血管內皮生長因子-A165對形覺剝奪性近視豚鼠鞏膜重塑的影響

彭慶生,高洪蓮,孫瑞婷,張鳳一,王 磊,李 童,張 磊

0 引言

近視是全世界主要的公共衛生問題之一[1]。全球約有26.20億人患有近視,3.99億人患有高度近視,據估計到2050年,全球將有近47.58億近視患者,其中高度近視患者達到9.38億[2]。近視,尤其是高度近視不僅會導致模糊的視覺,還將極大地增加眼部病變的風險,引發脈絡膜新生血管、視網膜萎縮、視網膜脫離和視神經病變等疾病[3-4]。目前高度近視已成為全球人口視力損傷的主要原因之一[5]。因此,采取有效的防控措施對于預防近視發生和減少向高度近視進展至關重要。

目前研究表明,眼軸增長是引發近視的主要原因[6],而鞏膜重塑變薄與眼軸延長顯著相關,其不僅是眼軸增長的主要機制,還是近視發生時的重要改變[7-8],因此鞏膜重塑可能是控制近視的關鍵靶點。而鞏膜重塑主要依賴于其細胞外基質成分的改變,受多種因子調控[9],主要包括基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基質金屬蛋白酶抑制劑-2(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-2,TIMP-2)、轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)-β及α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)等重要因子。視網膜中的多巴胺(dopamine,DA)是一種重要的神經遞質,在視覺信息傳遞和屈光發育調節中發揮關鍵作用[10-11],其活性改變可以通過視網膜-鞏膜級聯機制影響鞏膜重塑,進而調節眼球的生長發育,被認為是近視的終止信號[12-13]。而血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)-A165具有直接和間接的神經營養和神經保護作用[14],可以保護視網膜神經元[15],體內外均能促進DA神經元的存活和功能恢復[16-17],故推測其在玻璃體腔內注射后可以作用于視網膜神經元,調節視網膜中DA的活性,進而影響鞏膜重塑。本研究通過遮蓋豚鼠右眼建立形覺剝奪性近視(form-deprivation myopia,FDM)模型,探討玻璃體腔內注射VEGF-A165對FDM豚鼠鞏膜重塑的影響及其對近視的干預作用,從而為近視防控提供新的思路。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組選取健康3周齡英國短毛三色豚鼠120只(濟南金豐實驗動物有限公司),雌雄不限,體質量150～200g。采用隨機數字表法將豚鼠分為空白組、FDM組、PBS組、1ng組、5ng組、10ng組,每組20只。自然照明環境下12h/12h晝夜循環,自由攝水攝食,維持溫度為22℃～25℃,濕度為50%～70%。本研究通過濱州醫學院附屬醫院倫理委員會審批(批準號:20220128-77),實驗動物的使用嚴格遵循濱州醫學院動物管理委員會的相關規定。

1.1.2主要試劑與儀器主要試劑:重組人蛋白VEGF-A165(美國R&D Systems公司);復方托吡卡胺滴眼液(參天制藥中國有限公司);組織RNA快速提取試劑盒(艾科瑞生物工程有限公司);兔抗鼠MMP-2(A6247)、TIMP-2(A16439)、TGF-β1(A16640)、TGF-β2(A3640)、α-SMA(A1011)多克隆抗體(中國ABclonal股份有限公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京碧云天生物科技有限公司)。主要儀器:帶狀光檢影鏡(蘇州六六視覺科技有限公司);A型超聲(法國Quantel公司);高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher公司)。

1.2方法

1.2.1動物模型建立空白組豚鼠不做任何干預;FDM組、PBS組、1ng組、5ng組、10ng組豚鼠均用修剪出左眼、雙耳和口鼻的半透明無毒氣球遮蓋右眼處理,分籠飼養,每天光照與黑暗周期為12h/12h,連續遮蓋14d建立形覺剝奪性近視豚鼠模型。

1.2.2藥物干預遮蓋前根據分組在PBS組、1ng組、5ng組、10ng組豚鼠右眼玻璃體腔內分別注射PBS緩沖液2.5μL、重組人蛋白VEGF-A1651、5、10ng[16-17],其中VEGF-A165均溶于2.5μL的PBS緩沖液中。玻璃體腔注射前1d使用妥布霉素滴眼液滴右眼。舒泰肌肉注射麻醉,聚維酮碘消毒豚鼠結膜囊及眼表后用生理鹽水沖洗干凈,顯微鏡下用眼科鑷固定眼球,注射器垂直鞏膜進針,避開晶狀體推進約2～3mm后注射,停留10s后用眼科鑷輕輕夾住針孔輔助拔出針頭,觀察有無液體流出、結膜有無紅腫,氧氟沙星眼膏涂眼,半透明無毒氣球遮眼。術后3d內觀察右眼有無炎癥,氧氟沙星眼膏涂眼(每日3次)。

