卵葉遠志葉綠體基因組序列特征與系統發育分析

羅 瑤，胡本祥, 2，張 晗，史嘉周，姬海月, 2，凈易堯，陳曉穎，王幫慶，顏永剛，趙 璠，李艷茸，彭 亮*

卵葉遠志葉綠體基因組序列特征與系統發育分析

羅 瑤1，胡本祥1, 2，張 晗1，史嘉周1，姬海月1, 2，凈易堯1，陳曉穎1，王幫慶3，顏永剛1，趙 璠4，李艷茸4，彭 亮1*

1. 陜西中醫藥大學 藥學院/陜西省秦嶺中草藥應用開發工程技術研究中心/“秦藥”研發重點實驗室，陜西 咸陽 712046 2. 陜西國際商貿學院，陜西 咸陽 712046 3. 漢中市科技資源統籌中心，陜西 漢中 723000 4. 榆林市第五醫院，陜西 榆林 719000

解析卵葉遠志葉綠體因組的序列特征和系統發育關系。利用CTAB法提取卵葉遠志葉片基因組DNA，通過Illumina HiSeq平臺測序，再用GetCellelle組裝葉綠體基因組，通過MEGA11構建鄰接法（neighbor-joining，NJ法）系統發育樹。卵葉遠志的葉綠體基因組全長165 192 bp，GC含量為36.70%，共編碼124個基因，其中包含8個rRNA基因、42個tRNA基因和74個蛋白編碼基因；相對同義密碼子使用度顯示，67.29%的密碼子的使用度＞1，密碼子偏好A、T結尾；共檢測到287個簡單重復序列（simple sequence repeats，SSR），其中以單核苷酸重復次數最多，占80.61%，單核苷酸主要由A和T組成，這表明在堿基形成過程中A和T被頻繁使用；邊界分析顯示，9種遠志屬植物葉綠體基因組邊界較為穩定，卵葉遠志、香港遠志、遠志、瓜子金和合葉草基因結構存在相似性；變異分析顯示，9種遠志屬植物葉綠體基因組變異幅度較小；系統發育分析結果顯示，卵葉遠志、香港遠志、瓜子金、遠志、合葉草和西南遠志因較高的支持率可聚成一支。構建了高質量的卵葉遠志全葉綠體基因組，為卵葉遠志的遺傳結構和遺傳多樣性研究奠定了基礎。

遠志；卵葉遠志；葉綠體基因組；序列特征；系統發育

遠志為遠志科遠志屬多年生草本植物遠志Willd.或卵葉遠志L.的干燥根[1]。遠志是我國42種重點保護的三級野生品種和85種傳統出口大宗藥材之一，也是目前臨床益智藥處方中使用度名列前3位的單味中草藥，被視為養命之要藥[2]。遠志藥用歷史悠久，始載于《神農本草經》，目前已從遠志藥材中分離和鑒定出140多種化合物，包括皂苷類、𠮿酮類、寡糖酯類、生物堿類等[3]。其中，遠志皂苷類、𠮿酮類以及寡糖酯類作為遠志藥材中最主要的藥效成分，具有廣泛的藥理活性，如抗衰老、神經保護、抗抑郁、催眠鎮靜、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗心律失常等[4]。

葉綠體（chloroplast，cp）是古代細菌內共生體的后代，系植物細胞中的重要細胞器，負責光合作用和新陳代謝等，為植物生存和生長提供必要的能量[5]。高等植物的葉綠體基因組中存在典型的環式雙鏈結構，其大小在120～180 kb，由4部分構成，包含1個小單拷貝區（small single copy，SSC）、1個大單拷貝區（large single copy，LSC）和2個反向重復區（inverted repeats，IRs）[6-7]。葉綠體基因組DNA（cpDNA）獨立于核基因組，表現出半自主的遺傳特征，可作為物種鑒定、系統發育、起源進化等研究的依據[8-9]。研究發現，基于葉綠體基因組的分子條形碼具有極佳的物種鑒定潛力[10-11]，且完整的葉綠體基因組序列可以為植物物種和種群水平上的準確鑒定提供可靠的條形碼[12-13]。同時，通過比較葉綠體基因組序列為發現序列變異和識別突變熱點區域提供了機會，還可以檢測出基因缺失和重復事件。因此，從葉綠體基因組序列獲得的突變熱點區域和簡單重復序列（simple sequence repeats，SSR）可以作為物種鑒定和群體遺傳學的有效分子標記[14]。隨著二代測序技術（next generation sequencing，NGS）的普及和發展，葉綠體基因組數據庫日益豐富。在解析植物類群系統發育關系研究中逐漸得到廣泛應用，迄今已有1000多種植物完成了葉綠體基因組的測序，在植物系統發育地位、物種鑒定、進化分析等解析方面發揮重要作用[15]。

