 mg/kg）組和健腦解郁方高、中、低劑量（28.08、14.04、7.02 g/kg）組，每組8只，另取8只WKY大鼠作為對照組，大鼠背部sc-半乳糖（400 mg/kg）8周聯合雙側頸總動脈狹窄（bilateral common carotid artery stenosis，BCAS）4周及慢性不可預見性溫和刺激（chronic unpredicted mild stress，CUMS）4周制備CSVDD模型。采用糖水偏好率實驗、曠場實驗、強迫游泳實驗和水迷宮實驗評價大鼠抑郁樣行為；ELISA法檢測大鼠血清中一氧化氮（nitric oxide，NO）、內皮素-1（endothelin-1，ET-1）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、谷氨酸（glutamate，Glu）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平；激光微循環血流成像觀察腦血流量；蘇木素-伊紅（HE）染色觀察大鼠海馬CA3區血管周圍間隙情況；普魯士藍（LFB）染色觀察大鼠腦白質胼胝體病理變化；TUNEL法檢測大鼠海馬CA3區神經元凋亡；免疫熒光法檢測大鼠海馬CA3區腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、突觸素（synaptophysin，Syn）及突觸后致密蛋白-95（post synaptic density-95，PSD-95）的表達。與模型組比較，健腦解郁方組大鼠糖水偏好率顯著升高（＜0.05），自主活動顯著增加（＜0.05），游泳不動時間顯著減少（＜0.05），逃避潛伏期和目標象限潛伏期顯著縮短（＜0.05、0.01）；腦血流量顯著上升（＜0.05、0.01）；血清中5-HT和GABA水平顯著升高（＜0.05），NO、ET-1、Glu、IL-6和TNF-α水平顯著降低（＜0.05、0.01）；海馬CA3區擴大的血管周圍間隙數量減少，病理損傷明顯減輕，胼胝體髓鞘損傷減輕；海馬CA3區凋亡神經元數量顯著減少（＜0.01），BDNF、Syn和PSD-95表達顯著升高（＜0.05、0.01）。健腦解郁方可能通過促進海馬突觸可塑性，提升神經細胞營養供給，降低海馬神經元凋亡，以此改善腦組織海馬及白質區域病理損傷，調節神經內分泌指標的表達，改善CSVDD模型大鼠認知及情緒障礙。

健腦解郁方；腦小血管病并發抑郁癥；神經可塑性；凋亡；神經內分泌；芍藥苷；地黃苷A；金絲桃素；西紅花苷I；莫諾苷

腦小血管病（cerebral small vessel disease，CSVD）是由顱內微小血管的動態彌漫性病變所致的腦微血管疾病，在中老年人群中發病率超過70%[1]，具有高隱匿性、高發病率、高致殘率等特點[2]。腦小血管病并發抑郁癥（cerebral small vessel disease related with depression，CSVDD）在CSVD患者中的發病率為0.9%～42%[3]，跨度范圍大且逐年增加[4]。“血管性抑郁癥”假說提出CSVD是抑郁癥的重要病因[5]，CSVDD將成為腦病領域的一大挑戰，其潛在的發病機制仍然存在爭議[6]。

突觸可塑性包含感知、評估、存儲復雜信息及對相關刺激做出適應性反應的能力，是大腦最基本和最重要的功能之一[7]。CSVDD發生后，患者神經功能障礙可能與突觸可塑性的降低密切相關。磁共振成像顯示，CSVD誘發的認知障礙患者出現不同程度的海馬亞區萎縮[8]，海馬萎縮表現為海馬神經元突觸數目減少、功能受損及神經元固縮喪失。因此推測海馬突觸功能可塑性是CSVDD后神經功能恢復的關鍵，也是改善CSVD患者預后的重點。

課題組基于腦小血管病并發抑郁癥“虛、瘀、郁”的中醫病機特點，立補腎健脾、活血通絡、疏肝解郁的治法，創健腦解郁方。該方以固元健腦方合百事樂方加減而成。其中，固元健腦方是課題組篩選的臨床經驗方，而百事樂方是課題組研發的具有獨立知識產權的抗抑郁中藥復方（專利號CN101816766A）。本研究通過構建CSVDD大鼠模型，以海馬突觸可塑性為切入點，探討健腦解郁方是否可通過調控海馬CA3區域突觸可塑性從而發揮對CSVDD大鼠神經元的保護功能，改善神經功能障礙。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性14周齡SHR大鼠40只、SPF級雄性14周齡WKY大鼠8只，均由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物許可證為SCXK（京）2021-0006。動物飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心[SYXK（湘）2019-0009]，室溫（25±2）℃，光暗周期12 h/12 h，相對濕度（50±5）%，適應性喂養5 d，自由進食飲水。動物實驗經湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（批準號LLBH-202011090001）。