1.2.3眼部生物學參數測量造模前后分別測量各組豚鼠右眼的屈光度和眼軸長度。測量屈光度前,用復方托吡卡胺滴眼液滴右眼散瞳,待瞳孔充分散大后使用帶狀光檢影鏡測量屈光度,由經驗豐富的檢影師驗光,根據工作距離以等效球鏡度(球鏡度+1/2柱鏡度)進行數據分析,連續測量5次計算平均值作為該眼的屈光度。測量眼軸長度前,用鹽酸丙美卡因滴眼液行角膜表面麻醉,待藥物生效后應用眼部A超測量眼軸長度,選擇手動模式連續測量5次計算平均值,精確到0.01mm。

1.2.4標本收集造模結束后,注射凝血劑處死豚鼠,摘取右眼眼球,于冰上快速取其視網膜和后極部鞏膜,保存于-80℃冰箱。

1.2.5高效液相色譜法檢測視網膜中DA含量取各組豚鼠視網膜稱重,每mg組織樣本加入新鮮配制的勻漿液20μL(H3ClO40.1mol/L,EDTA Na20.1mmo/L,內標物DHBA),-40℃冷凍勻漿(2mm氧化鋯珠,60Hz,30s,4次);低溫離心(20000r/min,30min,4℃)后取上清保存于-80℃冰箱。測樣前取出再次離心(20000r/min,30min,4℃)后取上清液上機檢測。色譜柱:Thermo Acclaim Rapid Separation Liquid Chromatography (RSLC) 2.1*100mm C182.2μm,柱溫40℃;流動相:含NaH2PO490mmo/L,檸檬酸50mmo/L,OSA 1.7mmo/L,EDTA 50μmol/L和乙腈4.5%。所有數據均由Chromeleon 6.9色譜工作站采集與分析,以內標法計算目標物濃度。

1.2.6RT-PCR法檢測鞏膜中MMP-2、TIMP-2、TGF-β2、TGF-β1、α-SMAmRNA的表達取各組豚鼠鞏膜,在低溫研磨儀中充分研磨后,根據試劑盒說明書中的純化步驟提取鞏膜總RNA,隨后將RNA反轉錄成cDNA,反應程序:42℃孵育2min,37℃孵育15min,85℃加熱5s,以4℃降溫結束。以GAPDH為內參(引物序列見表1),進行PCR擴增,反應程序:95℃預變性1min,95℃變性10s,60℃延伸30s,循環40次,記錄Ct值,使用2-ΔΔCt法計算各目的基因相對表達量。

表1 引物序列

1.2.7Westernblot法檢測鞏膜中MMP-2、TIMP-2、TGF-β2、TGF-β1、α-SMA蛋白的表達根據分組將豚鼠鞏膜置于不同的研磨管中,加入裂解液和蛋白酶抑制劑后于低溫研磨儀中研磨5min,轉移至EP管,置于4℃中靜置30min,低溫離心30min(4℃,12000r/min),取上清液于新的EP管中,采用BCA濃度測定試劑盒測定蛋白濃度,剩余上清液中加入5×loading buffer,恒溫金屬浴中98℃煮5～10min,蛋白樣品經電泳、轉膜后,室溫條件下加入5% BSA封閉2h,加入對應的一抗稀釋液(抗體的稀釋方法參照其說明書選取稀釋溶液與最佳濃度),于4℃冰室搖床上孵育過夜,TBST沖洗3次×15min,室溫條件下加入二抗孵育1h,TBST沖洗4次×15min,化學發光法顯影,Image J軟件分析灰度值。

2 結果

2.1眼部生物學參數造模前,各組豚鼠右眼均呈現遠視狀態,各組豚鼠右眼屈光度、眼軸長度差異均無統計學意義(P>0.05)。造模14d后,與空白組相比,FDM組豚鼠右眼屈光度變為負值,眼軸顯著延長,差異均有統計學意義(P<0.01);與FDM組相比,PBS組豚鼠右眼屈光度、眼軸長度未發生明顯變化(均P>0.05),而1ng組、5ng組、10ng組豚鼠右眼向近視偏移程度均減輕,眼軸長度均較短(均P<0.01),其中1ng組豚鼠右眼近視偏移程度和眼軸長度均低于5ng組和10ng組,5ng組豚鼠右眼屈光度和眼軸長度均低于10ng組,三組間兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05),見表2。

