基于“化學物質組-血中移行成分-藥動學”的蒙藥暖宮七味丸質量標志物研究

張晨晨，張東旭，張玉鳳，張愛杰，董世奇，韓 峰，邢界紅，樊慧蓉，劉昌孝

基于“化學物質組-血中移行成分-藥動學”的蒙藥暖宮七味丸質量標志物研究

張晨晨1, 2，張東旭1, 2，張玉鳳1, 2，張愛杰2，董世奇2，韓 峰3，邢界紅4，樊慧蓉2*，劉昌孝5

1. 天津中醫藥大學，天津 301617 2. 中國醫學科學院放射醫學研究所，天津 300192 3. 內蒙古自治區藥品檢驗研究院，內蒙古 呼和浩特 010020 4. 內蒙古蒙藥股份有限公司，內蒙古 通遼 028000 5. 天津藥物研究院，天津 300462

研究蒙藥暖宮七味丸的化學物質組、血中移行成分及藥動學，篩選出暖宮七味丸潛在的質量標志物。綜合運用UPLC-Triple-TOF-MS/MS、GC-MS技術結合數據庫及對照品對比，鑒別暖宮七味丸的化學物質組、血中移行成分；使用UPLC-Q-TRAP-MS/MS研究其體內藥動學特征。采用UPLC-Q-TOF-MS/MS鑒別出暖宮七味丸中的76個化學成分，采用GC-MS鑒別出35個化合物。經大鼠ig給藥后鑒別出19個吸收進入血中的原型成分，其中，沉香四醇、綠原酸、科羅索酸表現出良好的可測性，且具有明顯的藥動學特征。沉香四醇、綠原酸、科羅索酸在暖宮七味丸的化學物質組-血中移行成分-藥動學研究中具有良好的可測性和可追溯性，可作為暖宮七味丸潛在的質量標志物。

暖宮七味丸；質量標志物；化學物質組；血中移行成分；藥動學；沉香四醇；綠原酸；科羅索酸

暖宮七味丸（蘇格木勒-7）出自蒙醫學經典著作《觀者之喜》，由天門冬、手掌參、沉香、豆蔻、肉豆蔻、黃精和丁香組成，是治療婦科疾病的蒙醫傳統方劑[1]。其中，豆蔻、肉豆蔻、丁香和沉香均具有抑赫依作用；手掌參生精壯陽、主治腎寒；黃精強腎固陽；天門冬固精、鎮赫依[2]。全方中7味藥配伍合理，調赫依、具有溫暖子宮和驅寒止痛的功效[3]。臨床上常用于治療氣滯腰痛、小腹冷痛等疾病[2]。暖宮七味丸作為臨床治療痛經的復方藥，現有研究多集中在藥效學和臨床方面的宏觀治療作用評價，其藥效物質基礎尚未明確，很大程度上限制了產品質量標準的提高及深入開發。

中藥質量標志物（quality marker，Q-Marker）是劉昌孝院士[4]及其團隊提出的作為反映中藥安全性和有效性的標示性物質進行質量控制的新概念。在其有效、特有、傳遞與溯源、可測和處方配伍的“五原則”基礎上，張鐵軍等[5]提出了復方中藥Q-Marker研究路徑和方法。蒙藥和中藥一樣大多為天然藥物，同樣有復雜的化學成分，甚至很多蒙藥和中藥的來源也相同。目前蒙藥的質量標準體系并不完善，中藥質量標準的研究經驗對蒙藥質量標準化有著寶貴的借鑒意義。本研究利用LC-MS/MS、GC-MS技術對暖宮七味丸的化學物質組、血中移行成分及其藥動學進行研究，結合Q-Marker“五原則”探尋蒙藥暖宮七味丸潛在的質量標志物，以期為其藥效物質基礎研究和質量控制標準的提升提供依據和思路。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Exion AD UPLC）、Triple TOF 4600質譜儀、QTRAP 5500質譜儀均購自美國AB SCIEX公司；KQ5200DE型超聲波清洗器（上海右一儀器有限公司）；LAB DANCER S000型渦旋振蕩器（美國IKA公司）；Legend Micro 17R高速冷凍離心機（美國Thermo scientific公司）；7890A/5975C氣質聯用儀（美國Aglient公司）；FD-2型冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥品

