左歸丸通過FNDC5/Wnt3a/β-catenin通路治療絕經后骨質疏松癥的機制研究

黃展輝 魏其鵬 梁煒瑜 周季青 丁富平 張進*

1.廣州中醫藥大學中西醫結合基礎研究中心,廣東 廣州 510006

2.廣州中醫藥大學,廣東 廣州510006

3.廣州中醫藥大學護理學院,廣東 廣州510006

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis, PMOP)是以女性絕經后因雌激素分泌不足而導致的骨量降低、骨微結構損害、骨脆性增大為特征的一種全身代謝性骨病[1]。中國已經進入了中重度人口老齡化社會,進入絕經期后的女性數量增多帶來PMOP高發性的危機。PMOP作為老年女性一種高發的疾病,現已成為一個嚴重的公共衛生問題,針對PMOP的預防和治療是非常有意義的。

大量的臨床觀察性研究發現左歸丸具有治療PMOP的作用[2],但左歸丸在治療PMOP方面有著多效性、多方向的特性,其潛在的作用機制還未能完全明了。因此,目前臨床上僅將左歸丸作為一種替代療法使用。中醫藥在治療PMOP上有著便捷、費用低、安全性高的特點[3-4]。因此,研究左歸丸治療PMOP的潛在機制對于明確左歸丸療效以及擴大臨床治療使用有著重大意義。

FNDC5/Irisin作為新發現的運動因子,其與骨骼有著密切的聯系。一項研究發現,外源性注射Irisin可以改善卵巢切除(OVX)小鼠的骨骼,Irisin能增加成骨細胞并減少破骨細胞的數量,從而維持OVX小鼠骨量和質量[5]。而Wnt信號通路是調節成骨分化的重要通路之一[6]。同時有研究發現左歸丸能夠通過調控Wnt/β-catenin信號通路影響去勢骨質疏松模型大鼠[7]。但左歸丸通過調節FNDC5進而調控Wnt/β-catenin信號通路治療絕經后骨質疏松癥尚未見報道。因此,本研究將通過小鼠體內外實驗,對左歸丸治療絕經后骨質疏松癥的相關作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物及細胞:雄性SD大鼠20只,體重為250～300 g,購自廣州中醫藥大學實驗動物中心;FNDC5基因敲除(KO)小鼠由賽業生物科技有限公司構建并提供F1代C57BL/6小鼠,后續由本課題組自行飼養繁育;野生型C57BL/6小鼠購于廣州中醫藥大學動物實驗中心。選用8周齡雌性野生型和KO小鼠各15只,體重為(20±1)g,在廣州中醫藥大學動物實驗中心的SPF級動物房飼養,循環晝夜光照12 h,溫度(25±2)℃,濕度60 %～65 %,自由飲食飲水。每次實驗都嚴格遵守動物實驗倫理要求。小鼠MC3T3-E1細胞,購自中國醫學科學院細胞庫。

1.1.2藥物及試劑:左歸丸(熟地黃24 g、川牛膝9 g、山茱萸12 g、山藥12 g、鹿角膠12 g、菟絲子12 g、枸杞子12 g、龜板膠12 g)購自廣東省中醫院。以上藥物(除鹿角膠和龜板膠)加水至完全沒過飲片,浸泡30 min,煎煮30 min后將鹿角膠和龜板膠烊化后加入水煎液中,過濾,濃縮,除菌,4 ℃冷藏備用。堿性磷酸酶試劑盒(A059-2-2,中國建成科技);堿性磷酸酶染色試劑盒偶氮偶聯法(G1480-4,中國Solarbio);HE染色液試劑盒(G1120,中國羅基生物);RNA transmate轉染試劑(E607402-1000,中國生工);β-甘油磷酸鈉(G806967,中國Macklin);抗壞血酸(A92902,美國Sigma);EDTA脫鈣液(G1105,中國Servicebio);組織RNA提取試劑盒(EZB-RN001-plus,中國EZB);彩色逆轉錄試劑盒(A0010CGQ,中國EZB),實時熒光定量試劑盒(EZB-Probe-R2-L,中國EZB);小鼠I型前膠原N端前肽(PINP)酶聯免疫分析試劑盒(MM-43891M2,中國MEIMIAN)、小鼠血清雌二醇(E2)酶聯免疫分析試劑盒(MM-0566M2,中國MEIMIAN)、小鼠Irisin酶聯免疫分析試劑盒(MM-1119M2,中國MEIMIAN);BCA試劑盒(WLA004b,中國萬類生物);GAPDH(D16H11,美國CST)、Wnt3a(C64F2,美國CST)、β-catenin(D10A8,美國CST);FNDC5抗體(DF13019,中國Affinity Biosciences);辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)二抗(A0208,中國Beyotime)。