目前，遠志研究多集中于遠志及其藥材，而有關卵葉遠志L.的研究，僅有少數是關于資源調查、化學成分和藥理作用等方面[16-17]，尚缺乏其葉綠體基因組及遺傳背景信息的系統研究與分析。據此，本研究采用高通量測序技術以獲得卵葉遠志葉綠體全基因組序列信息，并利用生物信息學相關軟件，分析其序列特征、基因組成及系統發育關系，以期為該藥用植物的遺傳結構和遺傳多樣性研究奠定研究和理論基礎，也為將來遠志屬植物的親緣關系解析及新藥源尋找等提供支撐。

1 材料

卵葉遠志采自陜西省太白縣大貫子（N 107.2883205°，E 33.99384660°，海拔1302 m），經陜西中醫藥大學胡本祥教授鑒定為遠志科卵葉遠志L.，取卵葉遠志的新鮮葉片，液氮速凍后存于?80 ℃冰箱，用于DNA提取。植物憑證樣本保存于陜西中醫藥大學標本館（PS20211001）。

2 方法

2.1 基因組DNA提取和測序

取卵葉遠志的新鮮幼嫩葉片，通過改良十六烷基三甲基溴化銨法（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）[18]提取基因組DNA，經電泳檢測和濃度測定后，置?20 ℃冰箱留存備用。超聲處理基因組DNA，通過末端修復、加A尾、加測序接頭、純化、PCR擴增等步驟完成文庫構建，再通過Illumina高通量測序平臺Illumina HiSeq測序，以此來獲得序列原始數據。

2.2 葉綠體基因組組裝與注釋

Illumina數據使用Trimmomatic v0.36[19]以去除接頭和低質量數據。參數設置如下：前導：20；尾隨：20；滑動窗口：4∶15；最小鏡頭：36；平均合格：20。處理完后的高質量clean data，使用GetCellelle對葉綠體基因組進行組裝，拼接軟件對優化序列進行多個Kmer參數的拼接，長度設置為107、117和127 bp。使用在線網站CHLOROBOX（https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/geseq.html）對組裝好的葉綠體基因組進行注釋[20]。使用OGDRAW繪制葉綠體全基因組圖譜[21]。最終注釋的葉綠體基因組上傳于GenBank中，注冊號為OP870084。

2.3 葉綠體基因組序列比較分析

為消除氨基酸組成對密碼子使用的影響，采用MEGA11[22]分析同義密碼子使用量、相對同義密碼子使用值（relative synonymous codon usage，RSCU）、堿基組成和密碼子含量的變化特征。使用SSRHunter軟件（http://www.biosoft.net）鑒定葉綠體基因組中的SSR[23-24]。參數設置為單核苷酸至六核苷酸8、5、4、4、4、4。SC/IR邊界使用IRSCOPE[25]進行作圖分析。同樣，通過mVISTA[26]（https://genome.lbl.gov/vista/mvista/ submit.shtml）做全基因組對比，分析時勾選全局對比（Shuffle-LAGAN），對遠志屬9種葉綠體基因組序列做同源性對比分析。

2.4 系統發育分析

從NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上下載遠志科遠志屬植物遠志（NC_050829）、香港遠志（NC_066219.1）、瓜子金（NC_052912.1）、密花遠志（NC_056971.1）、西南遠志（NC_ 060367.1）、合葉草（OP_612815.1）、黃花倒水蓮（NC_052911.1）、荷包山桂花（NC0_56971.1），選取楝科香椿屬植物香椿（NC_059806.1）和楝科非洲楝屬植物非洲楝（NC_037362.1）作為外類群，共11個物種完整的葉綠體基因組序列通過在線軟件MAFFT version7 （https://mafft.cbrc.jp/ alignment/ server/）進行多序列對比[27]，利用MEGA11構建鄰接法（neighbor-joining，NJ）系統發育樹[28]，自展次數為1000[28]。