暖宮七味丸藥粉（內蒙古蒙藥集團）；色譜純甲醇（美國Fisher Scientific公司）；色譜純乙腈（美國Sigma公司）；色譜純甲酸（天津大茂化學試劑有限公司）；純化水（屈臣氏公司）；對照品去氫木香烴內酯（中國食品藥品檢定研究院，批號L8AT-ABV5，質量分數≥98%）、綠原酸（甄準生物科技有限公司，批號ZZS-20-114-A8，質量分數≥98%）、科羅索酸（甄準生物科技有限公司，批號ZZS19110708，質量分數≥98%）、木香烴內酯對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號TJTD-CTHA，質量分數≥98%）、沉香四醇（甄準生物科技有限公司，批號ZZS-20-112-A4，質量分數≥98%）、丁香酚（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號D-064-161216，質量分數≥98%）、槲皮素（中國食品藥品檢定研究院，批號110759-201105，質量分數≥98%）；異欖香脂素（甄準生物科技有限公司，批號ZZS-20-114-A2，質量分數≥98%）；去氫二異丁香酚（中國食品藥品檢定研究院，批號L8AT-ABV5，質量分數≥98%）；氯仿（天津大茂化學試劑有限公司）；石油醚（天津大茂化學試劑有限公司）；醋酸乙酯（天津大茂化學試劑有限公司）；羧甲基纖維素鈉（德國默克公司）。

1.3 動物

SPF級雌性SD大鼠，體質量（200～220）g，6～7周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號 SCXK（京）2021-0011。經檢疫后安置在中國醫學科學院放射醫學研究所SPF動物室，飼養于溫度（25±2）℃、相對濕度50%～60%、12 h/12 h晝夜交替光照的環境中，自由進食飲水。所有動物實驗均遵循中國醫學科學院放射醫學研究所動物倫理委員會的規定，動物實驗倫理號：IRM-DWLL-2021128。

2 方法

2.1 暖宮七味丸化學物質組的UPLC-Q-TOF-MS/MS分析

2.1.1 液相條件 色譜柱為Diamonsil C18（2），200 mm×4.6 mm，5 μm；柱溫40 ℃；流動相為甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～2 min，65% B；2～5 min，65%～25% B；5～45 min，25%～5% B；45～50 min，5% B；50～51 min，5%～65% B；51～60 min，65% B；體積流量為0.4 mL/min；進樣體積7.5 μL。

2.1.2 質譜條件 采用Triple TOF進行分析，電噴霧離子源溫度：500 ℃；質譜電壓：5500 V；去簇電壓DP：60 V；碰撞電壓EP：10 V；離子源氣體I和氣體II均為397.21 kPa；氣簾氣：241.32 kPa；采用多反應檢測模式；設置全掃描范圍為/50～1000。

2.1.3 供試品藥液的制備 取暖宮七味丸藥粉，稱取1.00 g置入燒杯，加入20 mL 75%甲醇水溶液，超聲1 h，靜置至室溫，以溶劑補足減失質量，再以0.22 μm有機濾膜進行濾過，得到質量濃度為50 mg/mL暖宮七味丸提取液，再以50%甲醇溶液將其提取液稀釋10倍，稀釋后質量濃度為5 mg/mL，吸取適量稀釋后提取液進行LC-MS分析。

2.1.4 對照品溶液的制備 取對照品去氫木香烴內酯、科羅索酸、槲皮素、木香烴內酯、去氫二異丁香酚和沉香四醇粉末，各精密稱取適量加甲醇溶液制成1.0 mg/mL的儲備液。精密吸取液體對照品100 μL丁香酚、100 μL異欖香脂素置入不同的量瓶中，加入甲醇溶液稀釋定容。分別取適量各稀釋后的對照品溶液，以0.22 μm有機濾膜濾過，濾液即為混合對照品溶液，待進樣分析。

2.1.5 數據處理與分析 前期整理大量文獻，收集匯總暖宮七味丸中藥材所含成分的質譜信息。取“2.1.3”項下暖宮七味丸供試品溶液進UPLC-Triple-TOF-MS/MS測定，采集所有樣品的二級質譜圖，將采集到的暖宮七味丸二級質譜圖輸入Peakview2.2軟件中與中藥化合物數據庫中的信息進行比對，結合前期收集到的質譜信息和對照品比對確定化合物的結構。

2.2 暖宮七味丸化學物質組的GC-MS分析

2.2.1 檢測方法

（1）色譜條件：色譜柱為HP-5MS（30 m×250 μm，0.25 μm）；氣化室溫度250 ℃；傳輸線溫度300 ℃；色譜柱溫度設置為程序升溫：起始溫度為50 ℃（保持3 min），以5 ℃/min升溫至120 ℃（保持1 min），再以10 ℃/min升溫至300 ℃（保持10 min）；載氣He；載氣體積流量為1.0 mL/min；進樣量為1 μL。

（2）質譜條件：EI源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；掃描模式為Scan；掃描質量范圍為/30～500，溶劑延遲3 min。

