黑眉錦蛇消化道各部位主要消化酶的活力及pH對消化酶活力的影響※

●王 偉 胡雨佳 宋 華 張盛周

（安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院重要生物資源保護與利用重點實驗室 安徽 蕪湖 241000）

黑眉錦蛇（Elaphe taeniura）隸屬于爬行綱（Reptile）有鱗目（Squamata）游蛇科（Colubridae），是一種大型無毒蛇，善攀爬，多捕食鼠類和鳥類。其肉味鮮美，有較高的營養(yǎng)價值，同時其肉、膽、蛻均可作為優(yōu)良的藥材，有很高的經(jīng)濟價值[1]。為保護野生動物資源，黑眉錦蛇的人工養(yǎng)殖已得到大范圍推廣[2]，與其養(yǎng)殖相關(guān)的基礎(chǔ)生物學(xué)研究也在不斷深入開展[3-6]。

研究消化酶的活力，可了解動物對不同營養(yǎng)成分的消化能力，進而為天然飼料的選擇和人工飼料的配制提供理論基礎(chǔ)。目前，國內(nèi)外有關(guān)低等脊椎動物消化酶的研究主要集中在魚類[7-11]和兩棲類[12-15]，爬行動物消化酶的研究也有一些報道[16-20]。宋華等[21]利用酶組織化學(xué)技術(shù)對黑眉錦蛇消化道黏膜過氧化氫酶、非特異性酯酶、三磷酸腺苷酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、琥珀酸脫氫酶等6 種酶進行了定位和活性研究，但黑眉錦蛇消化道中的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶的活力尚未見報道。采用生化檢測方法對黑眉錦蛇消化道蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶的活力及pH 對酶活力的影響進行了研究，旨在增進對黑眉錦蛇消化酶機能的認識，為其人工養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

人工養(yǎng)殖的黑眉錦蛇5 條，均購于蕪湖市吉和市場，單重320～455 g，體長135～160 cm。低溫麻醉，迅速解剖，將消化道分5 段取材，即食道、胃、前腸、中腸、后腸（直腸），用0.65%的生理鹽水快速洗凈，用吸水紙輕輕吸干、稱重。

1.2 酶液的制備

取消化道各段材料，加入25 倍質(zhì)量的4℃蒸餾水后，分別在冰水浴中用勻漿器充分勻漿，再以4000 r/min 的速度冷凍離心10 min，收集上清液即為酶液。置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆茫富盍υ?4 h 內(nèi)測定分析完畢。

1.3 消化酶活力的測定

分別采用福林-酚試劑法、聚乙烯醇橄欖油乳化液水解法、3，5-二硝基水楊酸比色法、羧甲基纖維素鈉水解法對蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶活力進行測定，具體方法參考文獻[14]。

1.4 pH 梯度的設(shè)置

利用不同pH 值的緩沖液來調(diào)節(jié)反應(yīng)的pH條件。4 種緩沖液分別為KCl-HCl 緩沖液（pH 值1.0～1.5）、Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（pH 值2.2～8.0）、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液（pH 值8.0～9.6）、甘氨酸-NaOH 緩沖液（pH 值10.0）。胃消化酶設(shè)置1.0，1.5，2.2，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，7.4，8.0 和9.0共11 個pH 值梯度；食道、前腸、中腸、后腸消化酶設(shè)置2.2，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，7.4，8.0，9.0，9.6 和10.0 共11 個pH 值梯度。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

實驗數(shù)據(jù)用3 次測量的平均值±標準差（Mean±SD）表示，用單因素方差分析（one-way ANOVA）對不同部位消化酶的活力進行差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑眉錦蛇主要消化酶活力

黑眉錦蛇消化道不同部位蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力，見表1。

表1 黑眉錦蛇消化道主要消化酶活力 單位：U/g

由表1 可知，在消化道中，蛋白酶活力排序是前腸＞中腸＞胃＞后腸＞食道。前腸酶活力最高（P＜0.05），中腸和胃酶活力均較高，且兩者差異不顯著（P＞0.05），后腸和食道酶活力均顯著較低（P＜0.05）；脂肪酶活力排序是前腸＞中腸＞胃＞后腸＞食道，前腸和中腸脂肪酶活力顯著較高（P＜0.05），胃酶活力較高，后腸酶活力較低，食道酶活力最低（P＜0.05）；淀粉酶在消化道各段活力均較低，酶活力排序是前腸＞后腸＞中腸＞食道＞胃，前腸酶活力最高（P＜0.05），后腸酶活力次之，中腸和食道酶活力較低，胃酶活力最低（P＜0.05）。此外，還對黑眉錦蛇消化道各段纖維素酶活力進行了檢測，結(jié)果未觀測到明顯的酶活力。