3 結果與分析

3.1 葉綠體基因組的結構

卵葉遠志葉綠體基因組具有典型的四分體結構（圖1），由LSC區域（165、192～248、865），SSC區域（120、409～128、457），IRA（128、458～165、191）和IRB（83、674～120、408）組成。葉綠體基因組全長165 192 bp，GC含量約為36.7%（表1）。

圖1 卵葉遠志葉綠體基因組圖譜

表1 卵葉遠志葉綠體基因組堿基組成

Table 1 Base composition of chloroplast genome in P. sibirica

區域A/%T/%C/%G/%GC/%堿基長度/bp IRA29.231.120.918.839.8 36 734 IRB31.129.218.820.939.8 36 735 SSC38.432.115.314.329.6 8049 LSC32.032.218.016.834.8 83 674 總量31.531.818.718.036.7165 192

3.2 基因組成

基因注釋結果顯示，卵葉遠志葉綠體基因組共注釋得到124個基因，包括8個核糖體RNA（rRNA）基因、42個轉運RNA（tRNA）基因和74個蛋白編碼基因（coding sequence，CDS）（表2）。注釋的基因中存在1個內含子的為、、、、、等，存在2個內含子的基因為和。

表2 卵葉遠志葉綠體基因組上的基因

Table 2 Genes located on chloroplast genome of P. sibirica

基因類別基因名稱數量 tRNAtrnA-UGC*(2)、trnC-GCA、trnD-GUC、trnA-UGC*(2)、trnC、GCA、trnD-GUC、trnE-UUC、trnF-GAA、trnG-GCC、trnH-GUG、trnI*(2)、trnK-UUU*、trnL-CAA(2)、trnL-UAA*、trnL-UAG、trnM-CAU(4)、trnN-GUU(2)、trnP-UGG、trnQ-UUG(3)、trnR-ACG(2)、trnR-UCU、trnS-CGA*、trnS-GCU、trnS-GGA、trnS-UGA、trnT-GGU、trnT-UGU、trnV-GAC(2)、trnW-CCA、trnY-GUA42 rRNArrn4.5(2)、rrn5S(2)、rrn16S(2)、rrn23S(2)8 核糖體蛋白小亞基rps3、rps4、rps7(2)、rps8、rps11、rps12**(2)、rps14、rps15(2)、rps18、rps1913 核糖體蛋白大亞基rpl2*(2)、rpl14、rpl16*、rpl20、rpl23(2)、rpl368 RNA聚合酶rpoA、rpoB、rpoC1*、rpoC24 NADH脫氫酶亞基ndhA*(2)、ndhB*(2)、ndhC、ndhD、ndhE、ndhF、ndhG、ndhH(2)、ndhI(2)、ndhJ、ndhK15 光系統I亞基psaA、psaB、psaC、psaJ4 光系統II亞基psbA、psbB、psbC、psbD、psbE、psbF、psbH、psbJ、psbK、psbM、psbN、psbT、psbZ13 色素細胞b/f復合物亞基petA、petB*、petG、petL4 ATP合成酶亞基atpA、atpB、atpE、atpF*、atpH、atpI6 Rubisco大亞基rbcL1 成熟酶matK1 被膜蛋白cemA1 乙酰CoA羧化酶accD*1 色素細胞C合成酶ccsA1 未知功能蛋白ycf3**、ycf42 合計 124

*-內含子為1**-內含子為2

*-one intron**-two introns

3.3 密碼子偏好分析

卵葉遠志葉綠體密碼子研究發現，64個蛋白編碼基因共編碼35 541個密碼子。亮氨酸（Leu）使用頻率最高，異亮氨酸（Ile）次之，半胱氨酸（Cys）使用度最低，分別為3775（10.62%）、3075（8.65%）、423（1.19%）。密碼子使用偏好顯示，卵葉遠志葉綠體基因組中RSCU＞1的密碼子占總量的67.29%，表現出以A、T結尾的特征（表3）。