2.2.2 提取液的制備 稱取暖宮七味丸粉末2.00 g，加入氯仿20 mL，密閉浸泡30 min后稱定質量，超聲40 min，待恢復至室溫后用氯仿補足減失質量，得到100 mg/mL暖宮七味丸提取母液，將暖宮七味丸提取母液稀釋至5 mg/mL，濾過后進GC-MS檢測。

2.2.3 定性定量方法

（1）定性分析：對檢測出的成分采用MS數據庫NIST11和保留時間進行定性分析。數據庫篩選結果中要扣除掉柱流失峰等，最終將相似度≥90的化合物確認為暖宮七味丸揮發性成分。

（2）定量分析：面積歸一化法對揮發油中各種化學組分的相對百分含量進行定量分析，即以鑒定成分峰面積占所有鑒定成分面積之和的百分比作為定量結果。

2.3 暖宮七味丸血中移行成分的UPLC-Q-TOF-MS/MS分析

2.3.1 色譜方法 液相條件與質譜條件同“2.1.1”和“2.1.2”項。

2.3.2 ig藥液的制備 精密稱取30.00 g暖宮七味丸粉末，使用300 mL純甲醇超聲處理60 min得到藥液。將藥液抽濾后取濾液旋蒸濃縮，將旋蒸濃縮液用40 ℃氮氣進一步濃縮，將濃縮物加入到10 mL 0.5% CMC-Na攪拌均勻得到含藥量為3 g/mL的浸膏，渦旋并存放于4 ℃冰箱，備用（給藥量為10 mL/kg，相當于30 g/kg）。

2.3.3 分組、給藥及樣本采集 取SD雌性大鼠4只，給藥前12 h禁食不禁水。取空白血后以10 μL/g的容積ig給藥。在給藥后0.5、1、2、4、6、8、12、24 h進行目內眥取全血500 μL左右于抗凝處理過的離心管內，離心取上清，冷凍保存備用。

2.3.4 生物樣本處理方法 取“2.3.3”項中的凍存血漿，置于冰水中待其恢復為液體狀態，取250 μL血漿置于2 mL EP管中，加入1000 μL 70%乙腈甲醇溶液，離心，取上清液，氮吹，待濃縮至干燥后，加入125 μL復溶液，振搖混勻，離心，取上清進行測定。

2.4 暖宮七味丸在大鼠體內的藥動學研究

2.4.1 正離子模式檢測方法

（1）液相條件：色譜柱為Agilent C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；柱溫40℃；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～0.5 min，40% B；0.5～3.0 min，40%～90% B；3.0～4.5 min，90% B；4.5～4.6 min，90%～40% B；4.6～6.5 min，40% B）；體積流量為0.2 mL/min；進樣體積2.0 μL。

（2）質譜條件：采用QTRAP 5500 質譜進行分析，電噴霧離子源溫度：550℃；質譜電壓：5000 V；去簇電壓DP：80 V；碰撞電壓EP：10 V；離子源氣體I和氣體II均為413.69 kPa；氣簾氣：241.32 kPa；在正離子、MRM模式下檢測，用于定量的離子對為沉香四醇/319.3→300.9，維拉帕米（內標物）/455.2→165.1。

2.4.2 負離子模式檢測方法

（1）液相條件：色譜柱為Agilent C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；柱溫40℃；流動相A為10 mmol/L乙酸銨-水，流動相B為乙腈，梯度洗脫（0～3 min，40% B；3～4 min，40%～95% B；4～6.5 min，95% B；6.5～6.6 min，95%～40% B；6.6～8.0 min，40% B）；體積流量為0.2 mL/min；進樣體積2.0 μL。

（2）質譜條件：采用Triple TOF進行分析，電噴霧離子源溫度：550℃；質譜電壓：4500 V；去簇電壓DP：?170 V；碰撞電壓EP：?10 V；離子源氣體I和氣體II分別為310.26、379.21 kPa；氣簾氣：241.32 kPa；在負離子、MRM模式下檢測，用于定量的離子對為科羅索酸/471.3、綠原酸/353.1→191.0、甘草次酸（內標物）/469.3→355.1。

2.4.3 供試品藥液的制備 稱取54 g暖宮七味丸粉末，使用540 mL甲醇超聲處理60 min得到藥液。將藥液抽濾過濾，取濾液旋蒸濃縮，將旋蒸濃縮液凍干得到凍干粉，在凍干粉中加入18 mL 0.5% CMC-NA攪拌均勻得到含藥量為3 g/mL的浸膏（30 mg/kg），渦旋并存放于4℃冰箱，備用。

2.4.4 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品沉香四醇、科羅索酸、綠原酸和內標維拉帕米、甘草次酸粉末適量，加甲醇溶液制成1 mg/mL的儲備液。精密吸取各對照品溶液適量，加50%甲醇溶液稀釋制成混合對照品溶液備用。沉香四醇質量濃度為0.5、1、10、50、100、300、500 ng/mL，科羅索酸和綠原酸質量濃度為1、5、10、30、60、100 ng/mL，內標維拉帕米、甘草次酸質量濃度為100 ng/mL。