表2 各組豚鼠造模前后右眼屈光度和眼軸長度比較

2.2高效液相色譜法檢測視網膜中DA含量造模14d后,空白組、FDM組、PBS組、1ng組、5ng組、10ng組豚鼠右眼視網膜中DA含量分別為108.737±8.297、58.623±6.547、61.383±7.900、98.202±6.170、84.535±11.470、72.275±6.863ng/g,差異有統計學意義(F=37.555,P<0.01)。與空白組相比,FDM組豚鼠右眼視網膜中DA含量明顯降低,差異有統計學意義(P<0.01);與FDM組相比,PBS組豚鼠右眼視網膜中DA含量未發生明顯變化(P>0.05),而1ng組、5ng組、10ng組豚鼠右眼視網膜中DA含量均增加(均P<0.01),其中1ng組增加較5ng組明顯,5ng組增加較10ng組明顯,三組間兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.3RT-PCR法檢測鞏膜中相關基因的表達造模14d后,與空白組相比,FDM組豚鼠右眼鞏膜中MMP-2、TGF-β2、α-SMA mRNA相對表達量均增加,TGF-β1、TIMP-2 mRNA相對表達量均減少,差異均有統計學意義(P<0.01);與FDM組相比,PBS組豚鼠右眼鞏膜中各目的基因的相對表達量未發生明顯變化(均P>0.05),而1ng組、5ng組、10ng組豚鼠右眼鞏膜中MMP-2、TGF-β2、α-SMA mRNA相對表達量均減少,TGF-β1、TIMP-2 mRNA相對表達量均增加(均P<0.01),其中1ng組豚鼠右眼鞏膜中MMP-2、TGF-β2、α-SMA mRNA相對表達量均低于5ng組和10ng組,TGF-β1、TIMP-2 mRNA相對表達量均高于5ng組和10ng組(均P<0.01),5ng組豚鼠右眼鞏膜中TGF-β2、α-SMA mRNA相對表達量均低于10ng組,TGF-β1、TIMP-2 mRNA相對表達量均高于10ng組(均P<0.01), 但5ng組和10ng組豚鼠右眼鞏膜中MMP-2 mRNA相對表達量差異無統計學意義(P=0.353),見表3。

表3 造模后各組豚鼠鞏膜中相關基因的表達

2.4Westernblot法檢測鞏膜中相關蛋白的表達造模14d后,與空白組相比,FDM組豚鼠右眼鞏膜中MMP-2、TGF-β2、α-SMA蛋白相對表達量均增加,TIMP-2、TGF-β1蛋白相對表達量均減少,差異均有統計學意義(P<0.01);與FDM組相比,PBS組豚鼠右眼鞏膜中各蛋白相對表達量未發生明顯變化(均P>0.05),而1ng組、5ng組、10ng組豚鼠右眼鞏膜中MMP-2、TGF-β2、α-SMA蛋白相對表達量均減少,TIMP-2、TGF-β1蛋白相對表達量均增加(均P<0.01),其中1ng組豚鼠右眼鞏膜中MMP-2、TGF-β2、α-SMA蛋白相對表達量均低于5ng組和10ng組,TGF-β1、TIMP-2蛋白相對表達量均高于5ng組和10ng組(均P<0.01),5ng組豚鼠右眼鞏膜中TGF-β2、α-SMA蛋白相對表達量均低于10ng組,TGF-β1、TIMP-2蛋白相對表達量均高于10ng組(均P<0.05), 但5ng組和10ng組豚鼠右眼鞏膜中MMP-2蛋白相對表達量差異無統計學意義(P=0.610),見圖1。

圖1 造模后各組豚鼠鞏膜中相關蛋白的表達 A:Western Blot電泳圖;B:MMP-2蛋白相對表達量(F=99.230,P<0.01);C:TIMP-2蛋白相對表達量(F=94.752,P<0.01);D:TGF-β2蛋白相對表達量(F=49.873,P<0.01);E:TGF-β1蛋白相對表達量(F=121.672,P<0.01);F:α-SMA蛋白相對表達量(F=56.915,P<0.01)。bP<0.01 vs 空白組;dP<0.01 vs FDM組;fP<0.01 vs 1ng組;gP<0.05,hP<0.01 vs 5ng組。