2.2 pH 對消化酶活力的影響

2.2.1 pH 對蛋白酶活力的影響根據(jù)單因素方差分析，不同pH 條件下，黑眉錦蛇消化道各段蛋白酶的活力變化有顯著差異（P＜0.05）。由圖1 可知，食道、胃、前腸、中腸、后腸蛋白酶最適pH 值分別為4.0，2.2，7.4，7.4 和7.0。食道蛋白酶活力最低，整個酶活力曲線變化平緩，在pH 值4.0 時酶活力最大。胃蛋白酶在pH 值1.5～3.0 范圍內(nèi)活力較強，在pH 值1.0～2.2 范圍內(nèi)酶活力上升迅速，在pH 值為2.2 時酶活力最強，pH 值大于2.2 后酶活力急劇下降，至pH值4.0 時酶活力僅有最大值的26%左右。前腸和中腸蛋白酶活力曲線相似，在pH 值2.2～4.0范圍內(nèi)酶活力均較弱，且上升緩慢，在pH 4.0～7.4 范圍內(nèi)，酶活力隨pH 值的升高而迅速升高，pH 值7.4 時酶活力達到最大值，pH 繼續(xù)增大時酶活力迅速下降，至pH 值9.0 時酶活力僅為最大值的37%左右。后腸蛋白酶活力也較低，變化趨勢和食道相似，pH 值為6.0 時酶活力最大。

圖1 pH 對蛋白酶活力的影響

2.2.2 pH 對脂肪酶活力的影響根據(jù)單因素方差分析，不同pH 條件下，黑眉錦蛇消化道各段脂肪酶的活力變化有顯著差異（P＜0.05）。由圖2 可知，食道、胃和后腸的最適pH 值均為6.0，而前腸和中腸的最適pH 值均為7.4。食道和后腸脂肪酶活力變化趨勢相似，在最適pH 值（6.0）前后酶活力上升和下降都較平緩，但后腸酶活力變化稍大。胃脂肪酶活力在pH 值6.0 時達最大值，在pH 值2.2～4.0 和8.0～10.0 范圍內(nèi)上升和下降均較緩慢，在pH 值4.0～6.0 和6.0～8.0 范圍內(nèi)上升和下降均較迅速，在pH 值4.0 與8.0 時酶活力均為最適pH 值時的17%左右。前腸和中腸脂肪酶活力變化趨勢也相似，在pH 值2.2～4.0 范圍內(nèi)酶活力變化不明顯，但在4.0～7.4 范圍內(nèi)急劇上升，在pH 值7.4 時達到最大值，而后至9.0又迅速下降，在pH 值9.0 時酶活力僅為最大值的21%左右。

圖2 pH 對脂肪酶活力的影響

2.2.3 pH 對淀粉酶活力的影響根據(jù)單因素方差分析，不同pH 條件下，黑眉錦蛇消化道各段淀粉酶的活力變化有顯著差異（P＜0.05）。由圖3 可知，食道淀粉酶的最適pH 值為7.0，胃、前腸和中腸最適pH 值均為8.0，后腸最適pH 值為7.4。食道和后腸淀粉酶活力變化趨勢相似，在pH 值3.0～6.0 范圍內(nèi)酶活力均緩慢上升，pH 值6.0 至最適pH 范圍內(nèi)酶活力上升較快，而后又迅速下降，在pH 值10.0 時酶活力幾乎喪失。胃淀粉酶活力較弱，酶活力變化趨勢總體平緩，在pH 值8.0 時酶活力最強。前腸淀粉酶的活力在pH 值3.0～5.0范圍內(nèi)上升較緩慢，而在pH 值5.0～8.0 范圍內(nèi)上升較快，在pH 值8.0 時達最大值，而后至10.0又急劇下降，在pH 值10.0 時約為最大酶活力的12%。中腸淀粉酶活力在pH 值3.0～6.0 范圍內(nèi)上升也較緩慢，在pH 值6.0～8.0 范圍內(nèi)上升稍快，在pH 值8.0 時達最大值，而后至10.0 又迅速下降，在pH 值10.0 時酶活力幾乎喪失。

圖3 pH 對淀粉酶活力的影響

3 討論

3.1 黑眉錦蛇主要消化酶的活力

蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶是動物消化道中的主要消化酶類，本研究在黑眉錦蛇消化道中檢測到蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力，未檢測到明顯的纖維素酶活力。不同消化酶在黑眉錦蛇消化道中的活力存在顯著差異，蛋白酶和脂肪酶活力較強，淀粉酶活力較弱，這與黃金鱸（Perca flavescens）[7]、牛蛙（Rana catesbeinana）[14]、虎斑頸槽蛇（Rhabdophis tigrinus lateralis）[19]、棕黑錦蛇（Elaphe schrenckii）[20]等動物的消化酶活力情況相一致。消化酶活力與動物的食性密切相關(guān)，肉食性動物的蛋白酶、脂肪酶活力相對較強，草食性動物的淀粉酶活力相對較強，黑眉錦蛇多捕食鼠類和鳥類等，屬于肉食性動物，其蛋白酶及脂肪酶活力較強。在黑眉錦蛇養(yǎng)殖過程中，可對人工飼料的成分進行調(diào)整，適當(dāng)提高飼料中蛋白質(zhì)和脂肪的含量，減少淀粉含量。

