基于AFLP分子標記的我國不同生態栽培產區枸杞資源遺傳多樣性分析

張 芳，陸瑞華，傅煥哲，張文華，李 重，任 鋼，陳占平，趙玉玲，郭 盛，錢大瑋，段金廒*

基于AFLP分子標記的我國不同生態栽培產區枸杞資源遺傳多樣性分析

張 芳1，陸瑞華1，傅煥哲1，張文華2，李 重2，任 鋼3，陳占平3，趙玉玲4，郭 盛1，錢大瑋1，段金廒1*

1. 南京中醫藥大學藥學院，江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心/中藥資源產業化與方劑創新藥物國家地方聯合工程研究中心，江蘇 南京 210023 2. 寧夏百瑞源枸杞股份有限公司，寧夏 銀川 750200 3. 青海省海西蒙古族藏族自治州農業科學研究所，青海 德令哈 817000 4. 新疆維吾爾自治區博爾塔拉蒙古自治州精河縣枸杞產業發展中心，新疆 博爾塔拉 833399

利用熒光標記輔助的擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）技術，從基因組DNA水平上分析我國6個栽培生產區域52份枸杞樣本的遺傳多樣性。對提取的枸杞DNA樣本進行酶切、連接、預擴增和選擴增等步驟，擴增產物經毛細管電泳系統分離和數據采集后，利用Popgene軟件計算遺傳多樣性參數，利用GenAlex軟件計算遺傳距離并進行主坐標分析，利用MEGA-X軟件根據遺傳距離進行聚類分析，利用Structure軟件進行群體遺傳結構分析。共篩選得到10對AFLP選擇性擴增引物組合，擴增得到328條擴增片段，其中多態性片段121條，且在不同產地枸杞居群間多態性位點分布不均勻。分析顯示不同栽培產區枸杞的遺傳多樣性較低，等位基因數（observed number of alleles，a）、有效等位基因數（effective number of alleles，e）、觀測雜合度（Nei’s gene diversity，）和香濃信息指數（Shannon information index，）分別為1.438 0、1.231 6、0.140 7和0.215 2，Nei’s遺傳相似性范圍為0.835 4～0.890 2。不同栽培生產區域的枸杞居群間存在較為頻繁的基因交流，遺傳分化程度中等。居群內部遺傳變異是枸杞遺傳變異的主要來源，居群間遺傳變異不顯著，同時遺傳距離與地理距離沒有明顯相關性。可為枸杞的遺傳背景信息積累、引種栽培、種質資源保護、核心種質庫構建以及可持續開發策略的制定和管理提供科學依據。

枸杞屬；擴增片段長度多態性；種質資源；遺傳多樣性；栽培生產區域

遺傳多樣性是指種內不同群體或同一群體不同個體之間通過長期進化積累的遺傳變異的總和，是該物種在自然壓力下適應外部復雜環境變化、維持生存和進化潛力的物質基礎，也是評價物種生物多樣性、生物資源狀況的重要指標[1]。在適應生存環境變化的過程中，一個物種（或群體）的遺傳多樣性越豐富，表明環境適應能力、生存能力和進化潛力越強，越容易開拓新的生長環境并擴展自然分布范圍。相反，低水平的遺傳多樣性往往伴隨遺傳雜合度降低和近交衰退，并進一步制約物種或種群的環境變化適應能力和進化潛能，增加種群滅絕的風險[2]。

DNA分子標記技術已成為分析遺傳多樣性時必不可少的手段，主要包括基于Southen雜交的限制性內切酶片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）標記技術，基于PCR的隨機擴增多態性（random amplified polymorphism，RAPD）標記技術、簡單重復序列（simple sequence repeats，SSR）標記技術和簡單重復序列間區（inter-simple sequence repeat，ISSR）標記技術、相關序列擴增多態性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）標記技術[3-4]，以及基于PCR與限制性酶切技術結合的分子標記，如擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）標記技術和酶切擴增多態性序列（cleaved amplified polymorphic sequences，CAPS）標記技術[5]。這些標記技術各有優勢，其中AFLP技術是基于限制性酶切和PCR擴增的全基因組DNA擴增片段長度多態性檢測方法[6]。AFLP技術擴增結果穩定，標記多態性條帶比例高，獲得信息量大，不受物種基因組來源、復雜程度和環境條件的影響，尤其適用于遺傳背景模糊、材料來源廣泛的物種遺傳資源的標記分析，是進行種質資源遺傳多樣性和遺傳結構研究的最為有效的分子標記技術之一，目前已在多種動植物資源的遺傳圖譜構建、種質資源鑒定和評價、遺傳多樣性分析、遺傳變異規律分析及品種家系分析等領域得到廣泛應用。近年來，AFLP技術逐漸引入中藥資源研究領域，并在薏苡[7]、忍冬[8]、烏頭[9]、厚樸[10]、三葉木通[11]等中藥材的遺傳多樣性分析中發揮了重要作用。