2.4.5 生物樣本采集 雌性SD大鼠6只，以1 mL/100 g的容積ig給藥。實驗前12 h禁食不禁水，在給藥后0.083、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、36、48 h進行眼眶取血300 μL左右于抗凝處理過的離心管內，離心取上清，冷凍保存備用。

2.4.6 生物樣本處理方法 取“2.4.5”項下的凍存血漿，置于冰水中待其恢復為液體狀態，取50 μL血漿置于2 mL EP管中，加入50 μL內標溶液和100 μL 70%乙腈甲醇溶液，離心，取上清液，置于內插管中，再次離心后進行測定。

3 結果

3.1 暖宮七味丸化學物質組分析

采用HPLC-Triple-TOF-MS技術對暖宮七味丸中主要化學成分進行表征，通過Peakview 2.2軟件數據庫匹配，再結合標準品和相關文獻確定結構式，從暖宮七味丸中鑒別出暖宮七味丸提取液，其結果見表1，暖宮七味丸藥液的基峰色譜圖見圖1。共鑒別出76個化合物。

3.1.1 氨基酸類化合物 本實驗共從暖宮七味丸中鑒別出氨基酸12種，主要來自于黃精和天冬，該類分子易失去小分子碎片，如-COOH、-NH3。在正離子模式下，以瓜氨酸舉例進行裂解規律分析（圖2-A和圖3-A），在MS2鏡像圖中瓜氨酸的碎片離子峰有/159.076 7 [M＋H－NH3]+和/113.070 5 [M＋H－NH3－COOH]+即為瓜氨酸分子脫去-NH3和脫去-COOH及-NH3的碎片離子。依據文獻報道[6]以及數據庫比對可以判定該化合物為瓜氨酸。

3.1.2 揮發油類化合物 本實驗共從暖宮七味丸中鑒別出揮發油類20個，主要來自于沉香、丁香、白豆蔻和肉豆蔻。在正離子模式下（＋ESI），以沉香四醇舉例進行裂解規律分析（圖2-B、3-B），該化合物準分子離子峰/319.110 0 [M＋H]+，在MS2鏡像圖中，其主要碎片離子峰有/301.105 8 [M＋H－H2O]+和/283.095 7 [M＋H－H2O－H2O]+。經與對照品比對以及數據庫匹配，初步鑒定該化合物為沉香四醇。

3.1.3 萜類化合物 本實驗共從暖宮七味丸中鑒別出萜類化合物10種，主要來自于丁香，該類化合物易發生開環裂解，如果環內存在雙鍵則易發生RDA裂解。在正離子模式下，以去氫木香烴內酯舉例進行裂解規律分析，該化合物準分子離子峰為/231.138 2 [M＋H]+，在MS2鏡像圖圖中，其特征碎片離子峰有/213.127 1 [M＋H－H2O]+、/185.131 9 [M＋H－H2O－CO]+、/157.100 6 [M＋H－C3H6O2]+、/142.078 0 [M＋H－C4H9O2]+、/128.061 2 [M＋H－C5H11O2]+、/195.116 3 [M＋H－H4O2]+、/143.085 3 [M＋H－C4H8O4]+、/180.092 6 [M＋H－C4H3]+、/175.075 0 [M＋H－C4H8]+、/165.069 7 [M＋H－C5H6]+。經與對照品比對和數據庫匹配，可以鑒定該化合物為去氫木香烴內酯。

表1 UPLC-Q-TOF-MS法分析暖宮七味丸化學成分及入血成分

Table 1 UPLC-Q-TOF-MS identification results of chemical constituents absorbed into blood of Nuangong Qiwei Pills