1.2 藥材

健腦解郁方由熟地黃15 g、白芍10 g、西紅花5 g、山茱萸6 g、山藥10 g、石菖蒲10 g、姜黃10 g、貫葉連翹5 g、炙甘草5 g等組成，以上藥材均購自北京同仁堂，經湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房張志國教授分別鑒定為玄參科植物地黃Libosch.的塊根經加工蒸曬而成、毛茛科植物芍藥Pall.的干燥根、鶯尾科植物番紅花L.的干燥柱頭、山茱萸科植物山茱萸Sieb. et Zucc.的干燥成熟果肉、天南星科植物石菖蒲Schott的干燥根莖、姜科植物姜黃L.的干燥根莖、藤黃科植物貫葉連翹L.的全草、豆科植物甘草Fisch.的干燥根和根莖經炮制加工而成。課題組采用LC-MS/MS法對健腦解郁方的成分進行分析，共鑒定出36種化合物，并對其中5種主要成分進行了定量分析，含芍藥苷1.98 mg/g、地黃苷A 0.24 mg/g、金絲桃素2.6 mg/g、西紅花苷I8.57 mg/g、莫諾苷0.36 mg/g。

1.3 藥品與試劑

尼莫地平（批號H14022821）購自亞寶藥業集團股份有限公司；丁苯酞（批號H20050299）購自石藥集團恩必普藥業有限公司；氟西汀（批號2019024）購自禮來（蘇州）制藥有限公司；-半乳糖（批號V900922）購自美國Sigma-Aldrich公司；突觸后致密蛋白95（post synaptic density 95，PSD95）抗體（批號20665-1-AP）、突觸素（synaptophysin，Syn）抗體（批號67864-1-lg）、腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）抗體（批號28205-1-AP）、山羊抗小鼠488抗體（批號SA00013-1）、購自美國Proteintech公司；山羊抗兔488抗體（批號GB25303）、髓鞘染液試劑盒（批號G1030）購自Servicebio公司；山羊抗兔594抗體（批號ab150080）購自英國Abcam公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）試劑盒（批號S0021S）購自上海碧云天公司；內皮素-1（endothelin-1，ET-1）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、谷氨酸（glutamate，Glu）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（批號分別為E-EL-R1458c、E-BC-K020-M、E-BC-K096-M、E-BC-K025-M、E-EL-R0362c、E-EL-R2536c）購自武漢Elabscience公司。

1.4 儀器

MK3型多功能酶標儀、HM430型生物組織切片機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；BM-I型生物組織包埋機（湖北孝感宏業醫用儀器有限公司）；Stemi 508型光學顯微鏡、LSM900型激光共聚焦顯微鏡（德國ZEISS公司）；Pannoramic MIDI數字玻片掃描系統（匈牙利3DHISTECH公司）；FLPI-2型激光微循環血流成像儀（英國Moor公司）。

2 方法

2.1 動物分組、造模與給藥

SHR大鼠背部sc-半乳糖（400 mg/kg）連續8周聯合雙側頸總動脈狹窄（bilateral common carotid artery stenosis，BCAS）4周，進而采用慢性不可預見性溫和應激加孤籠飼養，建立CSVDD大鼠模型。大鼠ip 10%水合氯醛（3.5 mg/kg）麻醉，仰臥固定于木板上，采用脫毛膏脫去頸部毛發裸露出皮膚，乙醇消毒，頸腹正中切口暴露雙側頸總動脈，小心地將其與迷走神經分離，在內外頸動脈分叉前1 cm處，將直徑0.45 mm注射器針頭扎在雙側頸總動脈上，在確保活結牢固固定后，小心拔出針頭，保證血管內有一定血流量通過，BCAS成功后，噴灑青霉素并縫合傷口消毒[9]。將CSVD成模大鼠隨機分為模型組、尼莫地平（21.6 mg/kg）＋丁苯酞（54 mg/kg）＋氟西汀（5.4 mg/kg）組和健腦解郁方高、中、低劑量（28.08、14.04、7.02 g/kg，分別相當于臨床劑量的2、1、0.5倍）組，每組8只，另取WKY大鼠背部sc 0.9%生理鹽水作為對照組。