3.4 SSR分析

卵葉遠志葉綠體基因組中鑒定出單、二、三、四、五、六核苷酸SSRs位點共287個，其數量分別為240、28、4、8、3、4。其中，單核苷酸重復次數最多，占比80.61%（表4）。

表3 卵葉遠志密碼子信息

Table 3 Codon usage in P. sibirica

密碼子氨基酸數量RSCU密碼子氨基酸數量RSCU GCAAla 5931.12CCCPRO 3240.88 GCCAla 3060.58CCGPRO 2410.66 GCGAla 2490.47CCUPRO 5091.39 GCUAla 9611.82CAAGln 9111.48 UGCCys 1220.58CAGGln 3220.52 UGUCys 3011.42AGAArg 5881.65 GACAsp 2350.38AGGArg 2640.74 GAUAsp 9871.62CGAArg 4791.34 GAAGlu12911.48CGCArg 1600.45 GAGGlu 4500.52CGGArg 1390.39 UUCPhe 6910.66CGUArg 5141.44 UUUPhe14051.34AGCSer 2080.49 GGAGly 9951.51AGUSer 5031.19 GGCGly 2920.44UCASer 4581.08 GGGGly 4720.72UCCSer 4030.95 GGUGly 8711.32UCGSer 2390.56 CACHis 2380.56UCUSer 7301.72 CAUHis 6131.44ACAThr 5021.13 AUAIle 9530.93ACCThr 3410.77 AUCIle 5780.56ACGThr 2090.47 AUUIle15441.51ACUThr 7231.63 AAALys12911.50GUAVal 7071.40 AAGLys 4260.50GUCVal 2450.49 CUALeu 4290.68GUGVal 2810.56 CUCLeu 2680.43GUUVal 7821.55 CUGLeu 2100.33UGGTrp 6551.00 CUULeu 7721.23UACTyr 2830.42 UUALeu13042.07UAUTyr10641.58 UUGLeu 7921.26UAAStop 1691.19 AUGMet 8011.00UAGStop 1240.87 AACAsn 3350.45UGAStop 1340.94 AAUAsn11611.55CCAPro 3941.07

表4 卵葉遠志葉綠體基因組的SSRs

Table 4 Distribution of SSRs within P. sibirica chloroplast genome

核苷酸類型重復序列數量占比/% 單核苷酸A/TC/G230 1080.13 3.48 二核苷酸AG/CTAT/AT 5 23 1.74 8.01 三核苷酸AAG/CTTAAT/ATT 1 3 0.34 1.04 四核苷酸AAAG/CTTTAAAT/ATTTATCC/ATGG 1 5 2 0.34 1.74 0.69 五核苷酸AAAAT/ATTTTAATCT/AGATT 2 1 0.69 0.34 六核苷酸AAAGAT/ATCTTTAAGATC/ATCTTGAAGATG/ATCTTC 1 1 2 0.34 0.34 0.69

3.5 邊界分析

選取NCBI上已發布的8種遠志屬植物葉綠體基因組SC/IR進行邊界分析，顯示遠志屬植物葉綠體基因組存在4個邊界。如圖2所示，LSC/IRb區域中，除密花遠志L.及西南遠志L.外，其余7種均位于rps19基因編碼區。其中，向LSC區域擴張1 bp的香港遠志L.、遠志、瓜子金和合葉草；擴張2bp的為西伯利亞遠志；擴張7bp的為黃花倒水蓮和荷包山桂花。IRb/SSC區有4種在基因編碼區，5種在基因非編碼區，其中香港遠志和荷包山桂花分別向IRb擴張10bp和3bp。SSC/IRa區，所有物種都在基因和基因之間的非編碼區，且均向SSC區擴張，該區域無劇烈變化。在IRa/LSC，除西南遠志處于基因編碼區外，其他8種均在基因和基因之間的非編碼區，均向IRa區有不同程度的擴張。邊界分析表明，遠志屬植物葉綠體基因組在其IR邊界具有一定差異，總體而言基因邊界變異幅度較小，葉綠體基因組較為保守。顯示出西伯利亞遠志、香港遠志、遠志、瓜子金和合葉草在SC/IR邊界的結構上存在相似性。