編號tR/min理論值(m/z)實測值(m/z)分子式離子模式誤差(×10?6)MS/MS碎片離子鑒定成分來源 14.38176.103 5176.102 9C6H13N3O3[M＋H]+?0.59159.076 7, 113.070 5瓜氨酸[6]T 24.86182.081 7182.081 2C9H11NO3[M＋H]+0.09147.043 1, 136.075 8, 119.048 5酪氨酸[7]T 34.44106.050 4106.049 4C3H7NO3[M＋H]+?4.7660.043 3L-絲氨酸[6]T 44.48120.066 1120.065 3C4H9NO3[M＋H]+?1.8856.047 6D-蘇氨酸[6]T 54.65116.071 2116.070 4C5H9NO2[M＋H]+?1.12116.072 6, 70.064 3脯氨酸[8]T 66.72166.086 8166.086 3C9H11NO2[M＋H]+?0.09120.080 6, 118.065 1苯丙氨酸[7]T 74.96132.102 5132.101 8C6H13NO2[M＋H]+?0.8186.096 5, 69.069 3 異亮氨酸[8]T 83.69147.113 3147.112 7C6H14N2O2[M＋H]+?0.4084.080 0, 68.980 7, 56.048 7賴氨酸[8]T 94.49148.061 0148.060 4C5H9NO4[M＋H]+?0.3784.044 3, 56.049 2谷氨酸[8]T 103.71175.118 9175.119 0C6H14N4O2[M＋H]+0.3070.063 9, 60.054 8精氨酸[7]T 117.40205.097 7205.097 0C11H12N2O2[M＋H]+?0.74159.092 4, 146.057 1色氨酸[8]T 124.59134.045 2134.044 2C4H7NO4[M＋H]+?4.57118.085 7, 88.040 4, 74.023 3天冬氨酸[6]T 1311.23287.113 1287.126 8C13H18O7[M＋H]+4.97212.077 3天麻素S 1418.77251.107 2251.106 6C17H14O2[M＋H]+?0.08160.051 0, 91.053 82-(2-苯乙基)色酮*[9]C 15a36.62473.347 9473.362 4C30H48O4[M＋H]+?0.24437.339 9, 409.344 6, 249.185 0, 203.179 6, 189.163 9科羅索酸*[10]DX 1613.15237.185 5237.184 8C15H24O2[M＋H]+?0.37189.124 6, 135.117 5, 117.067 5, 107.086 7莪術醇S 13.11235.186 5235.185 5C15H24O2[M－H]??0.47117.067 5, 107.086 7 17a19.93233.153 6233.153 5C15H20O2[M＋H]+?0.02145.101 0, 131.084 9, 119.083 5土木香內酯*[11]DX 19.88231.153 9231.154 6C15H22O2[M－H]??0.11128.064 1, 119.082 1, 105.071 2 18a9.97319.118 2319.117 3C17H18O6[M＋H]+?0.94301.105 8, 283.095 7沉香四醇*[12]C 1920.85281.117 2281.117 3C18H16O3[M＋H]+0.45190.062 5, 175.039 0, 151.039 2, 124.052 16-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮*[9]C 2016.75311.128 3311.127 7C19H18O4[M＋H]+?0.18220.072 1, 205.049 1, 181.049 5, 177.055 0, 154.062 86-甲氧基-2-(3-甲氧基-2-苯乙基)色酮*[9]C 2113.21313.107 6313.106 8C18H16O5[M＋H]+?0.80273.143 9, 233.152 7, 187.148 0, 163.074 1, 147.116 9, 121.064 36,8-二羥基-2-(2(3'-甲氧基-4'-羥基苯乙基))色酮*[9]C 22a10.24303.108 0303.108 0C15H10O7[M＋H]+5.10229.060 8, 153.019 0, 137.024 1槲皮素[13]D 2327.46595.166 3595.164 7C27H30O15[M＋H]+?1.81271.060 3木蝴蝶苷BS 2411.22287.128 3287.127 5C15H10O6[M＋H]+?0.83269.116 6木犀草素[14]D 2512.31249.148 5249.148 4C15H20O3[M＋H]+?0.34183.077 9, 178.078 4, 165.068 6, 155.084 4, 141.069 0, 128.062 6, 115.053 8, 105.069 5丁香內酯D 2613.52195.101 6195.101 7C10H10O4[M＋H]+0.87177.054 0, 89.035 8異阿魏酸[15]DX 274.68361.165 1361.152 7C20H24O6[M＋H]+?3.40327.119 4, 311.086 4, 221.079 6, 153.017 6落葉松脂素[15]N 2822.86359.149 5359.149 5C20H22O6[M＋H]+?3.27359.231 6, 343, 3 060, 326.280 0, 227.176 0, 210.148 5松脂酚N 29a23.95327.159 6327.159 1C20H22O4[M＋H]+0.07286.119 4, 271.095 5, 257.081 5, 239.070 1去氫二異丁香酚[16]R, D 3016.10209.117 8209.117 2C12H16O3[M＋H]+0.03153.054 2, 138.029 2, 110.035 2欖香脂素[15]R, D 3114.42345.169 7345.169 9C20H24O5[M＋H]+0.70203.107 5, 188.080 2, 171.083 7, 151.074 9, 137.059 6, 133.065 9, 122.034 9fragransinA2*[17]R 3216.33357.180 8357.169 3C21H24O5[M＋H]+?0.90193.084 6, 165.090 1, 161.057 8, 150.066 2,fragnasol C[17]R