采用慢性不可預見性溫和刺激（chronic unpredicted mild stress，CUMS）加孤籠飼養進一步建立CSVDD大鼠模型，慢性應激的方法包括：①禁食24 h；②禁水24 h；③潮濕墊料24 h；④夾尾2 min；⑤晝夜顛倒24 h；⑥噪音4 h；⑦50 V電擊3 min；⑧4 ℃冰水浴3 min，每天隨機安排1～2種刺激，同種刺激3 d內不重復出現，電擊和夾尾刺激每周限1次，共21 d。各組大鼠于CUMS造模期間同時ig給藥（10 mL/kg），對照組和模型組ig等體積的蒸餾水，1次/d，連續21 d后，進行行為學檢測，并立即取材。

2.2 行為學檢測

2.2.1 糖水偏好實驗 實驗開始前，將大鼠進行分籠，每只大鼠給予2個規格和外觀相同的水瓶，第1天為2瓶1%純凈水，第2天為1瓶1%蔗糖水及1瓶純凈水，第3天交換2個水瓶的位置，訓練時間持續24 h。適應結束后，禁食禁水24 h，提前稱定并記錄1%蔗糖與純凈水含量，2 h后交換水瓶位置，檢測結束記錄剩余的蔗糖水與純凈水，計算糖水偏好率。

糖水偏好率＝蔗糖水消耗量/(蔗糖水消耗量＋純凈水消耗量)

2.2.2 曠場實驗 曠場實驗主要是用來觀察動物的自主活動行為和探究行為，將大鼠從同一位置放入規格為50 cm×50 cm×50 cm、底板和四壁均為藍色且底部劃為25個小格的清潔敞箱內，適應30 s后，記錄大鼠3 min內的水平運動次數（四爪均在格內）和垂直站立次數（兩前爪抬起）。每次測試后，用酒精棉擦拭敞箱的內壁和底部，避免氣味相互干擾下一只大鼠的測試，實驗過程中保持房間內光線一致且安靜。

2.2.3 強迫游泳實驗 將大鼠放入25 cm×30 cm的圓筒中，圓筒中水的高度以大鼠伸展全身而后足不觸碰圓筒底部，且大鼠不能跳出圓筒為準。大鼠放入圓桶后，先適應性游泳30 s，而后觀察并記錄3 min內大鼠在水中保持漂浮狀態、四肢不動的禁止不動時間。實驗中注意保證同期實驗大鼠之間不可見，以減少干擾。

2.3 Morris水迷宮實驗

造模結束后，對各組大鼠進行水迷宮學習訓練。從同一位置將大鼠面壁放入水中，若60 s內未找到平臺，則牽引至平臺停留30 s，訓練4 d。用以訓練其找到水下平臺（實驗中平臺的位置始終保持不變）。第5天時，將大鼠從適應期同一位置放入水中，記錄其找到水下平臺的時間，記為逃避潛伏期。第6天時，撤離水下平臺，將大鼠放入水中，記錄其在原平臺所在目標象限中的游泳時間。實驗期間需要保持室內安靜，物品放置及燈光狀態一致，水溫（24±1）℃。

2.4 血清中NO、ET-1、5-HT、Glu、GABA、IL-6和TNF-α水平的測定

大鼠麻醉后，腹主動脈采集血液，3000 r/min離心15 min后取上清。按照試劑盒說明書檢測各組大鼠血清中NO、ET-1、5-HT、Glu、GABA、IL-6和TNF-α水平。

2.5 激光斑點對比成像檢測腦血流量

大鼠ip 10%水合氯醛（3.5 mg/kg）麻醉，將其頭部固定于腦立體定位儀上。去除頭皮、皮下結締組織和骨膜，乙醇消毒，隨后使用牙鉆將顱骨輕輕磨薄，直到顯示出內部致密的椎板，硬膜外血管和軟腦膜血管清晰可見，在此過程中使用生理鹽水時刻保持顱骨濕潤。通過激光微循環血流成像儀檢測腦血流量。

2.6 蘇木素-伊紅（HE）染色檢測腦組織病理變化

取4%多聚甲醛固定的腦組織，石蠟包埋，切片（厚4 μm）后進行染色。脫蠟、復水、蘇木素染色、鹽酸乙醇分化、伊紅復染、無水乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。玻片晾干后，顯微鏡下觀察各組大鼠腦組織病理變化。