圖2 9種遠志屬植物葉綠體基因組的IR/SC邊界變化情況

3.6 遠志屬植物葉綠體基因組變異分析

以卵葉遠志（GenBank注冊號為NC056970）為注釋，對9種遠志屬植物進行葉綠體基因組全序列對比分析（圖3）。結果表明，9種遠志屬植物葉綠體基因組的4個基因區間組成較為一致，差異性較小。從4大區段來看，LSC區差異性最大，變異程度最高，而IRA區則差異性最小，最為保守。從非基因編碼區和基因編碼區來看，非基因編碼區變異程度較高，基因編碼區較為保守，但在、、、和等基因編碼區變異程度較大，存在顯著差異。

圖3 遠志屬植物葉綠體基因組全局比對分析

3.7 系統發育分析

利用鄰接法構建系統發育樹（圖4），結果顯示11個物種可分為遠志科和外類群的楝科。遠志科的9種遠志屬植物以100%支持率構成一個分支，與楝科區分開。同時，遠志屬中香港遠志、卵葉遠志、瓜子金、遠志、合葉草和西南遠志可聚成一支，而密花遠志、荷包山桂花和黃花倒水蓮則聚為姐妹支。

圖4 基于葉綠體全基因組序列構建NJ系統進化樹

4 討論

卵葉遠志作為遠志中藥材的2種基原植物之一，具有重要的藥用價值和經濟價值。卵葉遠志和遠志分布和產地也基本相同，遠志藥材的質量標準中并未區分卵葉遠志與遠志的種間區別，也未客觀確定各自的質量指標，有關藥用遠志的研究也主要集中在遠志方面。近年來，對卵葉遠志的研究也在逐漸加深[29]，但目前尚缺乏關于其遺傳信息的研究。基于此，本研究完成了卵葉遠志葉綠體基因組的測序、組裝和注釋工作，并分析了其結構、GC含量、基因組成、密碼子使用度、SSR等，著重對9種遠志屬植物進行了葉綠體基因組邊界分析、變異分析及系統發育分析等。研究發現，卵葉遠志葉綠體基因組為經典的環狀四分結構，全長為165 192 bp，其GC含量為36.75%，共編碼124個基因，其中含有一個內含子的基因有14個，含有2個內含子的基因有2個。同時，和大多數被子植物葉綠體基因組一樣[30]，卵葉遠志中也存在未知功能基因，如和基因，仍有待進行突破性研究。

密碼子是生物體中連接氨基酸、蛋白質和遺傳物質的重要核心元素，在生物個體遺傳信息的傳遞中起重要作用[31]。大多數氨基酸不僅由一種密碼子編碼，也可以同時由2～3種密碼子編碼，生物體對于不同的密碼子的使用具有一定偏好性[32]。密碼子偏好的研究使用為蛋白質表達及其相應功能的研究提供了可靠的信息。密碼子偏好也可作為微調基因表達的手段[33]，雙子葉植物密碼子偏好以A/T結尾，單子葉子葉植物偏好則與雙子葉植物不同，偏向G/C[34]。對卵葉遠志密碼子分析可知，卵葉遠志密碼子RSCU＞1的有67.29%，偏好為以A、T結尾。

目前，SSR是主要存在于基因外部和基因非編碼區的共顯性標記，也稱微衛星，可用于群體遺傳學研究的分子標記[35]。在卵葉遠志葉綠體基因組中，檢測出的SSRs位點共有287個，其中單核苷酸重復次數最多，占80.61%。單核苷酸主要由A和T組成，這也表明卵葉遠志葉綠體基因組在堿基形成過程中A和T被頻繁使用。