1.1.3儀器:雙能X線骨密度儀,美國Hologic公司;紫外分光光度計,美國NanoDrop科技有限公司;實時熒光定量PCR儀(型號:CFX96),美國Bio-Rad公司;酶標儀,美國Thermo公司;多功能自動染色機、病理切片機、全自動組織脫水機,德國Leica公司;生物顯微鏡,日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1動物分組:將SD大鼠隨機分成空白對照組、左歸丸低、中、高濃度四組,左歸丸低、中、高濃度組大鼠按體重對應的每日灌胃劑量為10.5 g/kg、21 g/kg、42 g/kg,空白對照組大鼠灌胃等量生理鹽水,連續灌胃7 d。灌胃后取各組大鼠含藥血清。將8周齡野生型雌性C57BL/6小鼠,按每組5只隨機分為三組:野生型對照組、野生型OVX組、野生型治療組。將8周齡雌性KO小鼠,按每組5只隨機分為三組:KO對照組、KO-OVX組、KO治療組。野生型OVX組、野生型治療組、KO-OVX組、KO治療組行卵巢切除,野生型對照組和KO對照組僅切除卵巢周圍脂肪。術后適應性喂養1周后進行灌胃,野生型治療組和KO治療組灌胃左歸丸水提液[15.75 g/(kg·d)],其余各組灌胃等量生理鹽水,連續給藥12周。

1.2.2細胞培養及分組:用10 %血清+1 %鏈霉素-青霉素溶液+89 % α-MEM培養MC3T3-E1細胞,接種于無菌培養皿中。將MC3T3-E1細胞接種于12孔板上,細胞分組為空白對照組、成骨誘導組(OGI組)、成骨誘導+左歸丸低濃度組(OGI-ZL組)、成骨誘導+左歸丸中濃度組(OGI-ZM組)、成骨誘導+左歸丸高濃度組(OGI-ZH組)、成骨誘導+轉染組(siOGI組)、成骨誘導+轉染+左歸丸低濃度組(siOGI-ZL組)、成骨誘導+轉染+左歸丸中濃度組(siOGI-ZM組)和成骨誘導+轉染+左歸丸高濃度組(siOGI-ZH組),每一組使用對應的大鼠血清培養。

1.2.3細胞轉染:在細胞長至40 %～50 %時進行轉染。空白對照組、OGI組、OGI-ZL組、OGI-ZM組、OGI-ZH組加入10 μmol/L空載轉染混合液,siOGI組、siOGI-ZL組、siOGI-ZM組和siOGI-ZH組加入含10 μmol/L FNDC5-SiRNA轉染混合液。6 h后更換培養液,24 h后進行成骨誘導。

1.2.4成骨誘導:除空白對照組外其余各組的培養液里加入50 μg/mL VC+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉。每隔2 d換液一次。取第5、7、14天的細胞培養液進行細胞上清ALP活力檢測。取第7天的細胞進行細胞ALP染色。

1.2.5骨密度檢測:灌胃12周后,將各組小鼠放置于雙能X線骨密度分析儀下檢測骨密度(bone mineral density, BMD)。

1.2.6血清ELISA檢測:灌胃12周后,通過眼球摘除方式收集小鼠全血1 mL,室溫靜置30 min后,在4 ℃條件下3 000 r/min離心15 min后,分離血清。具體操作嚴格按照相應的ELISA試劑盒說明書步驟進行。

1.2.7股骨切片和HE染色:分離小鼠股骨組織,在4 %多聚甲醛中充分固定24 h,EDTA脫鈣液脫鈣1個月。脫鈣后進行組織脫水、浸蠟、包埋等制做石蠟切片。切片經脫蠟、蘇木精-伊紅染色、脫水、透明、封片等步驟后在顯微鏡下拍照采集圖像。

1.2.8實時熒光定量聚合酶鏈式反應:使用RNA提取純化試劑盒提取股骨組織RNA。使用彩色逆轉錄試劑盒合成cDNA,使用實時熒光定量試劑盒在PCR儀上進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time PCR)。以β-actin為參照基因,用2-△△Cq法進行定量。引物序列:β-actin:上游CATTGCTGA CAGGATGCAGA,下游CTGCTGGAAGGTGGACA GTGA;FNDC5:上游GCTAGGCTGCGTCTGCTTCG,下游GCTAGGCTGCGTCTGCTTCG;Runx2:上游CATCGCTTTCAAGGTGGTGG,下游ATGGCTGCGGT AGCATTTCT;OPN:上游CTCCATTGACTCGAA CGACTC,下游CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGAT;OCN:上游GACCTC ACAGATGCCAAGCCC,下游ATAGATGCGTTTGTAGGCGGTC;OSX上游AGC GACCACTTGAGCAAACAT,下游GCGGCTGATTG GCTTCTTCT。