3 討論

近年來,近視的病因及機制一直是眼科研究的熱點,盡管具體的機制目前仍不清楚,但多數研究認為眼軸長度的異常增加是引發近視的主要原因,鞏膜細胞外基質重塑是眼軸增長的主要機制[7-8,18]。當鞏膜重塑發生時,其細胞外基質中膠原降解增加、蛋白聚糖合成減少、成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化,鞏膜原纖維組裝紊亂,鞏膜生物力學變弱,鞏膜逐漸變薄和延伸,眼軸隨之延長,近視也逐漸發展[9,19]。由此可見,鞏膜重塑在近視的發生和發展中起著關鍵作用,可能是近視機制的一個關鍵靶點。

鞏膜重塑是一個受多因素調控的動態過程,其中局部缺氧是該過程的主要誘因。研究表明,缺氧可以調控鞏膜重塑相關因子的活動,引起細胞外基質中膠原含量的下降和肌成纖維細胞的轉分化,最終導致鞏膜重塑[20-21]。同時,MMP-2在該過程中也發揮重要作用,其含量的增加不僅可使鞏膜中Ⅰ型膠原的降解增加,使膠原纖維逐漸變細,引起鞏膜重塑,近視的啟動也依賴于MMP-2的表達增加[22-23];而TIMP-2是MMP-2的內源性抑制因子,可使鞏膜中膠原的降解減少,兩者之間的失衡可引起鞏膜細胞外基質代謝異常,膠原蛋白水平下降,從而導致細胞外基質重塑[24-25]。α-SMA在鞏膜重塑中也發揮關鍵作用,其具有細胞收縮特性,可以促進近視發生時鞏膜的變薄和延伸,同時α-SMA表達量的增加標志著肌成纖維細胞的轉分化和細胞應力的增加[26-27]。TGF-β在調節細胞外基質成分的轉換中發揮重要作用,不僅可以調節成纖維細胞的轉化和膠原蛋白的含量,還可以特異性調節鞏膜細胞的收縮特性,影響α-SMA的表達[26],其中TGF-β1不僅可以促進鞏膜成纖維細胞的增殖,還可調控Ⅰ型膠原的合成,增加基質中膠原的含量[28],而TGF-β2主要調節基質中成纖維細胞的增殖[29],可以呈劑量依賴性地促進大鼠鞏膜中成纖維細胞的增殖,使鞏膜增厚[30]。綜上所述,MMP-2、TIMP-2、TGF-β1、TGF-β2、α-SMA在調控鞏膜細胞外基質重塑中發揮關鍵作用,因此通過測定上述指標的表達,可以有效觀察鞏膜重塑情況。現已有大量研究表明,隨著近視的發生,鞏膜中MMP-2、TGF-β2、α-SMA的表達增加[9,26],TIMP-2、TGF-β1的表達降低[24,28],這與本研究中FDM組豚鼠右眼鞏膜中各種因子的表達一致,均代表著近視性鞏膜重塑的建立。

視網膜中的DA是傳遞視覺信息的視網膜-鞏膜信號級聯的起點,與眼球的屈光發育息息相關[13]。研究表明,DA活性的改變可以影響視網膜與其色素上皮層中的信號通路,進而影響脈絡膜和鞏膜之間的信息傳遞,最終通過鞏膜的細胞外基質重塑調節眼睛的生長發育[12,20]。同時,VEGF已經被證明是一種潛在的治療中樞神經系統疾病的藥物,可以通過營養DA神經元,增加神經遞質DA的分泌[17,31],其中VEGF-A165是主要的同種型,在海馬神經節、背根神經節和視網膜神經元中均具有神經保護作用,對神經元具有直接的抗細胞毒性作用[15-16]。所以我們推測VEGF-A165在眼內可以增加視網膜中DA的活性,對鞏膜重塑產生影響,從而干擾近視發展。本課題組前期研究發現,玻璃體腔內注射抗VEGF藥物(康柏西普)會降低FDM豚鼠視網膜中DA含量,促進近視發展[32],間接證明了VEGF對視網膜中DA含量的影響。