枸杞是茄科（Solanaceae）枸杞屬L.多年生多分枝落葉灌木，是我國重要的藥食兩用植物資源，其果實枸杞子早在《神農本草經》已被列為上品。枸杞屬植物約有80余種，我國有7個種和2個變種[12]，自然分布于我國西北干旱地區溫帶荒漠區域和溫帶草原區域。枸杞對惡劣環境適應能力強，具有較強的抗旱耐寒耐鹽堿特性。近年來，我國枸杞的引種栽培產業十分活躍，核心產區由寧夏回族自治區逐步向外輻射至我國新疆、青海、甘肅、內蒙等省區，多數品種（系）在不同區域均有種植。在長期的自然演化、資源交流、地理隔離、遺傳漂變和人工選育等多種因素共同作用下，枸杞的基因型高度雜合，遺傳背景復雜，表型變異豐富，同物異名或同名異物現象普遍。

目前有關我國枸杞資源地理分布范圍內遺傳多樣性水平和遺傳結構變異領域的研究較為缺少。尹躍等[13]建立和優化了枸杞的SRAP反應體系，唐燕等[14]對寧夏中寧縣26份枸杞屬種質資源的27個表型性狀進行分析后發現，供試種質的遺傳多樣性較為豐富，李彥龍等[15]采用AFLP技術對寧夏銀川地區的15份枸杞進行分析，發現不同品種的枸杞樣本之間遺傳多樣性較為豐富，任重等[16]采用SSR分子標記，發現紅果枸杞栽培品種之間遺傳差異較小，鮑紅春等[17]利用ISSR技術對10個枸杞品種的遺傳差異進行研究，發現寧夏地區和內蒙古地區的枸杞品系存在較大差異，但種群內部遺傳相似性較高。余意等[18]采用SSR技術分析我國4個省區17個栽培寧夏枸杞居群的178個個體樣本后，發現栽培已經引起枸杞遺傳多樣性明顯下降。

本研究收集了我國6個主要生產栽培產區的52份枸杞樣本，借助熒光標記輔助的毛細管電泳檢測技術，建立基于枸杞全基因組遺傳多樣性特征的AFLP分析技術體系，從基因組DNA分子水平上分析枸杞主要生態產區不同栽培品系的遺傳多樣性和遺傳結構差異，以充分了解和掌握其遺傳多樣性和遺傳特征信息及親緣關系，為枸杞的遺傳背景信息積累、引種栽培、種質資源保護、種質創新、核心種質庫構建以及可持續開發策略的制定和管理提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ABI3730xl毛細管電泳系統（美國Applied Biosystems公司）；PowerPac HC高電流電泳儀及Mini-Sub Cell DT電泳系統（美國BIO-RAD公司）；C1000 Touch PCR儀（美國BIO-RAD公司）；ChemiDoc XRS+化學發光凝膠成像系統（美國BIO-RAD公司）；Nano Drop 2000c型微量核酸檢測儀（美國Thermo Scientific公司），MicroCL 21R微量離心機（美國Thermo Scientific公司）。

1.2 材料

供試樣本52個（表1），由本課題組于2019年7月至2019年8月采集自我國枸杞的主要栽培產區寧夏銀川平原（15株，海拔1126 m，38°40′ N，106°03′ E）、新疆維吾爾自治區博爾塔拉蒙古自治州精河縣（11株，海拔320 m，44°36′ N，82°54′ E）、甘肅省酒泉市玉門市（7個，海拔1517 m，40°18′ N，97°24′ E）、甘肅省白銀市靖遠縣（4株，海拔1406 m，36°36′ N，104°44′ E）、青海省海西州德令哈市（4株，海拔2996 m，37°23′ N，97°22′ E）、內蒙古自治區巴彥淖爾市（11株，海拔1034 m，40°58′ N，107°00′ E）。采集時選取生長旺盛的成年單株盛果期植株，采集從上至下第5對健康、無病蟲的展開葉片，用蒸餾水沖洗表面并用濾紙干燥后迅速放入帶有標簽的自封袋中，干冰保存運輸。所有樣品由南京中醫藥大學段金廒教授鑒定為茄科枸杞屬植物枸杞.的葉。