1.2.9Western Blot:用蛋白裂解液提取股骨組織蛋白,BCA試劑盒定量蛋白濃度,在10 % SDS-PAGE凝膠上蛋白樣品進行電泳后進行轉膜,4 %脫脂奶粉封閉2 h,一抗[GAPDH (1∶5 000)、FNDC5 (1∶1 500)、Wnt3a (1: 5 000)、β-catenin(1∶1 500)] 4 ℃孵育過夜,二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h,ECL顯色,全自動發光儀顯影后使用ImageJ計算目的蛋白條帶灰度值。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 左歸丸對MC3T3-E1細胞成骨誘導后ALP含量的影響

第5、7、14天細胞上清ALP活力檢測結果如圖1所示。除了空白對照組外,其余各組的ALP含量都隨著成骨誘導的時間而增加,且OGI組、OGI-ZL組、OGI-ZM組增加幅度較大。第14天各組細胞上清ALP活力檢測如表1所示。與空白對照組對比,OGI組的ALP活力顯著上升(P=0.001);與OGI組比較,OGI-ZL組稍有升高但無顯著差異(P=0.402),OGI-ZM組ALP活力顯著升高(P= 0.001),OGI-ZH組和siOGI組ALP活力顯著下降(P<0.001)。與siOGI組相比,siOGI-ZL組、siOGI-ZM組和siOGI-ZH組都無顯著差異。

表1 第14天MC3T3-E1細胞上清ALP檢測

圖1 成骨誘導第5、7、14天各組細胞上清ALP濃度

對細胞進行ALP染色結果如圖2所示,ALP活性部分出現在細胞質中呈藍色。空白對照組未見藍色染色區,OGI組可見散在的藍色染色區,siOGI組也僅呈現較少的藍染。OGI-ZL組和OGI-ZM組可以見到明顯的藍染區域,而OGI-ZH組則相對較少。siOGI-ZL組、siOGI-ZM組、siOGI-ZH組都僅有少量藍染區。ALP細胞染色結果與細胞上清ALP檢測結果呈一致的趨勢。

圖2 成骨誘導第7天各組細胞ALP染色(40×)

圖3 各組小鼠股骨HE染色切片(200×)

2.2 小鼠股骨BMD檢測

與野生型對照組小鼠相比,KO對照組小鼠BMD稍微下降(P=0.089),卵巢切除后的野生型OVX組小鼠的BMD顯著下降(P<0.001);與野生型OVX組相比,野生型治療組小鼠的BMD明顯上升(P=0.002);與KO對照組小鼠相比,KO-OVX組小鼠的BMD顯著下降(P<0.001);與KO-OVX組小鼠相比,KO治療組小鼠無明顯差異(P=0.162)。見表2。

表2 各組小鼠股骨

2.3 小鼠股骨HE切片

在鏡下野生型對照組和KO對照組的小鼠股骨骨小梁較為致密、結構完整、連續性好、骨小梁之間間距較窄。OVX組的小鼠股骨骨小梁稀疏變細,結構斷裂,連續性差,間距變寬。KO-OVX組的小鼠股骨切片較KO對照組的小鼠也明顯表得稀疏、斷裂以及較大的間隙,同時股骨內的脂肪組織明顯增加。較于野生型OVX組,野生型治療組的小鼠股骨骨小梁面積變寬,結構較為完整、連續性改善,間距變小。而相較于KO-OVX組,KO治療組的小鼠在左歸丸的治療下,股骨骨小梁依舊稀疏細短,結構斷裂,連續性差,間距寬及較多脂肪組織。見圖2。

2.4 小鼠血清ELISA檢測

與野生型對照組相比,野生型OVX組的小鼠血清E2、PINP、Irisin含量顯著減少;與野生型OVX組相比,野生型治療組的小鼠血清E2、PINP、Irisin含量顯著減少;與KO對照組相比,KO-OVX組血清E2、Irisn含量下降,但無顯著差異,PNIP顯著減少;與KO-OVX組相比,KO治療組小鼠血清E2、PINP、Irisin無明顯差異。見表3。

表3 小鼠血清ELISA檢測

2.5 小鼠股骨組織成骨相關基因mRNA表達

與野生型對照組相比,野生型OVX組和KO對照組Runx2、OSX、OCN mRNA明顯降低,KO-OVX組較KO對照組Runx2、OSX、OCN明顯下降;野生型治療組相較野生型OVX組Runx2、OSX、OCN顯著升高,而KO-OVX組和KO治療組無明顯差異。在OPN方面,野生型OVX組較野生型對照組的OPN顯著上升,野生型治療組較野生型OVX組顯著降低;而KO-OVX組較KO對照組顯著降低,KO治療組和KO-OVX組無顯著差異。見表4。