本研究通過玻璃體腔內注射VEGF-A165,驗證其對FDM豚鼠鞏膜重塑的影響,以及對FDM的干擾效果。Beazley-Long等[16]研究發現,玻璃體腔內注射10ng VEGF-A165對大鼠視網膜神經元具有神經保護作用,可減少視網膜神經節細胞和內核層細胞凋亡;同時,Meng等[17]研究提出,VEGF對DA神經元的保護作用具有劑量依賴性,在1ng/mL組和10ng/mL組中,1ng/mL組的神經保護作用更強。因此,本研究采用了3種不同劑量(1、5、10ng)進行注射,探究不同劑量VEGF對FDM豚鼠鞏膜重塑的作用是否也會有差異。結果顯示,與FDM組相比,VEGF-A165處理組豚鼠視網膜中DA含量均增加,這與Sheikh等[31]研究結果一致,該研究表明VEGF對DA神經元具有保護作用,本研究進一步證明了這種神經保護可以作用于視網膜DA神經元,增加視網膜中DA的含量。同時,本研究發現,1ng組、5ng組、10ng組豚鼠近視程度均降低,眼軸增長趨勢明顯減緩,鞏膜中MMP-2、TGF-β2、α-SMA表達量均減少,TIMP-2、TGF-β1表達量均增加,而Yu等[9]和Jobling等[26]研究認為,近視恢復期豚鼠鞏膜中MMP-2、TGF-β2、α-SMA表達的降低以及TIMP-2、TGF-β1表達的升高,代表著基質中膠原含量的升高、鞏膜厚度的增加等,這些均提示近視性鞏膜重塑受到抑制。因此,本研究結果表明VEGF-A165可以增加視網膜中DA含量,對鞏膜重塑產生抑制作用,抑制近視進展。Lin等[33]研究表明,玻璃體腔內注射DA主要通過調節鞏膜發育抑制近視發展,而本研究結果提示鞏膜細胞外基質的增加會抑制近視的發展,間接證明了視網膜與鞏膜之間的級聯信號在近視發生發展中的作用,同時還提出了一種可以提高視網膜中DA濃度的方法,即玻璃體腔內注射VEGF-A165。

此外,本研究發現,隨著VEGF-A165劑量的增加,近視偏移程度加重,視網膜中DA含量逐漸減少,鞏膜中MMP-2、TGF-β2、α-SMA表達量均逐漸增加,TIMP-2、TGF-β1表達量均逐漸減少,但鞏膜中MMP-2在5ng組與10ng組中的表達無顯著差異。分析其原因是由于鞏膜缺氧時缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)主要被激活[21],引起鞏膜重塑相關因子的改變,而缺氧時MMP-2的上調依賴于HIF-2α的表達而不是HIF-1α的表達[34],且房水中MMP-2濃度達到一定范圍時與VEGF-A呈負相關[35],但具體機制還需進一步探討。本研究中,增加VEGF-A165的劑量反而會減弱對豚鼠鞏膜重塑的抑制作用,其中1ng劑量的抑制效果最好。推測其可能的機制主要有以下兩種:(1)視網膜中DA含量的降低導致了這種結果。由于DA主要通過影響鞏膜的發育和重塑調控近視的發生發展[12],且降低視網膜中DA的含量會促進近視發展[32],因此本研究中玻璃體腔注射VEGF-A165劑量增加引起視網膜中DA含量相對降低,可能通過級聯信號減弱對鞏膜重塑的抑制作用,從而發揮對近視的促進作用;而視網膜中DA含量由1ng組到10ng組逐漸減少的原因,可能是由于VEGF-A165對DA神經元的作用在低劑量下獲益最大[17]導致的;(2)VEGF-A165過量可能透過血-視網膜屏障直接作用于脈絡膜[36],誘導病理性血管生成,使脈絡膜毛細血管被血栓阻塞[37],進而減少了脈絡膜血流灌注,加重了鞏膜的缺氧[20],從而相對性地促進了5ng組與10ng組豚鼠鞏膜細胞外基質的重塑。但對于以上兩種推測的驗證,還需通過對VEGF-A165作用機制的進一步研究闡明。

本研究通過在FDM豚鼠玻璃體腔內注射不同劑量的VEGF-A165,發現均會增加視網膜中DA含量,對豚鼠鞏膜重塑起到抑制作用,抑制FDM進展。其機制可能是VEGF-A165通過營養和保護視網膜DA神經元,增加視網膜中DA的活性,進而通過信號級聯抑制鞏膜重塑,從而發揮對近視的抑制作用,但具體的發生機制還需進一步實驗研究。同時本研究發現,1、5、10ng VEGF-A165對鞏膜重塑的抑制作用存在差異,其中1ng效果最好,5ng次之,10ng最差。本文不足之處在于僅觀察了3種劑量VEGF-A165作用的差異,對于更小或更大濃度梯度是否還會存在差異,以及0.5ng或2ng是否會有比1ng具有更好的效果等問題尚不明確,因此還需在此研究基礎上進一步探討VEGF-A165作用的最佳劑量范圍,準確把握劑量差異對個體造成的影響,從而為以后VEGF-A165用于臨床近視防控提供實驗基礎。