遠志屬植物葉綠體基因組的SC/IR邊界，雖存在部分擴張或收縮情況，但大體來說，整個基因組仍然較為保守，卵葉遠志、遠志、瓜子金、香港遠志和合葉草基因結構存在相似性。在對其進行全序列比對時，LSC區和非基因編碼區變異程度較高，IRa區和大部分基因組編碼區保守程度較高。本研究通過全序列對比，結合邊界分析與系統發育結果，得出卵葉遠志與香港遠志聚為一支，且與遠志、瓜子金具有較高的親緣關系。與王星璐等[36]構建的進化樹存在一些差異，分析其系統發育關系可知，瓜子金和卵葉遠志聚為一支，二者又與香港遠志聚類到一起，瓜子金、卵葉遠志、香港遠志和遠志為姊妹類群，表明四者親緣關系最近關系密切，推測差異原因可能與樣本的采集環境及變異有關。

本研究通過文庫構建、高通量測序、組裝和序列分析，系統解析了卵葉遠志葉綠體基因組，分析了其葉綠體基因組序列特征和系統發育關系，有助于深入開展后續分子標記、DNA條形碼技術等研究,為進一步探究該藥用植物卵葉遠志的遺傳結構和遺傳多樣性奠定了基礎。同時，也增添了卵葉遠志在分子生藥學方面的部分研究，為加快對卵葉遠志的研究以及在基因層面鑒別該種屬提供了相關依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Chloroplast genome sequence characteristics and phylogenetic analysis of

LUO Yao1, HU Ben-xiang1, 2, ZHANG Han1, SHI Jia-zhou1, JI Hai-yue1, 2, JING Yi-yao1, CHEN Xiao-ying1, WANG Bang-qing3, YAN Yong-gang1, ZHAO Fan4, LI Yan-rong4, PENG Liang1

1. College of Pharmacy, Shaanxi University of Chinese Medicine/Shaanxi Engineering Research Center for Application and Development of Chinese Medicine in Qinling Mountains/Key Laboratory of “Qin Medicine” Research and Development, Xianyang 712046, China 2. Shaanxi Institute of International Trade & Commerce, Xianyang 712046, China 3. Hanzhong Science and Technology Coordination Center, Hanzhong 723000, China 4. Yulin No.5 Hospital, Yulin 719000, China

To identify the sequence characteristics and phylogenetic relationships ofchloroplast genome.The genomic DNA of leaves was extracted by CTAB method and sequenced by the Illumina HiSeq platform, and the chloroplast genome was assembled by GetCellelle, and the neighbor-joining (NJ) phylogenetic tree was constructed by MEGA11.The total length of the chloroplast genome ofwas 165 192 bp, with a GC value of 36.70%. The chloroplast genome ofhas 124 coding genes, with the numbers of CDS, tRNA, and rRNA were 74, 42, and 8, respectively; relative synonymous codon usage showed that 67.29% of codons had a usage level large than 1, and codons preferred A and T endings. A total of 287 simple sequence repeats (SSRs) were detected, and the number of single nucleotide repetitions was the highest, accounting for 80.61 %. Mononucleotides are mainly composed of A and T, indicating that A and T are frequently used during base formation. Boundary analysis showed that the chloroplast genome boundaries of nine species ofwere relatively stable, and the gene structures of,,,andwere similar. Variation analysis showed that the chloroplast genome variation of nine species ofwas small. The results of phylogenetic analysis showed that,,,,andcould be clustered into one branch due to their high support rates.The high-quality whole chloroplast genome ofwas constructed, which laid a foundation for the study of genetic structure and genetic diversity of.

Willd.;L.; chloroplast genome; sequence characterization; phylogenetic analysis

R286.12

A

0253 - 2670(2023)18 - 6065 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.18.024

2023-03-03

國家自然科學基金資助項目（82003899）；陜西省科技廳社發攻關一般項目（2021SF-364）；公益性行業（中醫藥）科研專項經費項目（201507002-1-08）；陜西中醫藥大學校級課題項目（2020GP28）；陜西中醫藥大學“秦藥”品質評價及資源開發學科創新團隊項目（2019-QN01）

羅 瑤（1997—），女，在讀碩士研究生，從事中藥資源質量評價與分子生藥學研究。E-mail: 2207256840@qq.com

彭 亮（1985—），男，副教授，從事中藥資源評價與開發利用、分子生藥學研究。E-mail: ppengliang@126.com

[責任編輯 時圣明]