2.7 普魯士藍（LFB）染色檢測腦組織髓鞘損傷情況

取腦組織石蠟切片（厚4 μm），根據髓鞘染液試劑盒說明書進行操作。脫蠟、水化、染色、分化、脫水、透明，中性樹膠封片。玻片晾干后，顯微鏡下觀察各組大鼠腦組織髓鞘損傷情況。

2.8 TUNEL染色檢測海馬組織細胞凋亡情況

取各組大鼠腦組織，4%多聚甲醛固定30 min，0.25% TritonX-100處理10 min，3% H2O2作用2 min，PBS洗滌3次；加入TUNEL工作液，37 ℃避光孵育1 h；棄去液體，PBS洗滌3次，加入DAPI工作液，室溫避光孵育15 min，于激光共聚焦顯微鏡下觀察各組海馬組織凋亡情況。

2.9 免疫熒光法檢測海馬CA3區中BDNF、Syn和PSD-95蛋白表達

取各組大鼠左側大腦，多聚甲醛固定后進行石蠟包埋并切片，隨后脫蠟和梯度乙醇脫水，以免疫組化筆圈出組織并進行抗原修復，然后用PBS漂洗3次，每次5 min。再用10%牛血清白蛋白封閉30 min，甩掉封閉液，隨后分別在組織上滴加BDNF、Syn、PSD-95抗體，于濕盒內4 ℃過夜。第2天，取出玻片并于室溫平衡10 min，隨后用PBS漂洗4次，每次5 min。輕甩PBS，在組織上滴加二抗，室溫避光孵育1 h。PBS漂洗4次，每次5 min。甩掉PBS，DAPI復染細胞核10 min，再用PBS漂洗3次，每次5 min。隨后用抗熒光猝滅劑進行封片，并于熒光顯微鏡下觀察和采集圖像，分析海馬CA3區中BDNF、Syn及PSD-95的熒光強度。

2.10 統計學分析

3 結果

3.1 健腦解郁方對CSVDD大鼠抑郁樣行為的影響

3.1.1 各組大鼠糖水偏好率 如圖1所示，與對照組比較，模型組大鼠糖水偏好率顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，健腦解郁方高、中劑量組大鼠糖水偏好率均明顯升高（＜0.05），提示CSVDD大鼠存在明顯的快感缺乏癥狀，而健腦解郁方可顯著提高CSVDD模型大鼠對快感的反應，緩解其抑郁癥狀。

3.1.2 各組大鼠自主活動情況 如圖2所示，與對照組比較，模型組大鼠4 min內的水平和垂直活動均顯著降低（＜0.05、0.01），自主活動能力降低；與模型組比較，尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高劑量組大鼠的水平和垂直活動均明顯增加（＜0.05）。

C-對照組 M-模型組 P-尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組 L-健腦解郁方低劑量組 M-健腦解郁方中劑量組 H-健腦解郁方高劑量組 與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001，下圖同

圖2 健腦解郁方對CSVDD大鼠自主活動的影響(, n = 8)

3.1.3 各組大鼠游泳不動時間 如圖3所示，與對照組比較，模型組大鼠游泳不動時間明顯增加（＜0.01）；與模型組比較，尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高劑量組大鼠游泳不動時間均顯著降低（＜0.05）。

3.1.4 各組大鼠學習和記憶能力 如圖4所示，與對照組比較，模型組大鼠逃避潛伏期和目標象限潛伏期均明顯延長（＜0.05、0.01），提示大鼠的學習和記憶能力下降且認知功能發生障礙；與模型組比較，尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高、中劑量組大鼠逃避潛伏期和目標象限潛伏期均顯著縮短（＜0.05、0.01）。

圖3 健腦解郁方對CSVDD大鼠游泳不動時間的影響(, n = 8)

圖4 健腦解郁方對CSVDD大鼠學習和記憶能力的影響(, n = 8)

3.2 健腦解郁方對CSVDD大鼠血管舒縮功能的影響

如圖5所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中NO水平顯著下降（＜0.01），ET-1水平顯著上升（＜0.01）；與模型組比較，尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高、中劑量組血清中NO和ET-1水平均明顯改善（＜0.05、0.01）。

3.3 健腦解郁方對CSVDD大鼠腦血流量的影響

如圖6所示，第5周（BCAS造模后1周）檢測大鼠腦血流量，與對照組比較，其余各組大鼠腦血流量均顯著降低（＜0.01）。給予藥物干預后，與模型組比較，尼莫地平＋丁苯酞組和健腦解郁方高、中劑量組大鼠腦血流量均顯著上升（＜0.05、0.01）。