表1 供試樣品信息

Table 1 Sample information

序號樣品名稱采集地序號樣品名稱采集地 1寧農杞2號寧夏銀川27短日照寧杞1號甘肅玉門 2寧農杞9號寧夏銀川28未知種甘肅玉門 3寧杞2號寧夏銀川29寧杞5號甘肅玉門 4菜用枸杞寧夏銀川30玉門未知種甘肅玉門 5中科綠川1號寧夏銀川31寧杞5號甘肅玉門 6珍珠枸杞寧夏銀川32寧杞1號甘肅玉門 7寧杞5號寧夏銀川33寧杞1號甘肅玉門 8蒙杞1號寧夏銀川34蒙杞1號甘肅靖遠 9中華枸杞寧夏銀川35靖遠寧杞7號甘肅靖遠 10寧杞7號寧夏銀川36寧杞5號甘肅靖遠 11中科黃果1號寧夏銀川37寧杞1號甘肅靖遠 12黃果枸杞寧夏銀川38寧杞5號青海德令哈 13黑枸杞寧夏銀川39寧杞1號5年青海德令哈 14寧杞1號寧夏銀川40寧杞7號青海德令哈 15寧杞1號寧夏銀川41寧杞1號青海德令哈 16蒙杞1號新疆精河42科杞608內蒙古巴彥淖爾 17寧杞1號新疆精河43中科綠川1號內蒙古巴彥淖爾 18精河枸杞4號新疆精河44寧杞7號內蒙古巴彥淖爾 19精河枸杞5號新疆精河45寧杞2號內蒙古巴彥淖爾 20寧農杞4號新疆精河46寧杞9號內蒙古巴彥淖爾 21寧杞3號新疆精河47寧杞10號內蒙古巴彥淖爾 22寧杞7號新疆精河48蒙杞1號內蒙古巴彥淖爾 23寧杞5號新疆精河49當地品種內蒙古巴彥淖爾 24寧農杞5號新疆精河50寧杞5號內蒙古巴彥淖爾 25寧農杞1號新疆精河51寧杞4號內蒙古巴彥淖爾 26寧杞1號新疆精河52寧杞1號內蒙古巴彥淖爾

1.3 試劑

限制性內切酶I和I購自New England BioLabs公司；DNA連接酶DNA Ligation Kit＜Mighty Mix＞和DNA聚合酶TMHot Start Version，DNA Marker DL5 000和DL15 000均購自TaKaRa公司；擴增引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；羥基熒光素（5’-FAM）修飾引物由北京睿博興科生物科技有限公司合成；其余試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 樣品DNA提取

取各地樣品約100 mg，采用改良的CTAB法進行基因組總DNA的提取，具體方法參考本課題組前期報道[19]，取1 μL DNA用Nano Drop 2000c微量核酸蛋白檢測儀檢測DNA的質量和濃度，260/280比值應在1.7～1.9；另取瓊脂糖電泳另取5 μL DNA樣品進行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀下觀察，檢測DNA的完整性和純度。

2.2 AFLP體系建立與分析

2.2.1 酶切和連接體系

（1）酶切：DNA樣品分別用I與I進行酶切：酶切反應體系25 μL，包括DNA 300 ng，I和I各15 IU，酶切緩沖液CutSmart 2.5 μL，補ddH2O至25 μL，37 ℃水浴酶切10 h，65 ℃滅活20 min。

（2）連接反應：根據接頭引物表（表2），將I單鏈接頭和I單鏈接頭分別稀釋后變性并退火形成雙鏈接頭。連接反應體系25 μL，包括5 μL酶切產物，7.5 μmol/L雙鏈接頭，1U DNA連接酶，16 ℃連接過夜。

（3）預擴增反應：預擴增反應體系25 μL，包括2 μL稀釋后連接產物，1 UHS DNA聚合酶，1 μL dNTP （2.5 mmol/L），5 μmol/LE00和M00預擴增引物（表2）。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸15 min。

（4）選擇性擴增反應：選擇性擴增反應體系25 μL，包括1.5 μL稀釋后預擴增產物，1 U DNA聚合酶，2 μL dNTP （2.5 mmol/L），5 μmol/LI選擇性擴增引物，1.5 μmol/LI選擇性擴增引物。PCR反應條件分為3個階段：第1階段為13個循環，94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，65 ℃退火（每個循環退火溫度遞減1 ℃），72 ℃延伸1 min；第2階段為23個普通PCR循環，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；最后階段72 ℃延伸10 min。選擇性擴增完成后，根據瓊脂糖電泳結果篩選特異性條帶清晰且數量適宜的引物對。