續表1

續表1

編號tR/min理論值(m/z)實測值(m/z)分子式離子模式誤差(×10?6)MS/MS碎片離子鑒定來源 654.94193.071 2193.070 5C7H12O6[M＋H]+?0.60111.042 0, 83.048 9, 69.032 3奎寧酸[7]DX 6613.85376.188 5376.183 9C21H27O6[M＋H]+?4.52357.166 3, 314.118 5, 222.122 2, 203.089 3, 181.087 3, 167.069 9, 151.075 9, 137.058 8肉豆蔻異木脂素[18]R, D 67a14.14165.091 5165.090 9C10H12O2[M＋H]+?0.27137.063 1, 105, 692丁香酚*[26]DX 6830.27279.232 5279.231 2C18H30O2[M－H]??3.34173.136 8, 95.085 8, 67.053 5亞油酸[13]DX 6936.62495.345 6495.344 7C30H48O4[M＋Na]+0.42451.356 5常春藤皂苷元C 7021.32231.138 5231.137 9C15H18O2[M＋H]+?0.40213.128 1, 203.143 4白術內酯DX 718.16355.102 9355.102 4C16H18O9[M＋H]+0.13181.052 0, 145.028 7綠原酸*[27]DX 7233.55325.141 0325.143 1C18H22O4[M＋Na]+?0.53203.108 1, 188.083 1, 171.060 4, 149.059 0去甲二氫愈創木脂酸[25]R 7310.29285.279 3285.288 4C16H12O5[M＋H]+0.96256.063 0, 240.231 5金合歡素*C 7416.10209.117 7209.117 2C12H16O3[M＋H]+0.04179.094 1, 151.066 3α-細辛腦*N 757.24220.118 4220.118 0C9H17NO5[M＋H]+0.30184.094 3, 170.058 2, 142.085 5, 118.064 2, 90.054 2泛酸[28]N 7610.13303.012 9303.013 7C14H6O8[M＋H]+0.75242.988 1, 182.963 8鞣花酸[29]C

R-肉豆蔻 D-豆蔻 DX-丁香 S-手掌參 C-沉香 H-黃精 T-天門冬 N-未知來源 a-經過對照品比對 *-入血成分

R-D-DX-S-(L.) R. Br. C-H-T-(Lour.) Merr. N-unknown source a-standard comparison *-ingredients absorbed into blood

圖1 正、負離子模式下暖宮七味丸提取液基峰色譜圖(BPC圖)

3.1.4 有機酸類化合物 本實驗共從暖宮七味丸中鑒別出有機酸類化合物10種，如科羅索酸、熊果酸、異阿魏酸和綠原酸等。在正離子模式下，以科羅索酸舉例進行裂解規律分析（圖2-C、3-C），化合物準分子離子峰為/473.355 3 [M＋H]+，在MS2鏡像圖中，其主要碎片離子有/455.348 0 [M＋H－H2O]+、/437.339 9 [M＋H－2H2O]+、/249.185 0 [M＋H－C14H24O2]+、/409.344 6 [M＋H－H2O－HCOOH]+、/391.335 3 [M＋H－2H2O－HCOOH]+、/235.169 5 [M＋H－C14H24O2－CH4]+、/203.176 9 [M＋H－C14H24O2－HCOOH]+、/189.163 7 [M＋H－C14H24O2－CH2－HCOOH]+。經與對照品比對和數據庫匹配，可以鑒定該化合物為科羅索酸。

3.1.5 色酮類化合物 本實驗共從暖宮七味丸中鑒別出5種色酮，分別為2-(2-苯乙基)色酮、6-甲氧基-2-(3-甲氧基-2-苯乙基)色酮、6,8-二羥基-2-(2(3-甲氧基-4-羥基苯乙基))色酮、6-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮、6-羥基-2-(2-苯乙基)色酮。該類化合物主要來自于沉香，易失去苯環、H2O等分子。在正離子模式下，以6-羥基-(2-苯乙基)色酮舉例進行裂解規律分析，該化合物準分子離子峰為/267.066 7 [M＋H]+，主要碎片離子峰有/176.046 5 [M＋H－C7H6]+、137.022 9 [M＋H－C10H10]+和/110.035 8 [M＋H－C10H10－CO]+。經文獻數據進行比對[9]可以判定該化合物為6-羥基-2-(2-苯乙基)色酮。

3.2 GC-MS檢測結果

取“2.2.2”項中的暖宮七味丸氯仿提取液進行GC-MS檢測，得到暖宮七味丸氯仿提取液的總離子流圖（圖4）。將得到化合物質譜信息導入NIST11數據庫進行鑒別，并按“2.2.3”項所述的方法進行定量。結果共確定了35個化合物，占總峰面積的85%，包括有肉豆蔻酸、角鯊烯、鄰苯二甲酸二甲酯、-檸檬烯等，結果見表2。