圖5 健腦解郁方對CSVDD大鼠血清中NO和ET-1水平的影響(, n = 3)

圖6 健腦解郁方對CSVDD大鼠腦血流量的影響(, n = 3)

3.4 健腦解郁方對CSVDD大鼠血清中神經遞質水平的影響

如圖7所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中5-HT和GABA水平顯著下降（＜0.05、0.01），Glu水平顯著上升（＜0.01）；與模型組比較，尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高劑量組血清中GABA水平顯著上升（＜0.05），尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高、中劑量組血清中5-HT水平顯著上升（＜0.05），Glu水平明顯下降（＜0.05）。

圖7 健腦解郁方對CSVDD大鼠血清中5-HT、Glu和GABA水平的影響(, n = 8)

3.5 健腦解郁方對CSVDD大鼠血清中炎癥因子水平的影響

如圖8所示，與對照組比較，模型組血清中IL-6和TNF-α水平顯著上升（＜0.01）；與模型組比較，尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高劑量組IL-6、TNF-α水平顯著下降（＜0.05、0.01）。

3.6 健腦解郁方對CSVDD大鼠海馬CA3區病理變化的影響

如圖9所示，與對照組比較，模型組大鼠海馬CA3區可見明顯的血管周圍間隙擴張，表現為橢圓形或圓形，主要環繞于血管周圍，有較多絲狀物附著，具有透明腔隙；與模型組比較，尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高劑量組海馬CA3區血管周圍間隙擴張情況有所改善，數量減少，無明顯絲狀物附著。

3.7 健腦解郁方對CSVDD大鼠海馬胼胝體區髓鞘結構變化的影響

如圖10所示，對照組大鼠胼胝體內包含致密的深藍色絲狀物延伸，髓鞘藍染清晰，無脫髓鞘改變；模型組胼胝體大面積呈淺藍色，髓鞘著色少而淺，纖維紋理不清，排列疏松，結構紊亂變形，呈空泡或空網狀改變；尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高劑量組胼胝體染色程度及髓鞘結構有所恢復，板層清晰，結構致密，形態完整。

3.8 健腦解郁方對CSVDD大鼠海馬CA3區神經元凋亡的影響

如圖11所示，與對照組比較，模型組大鼠海馬CA3區TUNEL陽性細胞數量明顯增多（＜0.01），呈染色質濃染的典型凋亡特征；與模型組比較，尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高、中劑量組海馬CA3區TUNEL陽性細胞數量顯著下降（＜0.01）。

圖8 健腦解郁方對CSVDD大鼠血清中IL-6和TNF-α水平的影響(, n = 8)

圖9 各組大鼠海馬CA3區病理變化 (HE, ×20)

圖10 各組大鼠胼胝體區髓鞘結構變化(LFB, ×40)

圖11 各組大鼠海馬CA3區神經元凋亡情況(, n = 3)

3.9 健腦解郁方對CSVDD大鼠海馬CA3區BDNF表達的影響

如圖12所示，與對照組比較，模型組大鼠海馬CA3區BDNF表達顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組海馬CA3區BDNF表達均顯著升高（＜0.05、0.01）。

3.10 健腦解郁方對CSVDD大鼠海馬CA3區Syn和PSD-95表達的影響

如圖13所示，與對照組比較，模型組大鼠海馬CA3區Syn和PSD-95陽性表達均顯著降低（＜0.05、0.01）；與模型組比較，尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高劑量組大鼠海馬CA3區PSD-95陽性表達顯著升高（＜0.05、0.01），尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高、中劑量組大鼠海馬CA3區Syn陽性表達顯著升高（＜0.05、0.01）。

圖12 各組大鼠海馬CA3區BDNF表達(, n = 3)

圖13 各組大鼠海馬CA3區Syn和PSD-95表達(, n = 3)