在最適pH 值下，黑眉錦蛇消化道中蛋白酶活力在前腸最強，中腸和胃次之。不同動物消化道中蛋白酶活力分布有較大差異，如黃金鱸[7]和蒙古鲌（Culter mongolicus）[8]蛋白酶活力均在前腸顯著較高，與本研究結(jié)果相似，而牛蛙[14]、幼鱉（Trionyx sinensis）[16]和北草蜥（Takydromus septentrionalis）[17]的蛋白酶活力均為胃強于腸道。黑眉錦蛇脂肪酶活力在前腸和中腸較強，黑斑蛙（Rana nigromaculata）[13]脂肪酶活力在中腸顯著較強，而黃金鱸[7]脂肪酶活力以胃最強，牛蛙[14]脂肪酶活力在后腸較強。黑眉錦蛇淀粉酶活力在前腸顯著較強，黃金鱸[7]淀粉酶活力也在前腸較強，而蒙古鲌[8]淀粉酶在各部位分布無明顯差異，翹嘴紅鲌（Erythroculter illshaeformis）[10]和牛蛙的淀粉酶活力均在中腸較強，可見不同動物的消化酶分布存在物種特異性。黑眉錦蛇消化道中消化酶的分布表明前腸、中腸和胃是蛋白質(zhì)的主要消化部位，前腸和中腸是脂質(zhì)的主要消化部位，前腸是淀粉的主要消化部位。

3.2 pH 對消化酶活力的影響

pH 是影響酶促反應(yīng)的重要因素之一，pH 值過大或者過小都會影響酶的活力。本研究中pH對蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力的影響均較為顯著，且三種酶的活力隨pH 值的變化曲線大都呈單峰型。蛋白酶活力在不同組織中的最適pH 值不同，其中胃蛋白酶活力的最適pH 值為2.2，表明胃蛋白酶在強酸性時活力較強，這與胃中蛋白質(zhì)只有在強酸時才能被有效分解的結(jié)論[22]一致。黃金鱸[7]和牛蛙[14]胃蛋白酶活力最適pH 值分別為2.5 和2.2，均與本研究結(jié)果相似，但金建麗等[20]對棕黑錦蛇的研究顯示胃蛋白酶活力的最適pH 值為6.6。蒙古鲌[8]、翹嘴紅鲌[10]和牛蛙[14]腸道蛋白酶活力的最適pH 值分別為7.4，7.0，7.4，本研究中黑眉錦蛇的腸道蛋白酶活力最適pH 值在7.0～7.4，與上述動物研究結(jié)果相類似。但黃金鱸[7]腸道蛋白酶活力最適pH 值為9.0，棕黑錦蛇[20]腸道蛋白酶活力最適pH 值在8.6～9.0，明顯高于黑眉錦蛇。

大量研究表明，腸道脂肪酶在中性pH 環(huán)境中活力較強，如黃金鱸[7]腸道脂肪酶活力的最適pH 值為6.0～7.0，蒙古鲌[8]、翹嘴紅鲌[10]和牛蛙[14]腸道脂肪酶活力的最適pH 值均為7.4。黑眉錦蛇的脂肪酶活力在前腸和中腸的最適pH 值均為7.4，在后腸的最適pH 值為6.0，與上述幾種動物的研究結(jié)果相一致。黑眉錦蛇胃脂肪酶活力最適pH 值為6.0，而牛蛙[14]胃脂肪酶活力最適pH 值為2.2，黑斑蛙[13]胃脂肪酶活力最適pH值為5.0，棕黑錦蛇[20]胃脂肪酶活力最適pH 值為5.4，表明不同動物胃脂肪酶活力的最適pH 值存在一定的物種特異性。

黃金鱸[7]胃淀粉酶活力最適pH 值為6.0，牛蛙[14]淀粉酶在胃中最適pH 值為7.0，棕黑錦蛇[20]胃淀粉酶活力最適pH 值為6.2。而本研究中黑眉錦蛇的淀粉酶活力在胃中最適pH 值為8.0，明顯高于上述動物胃淀粉酶的最適pH 值。黃金鱸[7]、蒙古鲌[8]、翹嘴紅鲌[10]和牛蛙[14]的腸道淀粉酶活力最適pH 值分別為7.0，7.4，7.0，8.0，黑眉錦蛇的淀粉酶活力在前腸和中腸最適pH 值為8.0，在后腸最適pH 值為7.4，與上述動物消化道淀粉酶活力的最適pH 范圍相一致，但棕黑錦蛇[20]腸道淀粉酶活力的最適pH 值為5.8～6.6。

蛋白酶和脂肪酶是黑眉錦蛇消化道主要消化酶類，黑眉錦蛇胃蛋白酶活力在強酸下較強，脂肪酶活力也在酸性時較強。據(jù)此，在配制黑眉錦蛇人工飼料時，適量添加酸化劑可提高黑眉錦蛇對飼料中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的消化能力，進而提高養(yǎng)殖效益。