圖3 瓜氨酸(A)、沉香四醇 (B)、科羅索酸 (C) 的二級質譜圖及其對照品比對鏡像圖

3.3 暖宮七味丸血中移行成分研究

通過分析大鼠空白血漿、給予大鼠暖宮七味丸后的血漿以及暖宮七味丸提取液的總離子流圖，比較藥液（圖1）和空白對照血漿、給藥組血漿的保留時間以及二級碎片，從中鑒別出19個血中移行成分，結果見圖5和表1。

3.4 暖宮七味丸的藥動學研究

沉香四醇是沉香中的主要成分，綠原酸和科羅索酸均來源于丁香，為研究其在體內的代謝行為，建立了暖宮七味丸中沉香四醇、綠原酸、科羅索酸的HPLC-MS/MS檢測定量方法，并以此方法評價大鼠血漿中3種成分的體內藥動學行為，為后續暖宮七味丸的體內研究提供參考。

圖4 暖宮七味丸揮發性成分的總離子流色譜圖

表2 暖宮七味丸揮發油GC-MS鑒定結果

Table 2 GC-MS identification results of volatile oil in Nuangong Qiwei Pill

峰號tR/minCAS分子式化合物相對分子質量匹配值相對含量/% 126.27544-63-8C14H28O2肉豆蔻酸228.219930.67 235.24111-02-4C30H50角鯊烯410.39994.66 331.13629-78-7C17H36正十七烷240.28971.26 431.96646-31-1C24H50正二十四烷338.39971.06 521.68131-11-3C10H10O4鄰苯二甲酸二甲酯194.06964.65 63.58108-88-3C7H8甲苯92.069523.38 710.105989-27-5C10H16D-檸檬烯136.12950.96 828.1857-10-3C16H32O2棕櫚酸256.24952.59 929.85112-80-1C18H34O2油酸282.26952.69 1033.52629-92-5C19H40癸烷268.31950.32 1137.5757-88-5C27H46O膽固醇386.36950.12 1219.7097-53-0C10H12O2丁香酚164.08930.33 1339.5655103-80-5C22H35BrO21-溴-20-甲基孕烷-5-烯-3β-醇395.19930.27 148.6662-53-3C6H7N苯胺93.06912.41 1514.0717865-32-6C9H20O2Si環己基二甲氧基甲基硅烷188.12910.71 1622.7496-76-4C14H22O2,4-二叔丁基苯酚206.17911.43 1729.35629-94-7C21H44二十烷296.34910.38 1832.26119-47-1C23H32O22,2'-亞甲基二(4-甲基-6-叔丁基苯酚)340.24910.47 1933.20117-81-7C24H38O4鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯390.28911.00 2022.2017312-82-2C13H284,6-二甲基十一烷184.22900.06 2124.006627-88-9C11H14O34-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚194.09900.07 2230.267225-66-3C19H407-己基十三烷268.50870.68 2322.304292-19-7C12H25I1-碘十二烷296.23860.98 2434.676422-86-2C24H38O4對苯二甲酸二(2-乙基己基)酯390.28830.13 2535.9720797-80-2C19H14O7曲霉毒素354.07810.20 265.65106-42-3C8H10對二甲苯106.08800.79 2710.987045-71-8C12H262-甲基十一烷170.20800.47 2817.441000309-14-1C6H14O3S亞硫酸己基戊酯236.15800.75 2925.1513909-73-4C11H14O42',3',4'-三甲氧基苯乙酮210.09800.23 3023.0062238-11-3C13H282,3,5-三甲基癸烷184.22780.14 3135.506627-88-9C11H14O34-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚194.09760.39 3216.981000309-32-8C??H??O?草酸異己基戊酯244.17720.16 3327.916386-38-5C18H28O33-(3,5-二叔丁基-4-羥基苯基)丙酸甲酯292.20720.08 3428.091000309-17-9C19H14O7十二烷基磺酸丁酯306.22720.27 3529.73544-76-3C16H34十六烷226.27720.28

圖5 正離子模式下暖宮七味丸入血成分色譜圖

Fig. 5 Chromatogram of blood components of Nuangong Qiwei Pill under positive ion mode