2.2.2 毛細管電泳檢測 根據選擇性擴增引物篩選結果，運用熒光標記技術在篩選出的引物對中對I引物序列末端進行5’-FAM熒光標記，并根據已建立的酶切、連接及PCR擴增反應體系完成所有樣本的選擇性擴增，PCR產物用ABI 3730xl毛細管電泳系統進行分離，采用激光誘導熒光采集數據。電泳結果在Gene marker 2.2.0軟件中進行可視化處理，獲得多態性DNA片段電泳圖譜及掃描峰圖。

2.3 遺傳多樣性數據分析

2.3.1 電泳結果矩陣轉換 使用Gene marker 2.2.0 軟件電泳峰值圖進行掃描和判讀，選取大小在50～500 bp的片段進行統計，同一遷移位置有表征片段位點記為“1”，無表征片段位點記為“0”，進行結果“0/1”賦值并構建多態性位點“0/1”矩陣。

表2 接頭和引物序列信息

Table 2 Sequence information of adaptors and primers

接頭與引物EcoR I (5’-3’)Mse I (5’-3’) 接頭ICTCGTAGACTGCGTACCGACGATGAGTCCTGAG 接頭IIAATTGGTACGCAGTCTACTACTCAGGACTCAT 預擴引物GACTGCGTACCAATTC（E00）GATGAGTCCTGAGTAAC（M00）

2.3.2 遺傳多樣性數據計算 利用Popgene 32軟件計算多態性位點數（number of polymorphic loic，）、多態性位點百分比（percentage of polymorphic loic，）、觀測等位基因數（observed number of alleles，a）、有效等位基因數（effective number of alleles，e）、Nei’s基因多樣性指數（Nei’s gene diversity，）、香農多樣性信息指數（Shannon information index，）、總基因多態性（t）、群體內基因多態性（s）、遺傳分化指數（st）、基因流（estimate of gene flow fromst，m），以及各居群間遺傳距離（genetic distance）和遺傳相似性，分析居群內和居群間的遺傳變異分布。利用Arlequin V3.5.2.2軟件進行分子方差分析（analysis of molecular variance，AMOVA）計算遺傳變異在各產地居群間及居群內所占百分比。

2.3.3 主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）、遺傳距離與地理距離相關性分析 利用GenAlex 6.502軟件計算個體間遺傳距離并進行PCoA，根據降維處理的信息評估遺傳多樣性的分化。采用MEGA-X軟件根據遺傳距離進行個體間的非加權組成配對法（unweighted pair group method analysis，UPGMA）聚類分析并構建聚類圖。根據GenAlex 6.502軟件根據各栽培產區的經緯度計算各產區之間的地理距離，并進行所有枸杞樣本地理距離與遺傳距離的相關性分析。

2.3.4 群體遺傳結構分析 利用Structure V2.3.4進行基于貝葉斯算法的樣本來源判斷，以反映群體的遺傳結構。設定群組數（）為2～10，每個重復10次模擬運算，MCMC重抽樣設為10 000，分析結果導入在線工具Structure Harvester （http://taylor0. biology. ucla.edu/structureHarvester/）計算預測最優居群數，然后利用Distruct 1.1軟件生成枸杞遺傳結構條形堆積圖。

3 結果與分析

3.1 枸杞AFLP體系建立

用＋I組合后對枸杞基因組DNA進行酶切，圖1-a和圖1-b分別是酶切后和預擴增后的代表性電泳圖譜，可見經雙酶切后原基因組DNA主條帶消失，在原主帶下方出現均勻彌散帶，經酶切產物進行預擴增后，PCR產物在500 bp以下區域形成連續的均勻彌散帶，在高相對分子質量區無擴增產物，表明DNA消化徹底，預擴增結果合理，符合AFLP選擇性擴增的要求。

圖1-c為代表性選擇性擴增圖譜，共設計了10個I選擴引物和9個I選擴引物，組合后得到90對選擴引物組合，根據選擴圖譜，從中篩選出10對選擴譜帶清晰、數量適宜、多樣性位點豐富的10對選擴引物對，10對選擴引物及其序列見表3。