表4 股骨組織Runx2、OPN、OCN、OSX mRNA相對表達量

2.6 FNDC5 mRNA表達和FNDC5、Wnt3a、β-catenin蛋白表達

與野生型對照組相比,KO對照組小鼠的股骨FNDC5 mRNA表達明顯降低(P=0.03);相比較于野生型OVX組,野生型治療組FNDC5表達顯著上升(P=0.004);而比較于KO-OVX組,KO治療組FNDC5表達無明顯差異(P= 0.840)。見表5。

表5 小鼠股骨FNDC5 mRNA表達

與野生型對照組相比,野生型OVX組和小鼠股骨組織中FNDC5、Wnt3a、β-catenin蛋白表達顯著減少(P<0.05),KO對照組中FNDC5、β-catenin蛋白表達顯著減少。與野生型OVX組相比,野生型治療組Wnt3a、β-catenin蛋白表達顯著上升(P<0.05)。與KO對照組相比,KO-OVX組的FNDC5、Wnt3a、β-catenin蛋白表達顯著減少(P<0.05);而KO治療組與KO-OVX組的蛋白表達均無明顯差異。見圖4。

圖4 各組小鼠股骨組織中β-catenin、Wnt3a、FNDC5蛋白表達

3 討論

中醫認為,腎主骨生髓,腎精的充盛程度與骨強弱關系密切。補腎壯骨的本質就是通過補腎促進骨形成,使骨形成大于骨吸收從,而達到壯骨的效果。左歸丸作為經典的補腎方劑,在臨床上一直以來都是治療PMOP的重要方劑,但是其內在的作用機制一直尚未闡明。

本研究使用了siRNA轉染技術沉默了MC3T3-E1細胞FNDC5的表達,進而從體外實驗上探討左歸丸促進MC3T3-E1細胞成骨分化與FNDC5之間的關系。成骨誘導后,通過細胞上清ALP檢測和細胞ALP染色,發現了低、中濃度的左歸丸含藥血清可促進MC3T3-E1細胞ALP表達,而轉染FNDC5會抑制左歸丸含藥血清對ALP表達的促進。

體內實驗結果發現左歸丸可以顯著改善野生型小鼠OVX術后導致的BMD降低以及股骨骨小梁的損害,左歸丸的治療并不能顯著的緩解KO小鼠OVX后BMD的降低和骨小梁的損害。這說明左歸丸發揮治療PMOP的作用與FNDC5/Irisin有著潛在的關系。PINP是骨形成的重要標志[8],在骨轉化的初期會顯著提高,并且隨著PINP含量降低,骨形成弱于骨吸收,骨量以及骨強度隨之下降[9]。Runx2基因是調節成骨細胞分化和骨形成的重要靶基因,是Wnt/β-catenin通路影響成骨細胞分化所必需的靶基因[10]。OSX是一種可以促進骨形成進程的成骨相關轉錄因子,同時也是Runx2的下游靶基因[11]。OCN是一種鈣結合蛋白,可以參與鈣和骨轉化代謝,能促進鈣沉積,是骨形成的標志[12]。OPN是由破骨細胞和成骨細胞生成的一種多糖蛋白,在骨轉化活躍的時候顯著上升,可激發骨吸收[13]。OVX術后,小鼠血清雌激素E2下降,成骨相關的基因OPN增加,小鼠骨轉化進入了活躍狀態。野生型治療組小鼠在左歸丸的干預下,抑制了OPN的增加,緩解E2下降,并提高了血清PINP含量和Runx2、OSX、OCN等成骨分化相關基因的mRNA表達。而對比KO-OVX組,KO治療組的E2、PINP、OPN、Runx2、OSX、OCN等指標均沒有明顯差異。此外本研究檢測了FNDC5、Wnt3a、β-catenin的蛋白表達,結果顯示左歸丸可以上調Wnt3a和β-catenin的表達,但當FNDC5被敲除后這種上調效果被顯著抑制。這些結果說明了左歸丸可能通過FNDC5來激活Wnt3a/β-catenin信號通路,進而促進了Runx2、OSX、OCN的表達,抑制OPN,從而促進了成骨分化使骨形成大于骨吸收,改善了PMOP小鼠的骨代謝。

綜上所述,左歸丸可能通過增強成骨基因Runx2、OSX、OCN等的表達促進成骨分化來改善OVX小鼠的骨質疏松,或許是通過調控FNDC5/Wnt3a/β-catenin信號通路實現的,FNDC5很有可能是左歸丸治療的靶蛋白。