3種成分的血藥濃度-時間曲線如圖6所示。科羅索酸在給藥后出現雙峰，可能與肝腸循環或者在胃腸道有不同的吸收部位有關。

4 討論

本研究首次采用UPLC-Q-TOF-MS技術從暖宮七味丸中快速分析鑒定出76個化學成分，采用GC-MS技術對蒙藥暖宮七味丸中的揮發性成分進行分析鑒定，通過數據庫比較共鑒定出35個化合物。經大鼠ig給藥后檢測其入血成分，以文獻、標準比對、質譜數據庫相結合的方式，共分析鑒定出19個吸收進入血中的原型成分，包括沉香四醇、6-甲氧基-2-(3′-甲氧基-2-苯乙基)色酮、2-(2-苯乙基)色酮、科羅索酸、肉豆蔻醚、肉豆蔻木脂素、6-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮、6-羥基-(2-苯乙基)色酮、鄰苯二甲酸二丁酯、綠原酸、土木香內酯、丁香酚等。在進行了暖宮七味丸的化學物質組的辨識、入血成分的分析后，又進一步利用UPLC-QTRAP-MS技術研究其藥動學，發現沉香四醇、科羅索酸和綠原酸3種成分具有較明顯的藥動學特征。

物質基礎和藥效是研究Q-Marker的重要節點，而藥物成分的體內藥動學行為是鏈接物質基礎和藥效的“橋梁”，對成分體內暴露情況及其藥代動力學的研究能夠加強物質基礎和藥效之間的關聯性[5,30]。通過研究暖宮七味丸的化學物質組、血中移行成分、藥動學，發現沉香四醇、科羅索酸和綠原酸具有很好的可測性和可追溯性。其中，沉香四醇來源于沉香，現有實驗表明沉香中的2(-2-苯乙基)色酮類物質對乙酰膽堿酯酶呈不同程度的抑制作用，且沉香提取物具有鎮靜催眠、麻醉的作用[31]；研究表明沉香四醇是沉香中特有且有效的活性物質[32]。科羅索酸、綠原酸來源于丁香，丁香在中醫上屬于溫里藥，具有溫中、暖腎、降逆的功效，在蒙醫中是鎮“赫依”藥物，稱為命脈良藥[33-34]。現代研究認為丁香具有抗菌、消炎、鎮痛以及對消化系統的保護作用[35]。以上這3種化學成分均表現出良好的可測性和藥動學特征，可能是暖宮七味丸潛在的Q-Marker。

本研究借鑒中藥Q-Marker的研究經驗，經文獻調研后采用LC-MS/MS及GC-MS技術對蒙藥暖宮七味丸的化學物質組、血中移行成分、藥動學進行研究，從可測性的角度尋找暖宮七味丸的Q-Marker，結果顯示，沉香四醇、綠原酸和科羅索酸可能是暖宮七味丸潛在的Q-Marker。本研究明確了暖宮七味丸的化學物質基礎及入血的原型成分，篩選出3種可能的質量標志物，為暖宮七味丸質量標準化和質量控制的指標成分選擇提供了參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality markers of Mongolian medicine Nuangong Qiwei Pill based on “chemical composition-blood migration component-pharmacokinetics”

ZHANG Chen-chen1, 2, ZHANG Dong-xu1, 2, ZHANG Yu-feng1, 2, ZHANG Ai-jie2, DONG Shi-qi2, HAN Feng3, XING Jie-hong4, FAN Hui-rong2, LIU Xiao-chang5

1. Tianjin university of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China 2. Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300192, China 3. Inner Mongolia Institute for Drug Control, Hohhot 010020, China 4. Inner Mongolia Mongolian Medicine Co., Ltd., Tongliao 028000, China 5. Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China

To study the chemical composition, blood migration components and pharmacokinetics and screen the potential quality markers of Nuangong Qiwei Pill (暖宮七味丸), a Mongolian medicine.The UPLC-Triple-TOF-MS/MS and GC-MS technologies were used in combination with the database and the comparison of standard products to identify the chemical composition and blood migration components of Nuangong Qiwei Pill; UPLC-Q-TRAP-MS/MS was used to study its pharmacokinetics.A total of 76 chemical components were identified by UPLC-Q-TOF-MS/MS and 35 compounds were identified by GC-MS. After intragastric administration in rats, 19 prototype components that were absorbed into the blood were identified. Among them, agarotetrol, chlorogenic acid and corosolic acid showed good testability and obvious pharmacokinetic characteristics.Agarotetrol, chlorogenic acid and corosolic acid may be potential quality markers of Nuangong Qiwei Pill due to its good measurability and traceability in chemical composition-blood migration component-pharmacokinetics analysis.

Nuangong Qiwei Pill; quality markers; chemical components; blood migration components; pharmacokinetics; agarotetrol; chlorogenic acid; corosolic acid

R284.1

A

0253 - 2670(2023)18 - 5855 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.18.004

2023-04-12

內蒙古自治區科技計劃項目（2020GG0199）；國家重點研發計劃項目（2018YFC1708203）

張晨晨，女，碩士研究生，研究方向為中藥藥動學。E-mail: z18340077587@163.com

樊慧蓉，女，研究員，碩士生導師，研究方向為藥動學。E-mail: fanhr99@163.com

[責任編輯 王文倩]