4 討論

根據臨床表現，CSVD可歸屬于中醫“中風”“癡呆”“顫證”“眩暈”等的范疇，抑郁癥歸屬于中醫“郁證”的范疇。CSVD病位在腦，與腎、肝、脾密切相關，乃本虛標實之證。CSVD與抑郁癥互為因果，相兼為病。CSVDD的基本病機可用“虛、瘀、郁”概括，治療當以“補腎健脾、理氣活血、化痰通絡、疏肝解郁”為法。本研究所采用的健腦解郁方由固元健腦方和百事樂方加減而成，方中熟地黃滋陰補腎、益精填髓，用以為君。臣以山茱萸補益肝腎，助君藥補腎固本；山藥脾腎雙補；石菖蒲開竅豁痰、醒神益智；西紅花活血化瘀；姜黃活血行氣，主治血瘀氣滯諸證。佐以貫葉連翹活血解郁；白芍養血柔肝、平抑肝陽；炙甘草調和諸藥，用以為使。全方共奏補腎健脾、理氣活血、化痰通絡、疏肝解郁之功效。

CSVD是指由于各種病因影響腦內小動脈、微動脈、毛細血管、微靜脈和小靜脈所導致的一系列臨床、影像、神經病理綜合征。主要表現為近期皮質下小梗死、腔隙性梗死、白質高信號、血管周圍間隙、微出血和腦萎縮等[10]，其誘發的認知障礙、情緒和活動主動性減少等抑郁癥狀極大地降低了CSVD患者的生存質量及治療效果[11]。高血壓是導致顱內小動脈和小靜脈管壁增厚的主要因素，引起腦內低灌注，進而形成CSVD，同時會增大認知功能損害的風險[12]。研究表明，CSVD發病率與年齡呈正相關，多發于60歲以上人群[1]。其中，67.92%的老年CSVD認知障礙患者患有長期高血壓[13]。研究表明，低灌注會導致腦白質病變，是由深穿支動脈損害引起的慢性缺血。BCAS可在一定程度上減少腦血流，并在頸總動脈及其分支中保持殘余血流量[14]。由此可見，高血壓、衰老及低灌注模型三者聯合作用導致疾病的發生。因此，復合動物模型比單一的軀體應激或藥物刺激更能模擬CSVD的臨床表征。由于CSVDD的發病機制尚不明晰，更進一步滯后了該疾病的早期預防與診斷。既往研究表明，采用不對稱頸總動脈手術創建的CSVD小鼠模型會引發海馬神經元萎縮及核固縮[15]。腦損傷會導致突觸密度降低，神經元結構破壞，神經環路傳遞信息受損，最終導致神經功能損傷[16]。本研究采用-半乳糖（400 mg/kg，8周）聯合BCAS（4周）及CUMS（4周）制備CSVDD大鼠模型，根據行為學評估結果，CSVDD大鼠糖水偏好率和自發活動行為減少，靜止不動時間增加，逃避潛伏期和目標象限潛伏期明顯延長，表現出明顯的認知障礙及情緒低落，而給予高劑量的健腦解郁方治療則可顯著改善模型大鼠認知及情緒障礙。

NO是大腦血管內的神經活性物質，可在不同程度上調節血管張力并輔助細胞間的信息傳遞[17]。ET-1是一種血管收縮肽和血流調節因子，與血管內皮功能有關，研究證實血管內皮功能紊亂是引起腦小血管損傷的重要啟動因子。腦缺血缺氧時，炎癥因子釋放激活血管內皮損傷，導致ET-1釋放增加，誘導腦白質損傷，損傷神經纖維網，引發認知功能損傷[18]。研究表明，CSVD大鼠小動脈中血流量及紅細胞流速均顯著降低[19]。本研究結果顯示，模型組大鼠血清中NO水平顯著下降，ET-1水平顯著上升，而尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高、中劑量組NO水平顯著上升，ET-1水平明顯下降。提示該方可通過調節血管舒縮功能及腦血流量來改善大鼠的抑郁狀態。

動物的體內含有多種神經遞質，單胺類神經遞質5-HT含量是評估抑郁模型的關鍵指標[20]。大腦中大部分突觸是以Glu為遞質的興奮性突觸，在感覺傳遞、運動控制中發揮重要作用，其過度表達可導致神經元損傷及凋亡[21]。GABA則介導腦內的抑制性突觸傳遞，對中樞神經元產生普遍的抑制效果[21]。研究表明，腦內Glu水平的升高及GABA水平的降低與抑郁癥的發病機制相關[22-23]。研究結果顯示，模型組大鼠血清中5-HT、GABA水平顯著下降，Glu水平顯著上升，而健腦解郁方中劑量組5-HT水平顯著上升，尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高劑量組5-HT、GABA水平顯著上升，Glu水平明顯下降。提示該方可通過調節神經內分泌指標的表達來改善大鼠的抑郁狀態。