3.2 選擴條帶的多態性分析及遺傳多樣性分析

圖2為代表性DNA擴增片段電泳圖譜及掃描峰圖，對特征性條帶進行“0/1”賦值并轉換為數據矩陣用于遺傳多樣性分析。

圖1 枸杞基因組DNA酶切(a)、預擴增(b) 及選擇性擴增(c) 后瓊脂糖電泳圖譜

表3 選擇性擴增引物組合

Table 3 Selective amplification primers

編號EcoRI (5’-3’)MseI (5’-3’) p1GACTGCGTACCAATTCACCGATGAGTCCTGAGTAACAC p2GACTGCGTACCAATTCACCGATGAGTCCTGAGTAACAA p3GACTGCGTACCAATTCACCGATGAGTCCTGAGTAACTA p4GACTGCGTACCAATTCACGGATGAGTCCTGAGTAACCA p5GACTGCGTACCAATTCAGGGATGAGTCCTGAGTAACTT p6GACTGCGTACCAATTCAGGGATGAGTCCTGAGTAACCA p7GACTGCGTACCAATTCAGCGATGAGTCCTGAGTAACTT p8GACTGCGTACCAATTCAGCGATGAGTCCTGAGTAACCA p9GACTGCGTACCAATTCAGAGATGAGTCCTGAGTAACTA p10GACTGCGTACCAATTCAACGATGAGTCCTGAGTAACCA

圖2 枸杞DNA的AFLP分析選擇性擴增代表性電泳圖譜(a) 及掃描峰圖(b)

篩選后的10對選擴引物組合對6個不同產區52個枸杞DNA參試樣本進行擴增，結果見表4。結果表明，在50～500 bp共擴增出328條選擇性擴增片段，其中多態性片段121條，在不同產地枸杞居群多態性位點分布不均勻，各居群枸杞多態性位點百分比為25.30%～71.65%，平均為60.32%，說明本研究篩選出的選擴引物和建立的AFLP標記方法在參試枸杞樣本中檢測到較為豐富的多態性，適于分析其遺傳多樣性和遺傳結構分析。

不同居群枸杞的a變化范圍為1.253 0～1.716 5，平均為1.438 0，e變化范圍為1.276 2～1.481 8，平均為1.231 6。各居群內部a略高于e，表明各居群中等位基因的分布較為均勻，遺傳差異較小，但存在有效種群規模變小和有效等位基因丟失的情況。同時，不同居群間的a和e的變化范圍較小，說明我國不同生態產區的枸杞居群間存在著一定的遺傳差異性，但差異程度較低。變化范圍為0.105 9～0.166 6，平均為0.140 7。范圍為0.153 9～0.273 8，平均為0.215 2，呈現出一定的遺傳異質性但是水平較低、遺傳同質性較高的多樣性特點，說明我國枸杞種質的遺傳基礎較為狹窄，遺傳多樣性不顯著。其中寧夏銀川居群內部多樣性相對較高，群內遺傳分化處于相對較高水平，與寧夏地區作為我國主要的枸杞引種起源中心的實際情況相一致。

表4 不同栽培生產區域枸杞居群間的遺傳多樣性指數

Table 4 Genetic diversity of different populations of L. chinense

產地APP/%NaNeHI 寧夏銀川（n＝15）23571.651.716 5±0.451 41.248 8±0.276 60.166 6±0.150 80.273 8±0.217 6 新疆精河（n＝11）14544.211.442 1±0.497 41.224 7±0.317 00.138 3±0.177 40.213 1±0.260 1 甘肅玉門（n＝7）12638.411.384 1±0.487 11.220 8±0.330 00.132 7±0.181 60.200 9±0.266 1 甘肅靖遠（n＝4） 8325.301.253 0±0.435 41.187 2±0.336 10.105 9±0.184 80.153 9±0.266 6 青海德令哈（n＝4）10933.231.332 3±0.471 81.231 1±0.342 50.134 5±0.193 40.197 2±0.281 9 內蒙古巴彥淖爾（n＝11）16450.001.500 0±0.500 81.277 0±0.348 10.166 1±0.189 50.252 4±0.274 3 群體間12136.891.368 9±0.483 21.240 1±0.350 20.140 1±0.192 40.207 8±0.279 5

3.3 群體變異的AMOVA分析

由表5所示的枸杞居群AMOVA分析結果表明，不同居群的枸杞居群間存在一定程度的遺傳分化。在總的遺傳變異中，不同栽培生產區域的各居群間的變異僅有6.09%，居群內的變異率為93.91%，居群內部的遺傳變異率遠大于不同產地間居群間的變異率，說明居群內部變異是枸杞居群變異的主要來源，這與前述遺傳多樣性的分析結果相一致。

表5 不同栽培生產區域枸杞居群的分子方差分析（AMOVA）

Table 5 Molecular variance analysis (AMOVA) among different populations of L. chinense

變異來源自由度平方和方差分量變異百分率/% 居群間 5 47.1700.294 72 6.09 居群內98445.5234.546 15 93.91

3.4 遺傳分化分析

基因多樣性是衡量遺傳多樣性的重要指標。從遺傳分化數據來看，6個不同栽培生產區域居群枸杞的t為0.123 1，居群內部s為0.106 2，占86.27%。居群間st為0.137 4，呈現中等程度的遺傳分化。m為3.140 3，說明不同栽培生態產區各居群間基因交流和滲透較為充分，在一定程度上降低了居群間遺傳分化現象的發生。總遺傳多樣性僅有13.74%來源于居群間遺傳變異，進一步驗證群內遺傳分化是枸杞遺傳多樣性的主要因素。

如表6所示，枸杞6個居群的Nei’s遺傳相似性在范圍為0.835 4～0.890 2，遺傳距離范圍為0.116 3～0.183 5，各居群間遺傳相似性較高。如寧夏銀川與新疆精河實際地理距離較遠，間隔2000多km，但兩地枸杞群體間仍具有高度的遺傳相似性（0.887 2）和較小的遺傳距離（0.119 7），說明這2個居群間親緣關系接近，群間變異較小。

3.5 PCoA和聚類分析

以每一個樣本名為觀測指標，進一步對6個不同栽培生產區域的52份枸杞樣本進行PCoA，并構建可視化二維平面圖，分析所有樣本的整體分布趨勢和自然聚集預覽，同時采用UPGMA法根據遺傳距離構建遺傳關系聚類圖。

由圖3-a所示PCoA圖可見，除寧夏產區枸杞樣本在第一主成分上主要分布在第一和第四象限外，其他所有樣本分區不明顯，6個居群的樣本間存在大量重疊，沒有形成明顯的分離群體。類似地，根據遺傳距離構建的UPGMA聚類圖（圖3-b）中，各栽培生產區域的52份枸杞參試樣本沒有明顯的區域趨勢和特征，地理距離較近的居群沒有優先聚在一起，而是分布在整個聚類圖中。還可發現，不同產地的同一品種，如寧杞1號、寧杞5號、寧杞7號等，也沒有聚為一簇，而是分散在整個聚類結果中。同時，同一聚類分支中的材料品種和地域分布規律性不明顯，有來自于同一地區的，也有來自于不同區域的，有相同品種，也有不同品種，由此形成了相對復雜的遺傳關系。這些結果進一步驗證了前述遺傳多樣性和遺傳分化的結果，在一定程度上反映出各產地間枸杞居群存在頻繁的基因交流，不同栽培產區居群間的地理隔離和遺傳分化不明顯，導致各地枸杞樣本間均質化程度較為嚴重，存在明顯的種質混雜現象。

3.6 群體遺傳結構分析

根據在線軟件Structure Harvester的計算結果，當=6時，Δ值最低（Δ＝0），此時居群劃分結果符合本研究的枸杞居群實際分布情況。Δ值達到最大時，對應的模擬最優群體數＝7，表明本研究中來自不同栽培生產區域的52個枸杞個體DNA樣本按照基因型可以分為7種類型，因此在＝7的模式下分析所有枸杞樣本的群體遺傳結構。從圖4-a可以看出，所有參試枸杞樣本沒有按照地理居群形成明顯的分區，不同基因型在各栽培產區居群中均有分布，資源雜合度較高。各產區均有一定數量的單一基因型樣本，其中青海德令哈居群單一基因型的比例較高。當按照基因型進行分類時（圖4-b），相似的遺傳結構類別不具有明顯的地理居群特征，各產區樣本在不同遺傳結構類別中均有分布，同時相同的品種也沒有集中排列在遺傳結構相似的類別中。

表6 成對的不同栽培生產區域枸杞居群間的遺傳相似性和遺傳距離

Table 6 Pairwise genetic identity values and genetic distance among different populations of L. chinense

產地寧夏銀川新疆精河甘肅玉門甘肅靖遠青海德令哈內蒙古巴彥淖爾 寧夏銀川****0.887 20.832 30.853 70.850 60.872 0 新疆精河0.119 7****0.841 50.868 90.835 40.887 2 甘肅玉門0.183 50.172 6****0.881 10.872 00.862 8 甘肅靖遠0.158 20.140 50.126 6****0.868 90.890 2 青海德令哈0.161 80.179 90.137 00.140 5****0.844 5 內蒙古巴彥淖爾0.137 00.119 70.147 60.116 30.169 0****

Nei’s遺傳相似性（上三角）和遺傳距離（下三角）

Nei’s genetic identity(above diagonal) and genetic distance (below diagonal)

圖3 不同栽培生產區域枸杞樣本間PCoA模型得分散點圖(a)和聚類圖(b)