臨床實驗研究表明，IL-6和TNF-α等炎癥細胞因子水平的升高，會加重血管內皮功能障礙、血腦屏障滲漏及腦白質損傷[24]。抑郁障礙被認為是一種精神神經免疫性失調，其可能是由于炎癥細胞因子作用導致的免疫激活，進而引發神經內分泌系統及免疫系統功能紊亂[25]。本研究結果表明，模型組大鼠血清中IL-6、TNF-α水平顯著上升，而尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高劑量組IL-6、TNF-α水平顯著下降。

海馬是一個具有結構、功能可塑性的關鍵腦區，分為CA1、CA2、CA3、DG 4區，分別由錐體細胞和顆粒細胞形成。CA3區被認為與空間辨別性學習記憶活動的關系尤為密切[26]。血管周圍間隙是指包繞血管或沿血管走形、直徑小于3 mm的間隙，而血管周圍間隙擴大是CSVD腦磁共振成像的影像特征之一，但其病因目前還不完全清楚[27]。模型組大鼠海馬CA3區可見明顯的血管周圍間隙擴張，有較多絲狀物附著，展現出較大的透明腔隙，而健腦解郁方高劑量組可顯著減少血管周圍間隙擴張數量。以上結果表明，高劑量的健腦解郁方可減輕CSVDD大鼠病理損傷，緩解抑郁癥狀。

大腦白質主要由神經元軸突、包裹軸突的髓鞘和膠質細胞組成。髓鞘可支持軸突與外界之間的信息傳導[28]，使神經系統具備快速高效的整合能力，對于認知功能十分重要[29]。胼胝體作為大腦中最大的白質帶，可清晰直觀地進行觀察。LFB結果顯示模型組大鼠胼胝體髓鞘纖維紋理不清，排列疏松，結構紊亂變形，呈空泡或空網狀改變，而健腦解郁方高劑量組明顯改善胼胝體的病理損傷，髓鞘結構有所恢復，板層清晰，結構致密。

突觸是構成神經元之間或神經元與非神經元之間神經網絡的一種特化結構，而突觸可塑性是突觸形態及功能發生改變的特性或現象[7]，海馬突觸可塑性結構和功能的改變與抑郁程度密切相關[30]。BDNF是神經營養因子家族的核心成員，是海馬新突觸發生、改建及傳遞效能等功能的重要調節因子，在突觸可塑性變化中發揮重要作用[31]。臨床研究表明，血清中BDNF水平與CSVD患者的認知功能障礙有關，且與病情嚴重程度相關[32]。Syn是一種突觸前膜囊泡蛋白，在神經遞質的釋放過程中起重要作用，與突觸結構和功能可塑性密切相關，Syn的定量分析可推測突觸的密度和分布[33]。PSD-95是由許多動態的蛋白復合體組成并附著于突觸后膜，可維持突觸連接，調控樹突棘形態及突出功能。本研究結果表明，模型大鼠海馬CA3區BDNF、Syn和PSD-95的表達水平明顯下調，而給予尼莫地平＋丁苯酞＋氟西汀組和健腦解郁方高劑量治療后，海馬CA3區BDNF、Syn和PSD-95的表達水平顯著升高，說明健腦解郁方可通過上調CSVDD大鼠海馬CA3區BDNF、Syn和PSD-95的表達改善突觸可塑性障礙，達到抗抑郁的療效。

本研究以尼莫地平、丁苯酞聯合氟西汀為陽性對照藥物，通過-半乳糖（400 mg/kg，8周）聯合BCAS和CUMS制備CSVDD大鼠模型，評估大鼠認知功能及情緒變化，檢測血清中神經遞質5-HT、Glu、GABA及炎癥因子IL-6、TNF-α水平，觀察腦組織海馬CA3區血管周圍間隙病變及胼胝體髓鞘損傷情況，檢測海馬CA3區神經元凋亡數量和BDNF、Syn、PSD-95蛋白表達。結果顯示，健腦解郁方高劑量可改善模型大鼠認知、情緒障礙，提升血清中5-HT、GABA水平及降低Glu水平，減輕海馬血管周圍間隙擴大及胼胝體髓鞘損傷，減少海馬CA3區神經元凋亡并上調BDNF、Syn、PSD-95蛋白表達。

綜上，鑒于海馬突觸可塑性對神經功能的調控作用，結合本研究的結果，推測健腦解郁方可能通過促進海馬突觸可塑性，提升神經細胞營養供給，降低海馬神經元凋亡，以此改善腦組織海馬及白質區域病理損傷，調節神經內分泌指標的表達，改善CSVDD模型大鼠認知及情緒障礙。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of Jiannao Jieyu Formula on hippocampal synaptic plasticity in rats with cerebral small vessel disease related with depression

DAI Ling1, LUO Yan2, HOU Guang-han3, WANG Le2, LI Huan2, MENG Pan2

1. School of Pharmacy, Hunan Vocational College of Science and Technology, Changsha 410200, China 2.Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 3. The Forth Hospital of Changsha, Changsha 410200, China

To explore the intervention effect and mechanism of Jiannao Jieyu Formula (健腦解郁方) on hippocampal synaptic plasticity in rats with cerebral small vessel disease related with depression (CSVDD).Forty SHR rats were divided into model group, nimodipine (21.6 mg/kg) + butylphthalide (54 mg/kg) + flouxetine (5.4 mg/kg) group, Jiannao Jieyu Formula high-, medium-, low-dose (28.08, 14.04, 7.02 g/kg) groups, with eight rats in each group, and eight WKY rats were taken as control group. The rats were sc-galactose (400 mg/kg) on backs for eight weeks, combined with bilateral common carotid stenosis (BCAS) for four weeks and chronic unpredicted mild stress (CUMS) for four weeks to establish CSVDD model. The depression-like behavior of rats was evaluated by sugar water preference rate test, open field test, forced swimming test and water maze test; ELISA was used to detect nitric oxide (NO), endothelin-1 (ET-1), 5-hydroxytryptamine (5-HT), glutamate (Glu), γ-aminobutyric acid (GABA), interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) levels in serum of rats; Cerebral blood flow was observed by laser microcirculation blood flow imaging instrument; Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the perivascular space in CA3 area of hippocampus; The pathological changes of corpus callosum in white matter of rats were observed by Prussian blue (LFB) staining; TUNEL method was used to detect neuronal apoptosis in CA3 region of hippocampus; Immunofluorescence method was used to detect the expressions of brain-derived neurotrophic factor (BDNF), synaptophysin (Syn) and post synaptic density-95 (PSD-95) in CA3 region of hippocampus.Compared with model group, preference rate of sugar water in Jiannao Jieyu Formula group was significantly increased (< 0.05), autonomous activity was significantly increased (< 0.05), swimming immobility time was significantly reduced (< 0.05), and the escape latency and target quadrant latency were significantly shortened (< 0.05, 0.01). Cerebral blood flow was significantly increased (< 0.05, 0.01). The levels of 5-HT and GABA in serum were significantly increased (< 0.05), while the levels of NO, ET-1, Glu, IL-6 and TNF-α were significantly decreased (< 0.05, 0.01). The number of enlarged perivascular spaces in CA3 area of hippocampus was decreased, pathological damage and myelin sheath damage of corpus callosum were decreased. The number of apoptotic neurons in hippocampal CA3 area was significantly decreased (< 0.01), and the expressions of BDNF, Syn and PSD-95 were significantly increased (< 0.05, 0.01).Jiannao Jieyu Formula may improve the pathological damage in hippocampus and white matter area of brain tissue, regulate the expression of neuroendocrine indicators, and improve the cognitive and emotional disorders of CSVDD model rats by promoting the synaptic plasticity of the hippocampus, enhancing the nutrition supply of nerve cells, and reducing the apoptosis of hippocampal neurons.

Jiannao Jieyu Formula; cerebral small vessel disease related with depression; neuroplasticity; apoptosis; neuroendocrine; paeoniflorin; rehmannioside A; hypericin; crocin I; morroniside

R285.5

A

0253 - 2670(2023)18 - 5968 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.18.015

2023-04-26

長沙市杰出創新青年培養計劃項目（kq2009018）；湖南省教育廳科學研究項目（21C1190）；湖南省中醫藥科研課題（B2023021）；長沙市自然科學基金資助項目（kq2208471）；湖南省自然科學基金部門聯合項目（2023JJ60213）

戴 玲（1988—），女，碩士，講師，主要從事中藥藥理活性及中藥化學成分研究。Tel: 15874954751 E-mail: dailing-1988@163.com

孟 盼，女，博士，副研究員，主要從事神經精神疾病的機制研究及防治。E-mail: 403642392@qq.com

[責任編輯 李亞楠]