圖4 按照產區排列(a) 和按照遺傳結構相似性排列(b)對不同栽培生產區域枸杞樣本遺傳結構分析

3.7 遺傳距離與地理距離相關性分析

為了解居群遺傳距離和實際地理距離間是否存在相關性，進行群體配對遺傳分化和地理距離的Mantel分析（圖5）。結果顯示相關系為＝?0.131（＝0.270），表明我國各產區枸杞居群間遺傳距離與地理距離沒有顯著的相關性，地理距離在枸杞遺傳分化中的作用不明顯，說明居群間基因交流充分，尚未形成明顯的離群群體。

圖5 不同栽培生產區域枸杞居群間遺傳距離與地理距離相關性

4 討論

枸杞在我國有著悠久的應用歷史。早在兩千多年前，《小雅·北山》中就有“陟彼北山，言采其杞”的記載。“神草如蓬世不知，壁間墻角自離離。”野生枸杞自秦漢起開始在民間移植栽種，唐代《千金翼方》中已系統記載了寧夏枸杞的栽培方法[19-20]。寧夏回族自治區是寧夏枸杞的道地產區，所產枸杞子品質上乘，作用廣泛而溫和，符合“治未病”的健康新模式，不但作為常用大宗藥材在臨床上發揮重要作用，在民間也有具有極高的認同感和接受度。近年來，隨著枸杞子消費市場的持續擴大，我國枸杞栽培地域和面積擴展迅速，在我國寧夏、內蒙、甘肅、青海及新疆等已建成大規模枸杞規范化種植基地，為枸杞的產業化應用提供了良好的生產環境，緩解了枸杞子供應的市場壓力，也成為各地發展高效農業和精準扶貧的重要抓手。然而，為滿足終端市場對于枸杞子高產、形優等經濟性狀需求而進行的人工定向選育，使栽培枸杞的遺傳多樣性逐步下降，如我國各產區枸杞主流栽培品種均以寧杞5號和寧杞7號為主。同時，枸杞是風媒和蟲媒同株異序或異株授粉植物，其種子主要依靠鳥類和嚙齒類動物傳播，使處于較遠地理距離的不同居群間保持合理的基因流動，提高居群間遺傳多樣性，從而促使群內個體發展出更強的適應能力，同時也為創新育種提供更加充裕的資源。然而，發達便利的現代化交通運輸，極大地弱化了地理距離帶來的阻隔效應，促進了各栽培生產區域間枸杞種質的頻繁交流，人為加大了基因流并引起居群內和居群間的種質混雜和均質化。此外，枸杞植株壽命長、自然更新緩慢，加之現代化枸杞種植產業精耕細作，減輕了枸杞野外自然生長環境中的多種逆境脅迫效應，在一定程度上降低了枸杞的遺傳多樣性。

較低的遺傳多樣性一方面利于保持藥材基原和品質，但另一方面也會由于種質退化而導致耐逆性和穩定性逐漸減弱，不利于物種的延續和進化。因此，為積累豐富的枸杞遺傳多樣性種質資源，發揮其多方面的潛在優勢，在開展枸杞人工種植擴大資源產量、保證供給的同時，加強種質資源保護，根據枸杞生長發育規律和對生長環境條件的要求，模擬原始生態環境進行擬態種植，保障種植枸杞與原產道地枸杞藥效相當，是推動我國枸杞產業可持續和高質量發展的必經之路。

本研究采用熒光標記輔助AFLP技術，篩選出10對選擴引物，對來自我國6個枸杞栽培生產區域的52份枸杞材料進行選擇性擴增得到328條擴增條帶，并根據擴增條帶多態性結果判斷各DNA樣本之間的遺傳多樣性。結果顯示，我國不同生產栽培區域的枸杞居群間存在頻繁的基因流，各樣本遺傳多樣性較低，存在較高的遺傳均質化現象。本研究結果與余意等[18]通過微衛星序列進行的我國栽培枸杞遺傳多樣性結果一致。相反的，唐燕等[14]、李彥龍等[15]分別通過表型分析和AFLP進行的研究則表明我國枸杞具有較為豐富的遺傳多樣性，得到與本研究相反的結論，這種差異可能是由于使用的分子標記及樣本采集差異造成的。

本研究供試樣本同期進行了基于甲基化敏感擴增多態性技術（methylation-sensitive amplified polymorphism，MSAP）的基因組DNA甲基化水平和模式多樣性的差異分析，發現不同栽培生產區域所有樣本中非甲基化敏感性位點展示出較低的遺傳多樣性，這與本研究結果相一致。與此形成鮮明對比的是，甲基化敏感性位點表現出較高的表觀遺傳多樣性和產地內部方差，說明在遺傳背景相對穩定的條件下，枸杞基因組發生了較為豐富的表觀遺傳變異。主成分分析和聚類分析發現各產地枸杞的表觀遺傳特性各不相同，存在明顯的地域相關性，并受到溫度、降水量和土壤酸堿度等生態因子的調控[21]。因此推測，遺傳背景一致的枸杞經引種栽培至其他生態產區后，通過改變自身DNA甲基化模式及水平，并調控下游相關蛋白質及代謝產物的表達，以提高自身對于不同環境的適應能力，可能是枸杞在不同生態環境下適應能力的內在驅動力。

作為一種較為成熟的群體遺傳學分子檢測手段，AFLP技術要求足夠數量的分析樣本，以保證結果的科學性和可靠性。本研究中，受采樣規模限制，僅分析了我國6個枸杞主要栽培生產區域的52份枸杞DNA樣本，且均采集自人工種植基地，缺少野生枸杞樣本。因此，后續還需要對我國枸杞資源分布情況進行深度調查，擴大樣本收集范圍，并結合形態性狀學、內源性代謝成分分析、表觀遺傳學及其他類型分子標記，以獲得更加全面、準確的我國枸杞種質資源遺傳多樣性研究全景圖。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Genetic diversity analysis ofsamples from different cultivation areas based on AFLP molecular markers

ZHANG Fang1, LU Rui-hua1, FU Huan-zhe1, ZHANG Wen-hua2, LI Zhong2, REN Gang3, CHEN Zhan-ping3, ZHAO Yu-ling4, GUO Sheng1, QIAN Da-wei1, DUANJin-ao1

1. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization/National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine, Nanjing 210023, China 2. Bairuiyuan Gouqi Co., Ltd., Yinchuan 750200, China 3. Haixi Agricultural Science Research Institute of Mongolian and Tibetan Autonomus Prefecture, Delingha 817000, China 4. Jinghe Gouqi Industry Development Center of Bortala Mongolian Autonomous Prefecture, Bortala 833399, China

The genetic diversity of 52samples from six cultivation areas in China was analyzed at the genomic DNA level by using the fluorescence assisted amplified fragment length polymorphism (AFLP) technique.After the successive steps of enzyme digestion, ligation, pre-amplification and selective amplification of the extracted DNA samples, the PCR products were separated by capillary electrophoresis system. The collected data were then analyzed by Popgene software to calculate the genetic diversity parameters, GenAlex software was used to calculate genetic distances and perform principal coordinate analysis, cluster analysis based on genetic distance was performed using MEGA-X software and population genetic structure analysis was performed using Structure software.A total of ten pairs of selective amplification primers were screened, and 328 amplified fragments were amplified, including 121 polymorphic fragments, which were unevenly distributed amongpopulations from different habitats. The genetic diversity ofin different habitats was relatively low. The allele numberN, effective allele numberN,observed heterozygosity, and Shannon information indexwere 1.438 0, 1.231 6, 0.140 7 and 0.215 2, respectively. Nei’s genetic consistency ranged from 0.835 4 to 0.890 2. There were frequent gene exchanges among populations ofin different cultivation and production areas.There were relatively frequent gene exchanges betweenpopulations in different cultivation and production areas, and the degree of genetic differentiation was moderate, and the genetic variation within populations was the main source of genetic variation of. Furthermore, no significant correlation between genetic distance and geographical distance was observed. This study will provide scientific basis for the accumulation of genetic background information, introduction and cultivation, protection of germplasm resources, construction of core germplasm bank and formulation and management of sustainable development strategy of.

L.; amplified fragment length polymorphism; germplasm resources; genetic diversity; cultivation areas

R286.2

A

0253 - 2670(2023)18 - 6074 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.18.025

2023-02-03

國家自然科學基金資助項目（81773837）；江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心重點項目（ZDXM-2020-02，ZDXM-2022-36）；國家中醫藥管理局中醫藥創新團隊及人才支持計劃項目（ZYYCXTD-D-202005）；中央本級重大增減支項目（2060302）；寧夏自然科學基金項目（2022AAC03215）

張 芳，博士，副教授，研究方向為中藥生物技術。Tel: (025)85811516 E-mail: fangzhang@njucm.edu.cn

段金廒，教授，博士生導師，研究方向為中藥資源化學與資源循環利用。Tel: (025)85811917 E-mail: dja@njucm.edu.cn

[責任編輯 時圣明]