HPLC-MS/MS 法測定黑枸杞中9 種酚酸

王 遠，劉 洋，張金磊，邢麗杰

（1.新疆農墾科學院分析測試中心，新疆 石河子 832000；2.石河子大學食品學院，新疆 石河子 832000）

黑枸杞（Lycium ruthenicum Murray，LR） 是屬于茄科，枸杞屬的一種功能性果實[1]。動物和細胞學試驗表明，黑枸杞果實提取物具有多種生物活性[2-4]。植物化學研究發現，黑枸杞果實含有豐富的營養成分，包括可溶性糖、脂肪酸、礦物質、酚酸和黃酮類等物質[5]。其中，酚酸類化合物引起了很多研究者的關注，是因為這類化合物具有包括抗氧化和抗炎在內的多種生物功能[6-7]。但是，大多研究者對黑枸杞中多酚類化合物的研究致力于闡明提取物中的總酚含量和生物活性，而較少有對黑枸杞中酚酸類物質進行定量分析的相關報道。

目前，對于復雜天然植物提取物中酚酸類化合物的定量研究方法主要包括分光光度法、薄層色譜法、毛細管電泳法和高效液相色譜法等[8]。其中，分光光度法操作簡單、分析速度快，只能用于總酚的定量分析，無法對單一酚酸進行定量分析；薄層色譜法和毛細管電泳法可以實現單一酚酸的分離，但定量分析能力和重現性差；高效液相色譜- 串聯質譜具有較高的分離和檢測水平，可以同時完成物質鑒定和定量分析，具有靈敏度高、選擇性強、準確度高的優點[9]。目前，這種技術已經廣泛用于復雜植物提取物中化合物的分析鑒定。

建立了一種利用高效液相色譜串聯三重四極桿質譜定性定量分析黑枸杞中9 種酚酸的方法，并對其線性度、回收率、精確度和穩定性進行了評價，比較了不同提取溶劑的提取效率，以期為黑枸杞的利用提供依據。

1 試驗部分

1.1 試劑與儀器

乙腈、甲醇（HPLC 級），美國Fisher 公司提供；甲酸（HPLC 級），德國CNW 公司提供；9 種酚酸類標準品，德國Sigma 公司提供；HLB 固相萃取小柱，美國Waters 公司提供；濾頭（0.22 μm，φ13 mm），上海安譜實驗科技股份有限公司提供。

1200+6460 型液質譜聯用儀（配電噴霧ESI 離子源），美國Agilent 公司產品；BSA4202S-CW 型電子天平，德國Sartorius 公司產品；MS3 Basic 型渦旋混勻器，德國IKA 公司產品；旋轉蒸發儀，日本EYELA 公司產品；Multifuge X4R Pro-MD 型高速冷凍離心機，美國ThermoFisher 公司產品；IQ 7000 型超純水凈化儀，美國Milli-Q 公司產品。

1.2 標準溶液配制

分別準確稱取10 mg 的綠原酸、芥子酸、丁香酸、阿魏酸、異阿魏酸、咖啡酸、香草酸、對香豆酸、4 - 羥基苯甲酸9 種標準品于10 mL 容量瓶內，采用甲醇分別溶解，定容至容量瓶刻度線，配制成1 000 mg/L 的單個標準儲備液。準確移取0.1 mL 的9 種酚酸單個儲備液于10 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻線，稀釋成1.0 mg/L 的9 種酚酸混合標準中間液。最后使用甲醇- 水（1∶1） 溶液將中間液逐級稀釋成2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0，200 ng/mL 的系列混合標準工作液。標準工作液現用現配。

1.3 樣品前處理

（1） 提取。稱取5.00 g 黑果枸杞樣品于50 mL離心管中，加入乙酸乙酯15 mL，渦旋提取1 min，以轉速10 000 r/min 離心5 min。取上清液于茄形瓶中，于45 ℃水浴旋蒸至近干。待凈化。

（2） 凈化。HLB 固相萃取柱依次用甲醇5 mL，0.01 mol/L 鹽酸溶液5 mL 活化；將茄形瓶中提取液過HLB 固相萃取X 小柱。用水5 mL 淋洗、抽干，甲醇10 mL 洗脫，收集洗脫液。于40 ℃氮吹至近干，用50%的甲醇- 水（1∶1） 溶液1 mL 溶解，經0.22 μm 濾頭過濾后，供液質譜聯用儀檢測。

1.4 色譜條件

色譜柱：安捷倫InfinityLab Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm×100 mm，2.7 Micron）；流動相：乙腈（A），水（B）；流速0.4 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量5.0 μL；梯度洗脫程序：0 min，5%A；0～5 min，10%A；5～8 min，15%A；8～11 min，15%A；11～12 min，18%A，12～22 min，18%A；22～23 min，90%A；23～24 min，90%A；24～25 min，5%A；25～28 min，5%A。

1.5 質譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI-）；掃描模式：MRM多反應監測模式；毛細管電壓3.5 kV，干燥器流速10 L/min，干燥器溫度325 ℃，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流速12 L/min，霧化器壓力45 psi。

多反應監測離子對及質譜參數見表1。

表1 多反應監測離子對及質譜參數

2 結果與分析

2.1 提取溶劑優化

目標酚酸類化合物具有較大的極性差異。乙酸乙酯因具有較強的極性和滲透性而被廣泛用于天然植物產物中活性物質的提取[10]。Pedro A C 等人[11]研究發現水基溶劑對紅枸杞中的酚類化合物具有更好的提取效果。Stenoeva J P 等人[12]研究表明在提取溶劑中加入低含量的酸可以提高總酚的提取效率。為了研究溶劑類型對提取效果的影響，比較了水、乙酸乙酯和0.01 mol/L 鹽酸溶液從樣品底物中提取9 種目標酚酸的效率。采用回收法測定不同提取溶劑的提取效率。將9 種酚酸的混合標準溶液以100 μg/kg的加標量添加到樣品底物中。攪拌靜置一段時間后加入15 mL 提取液。

3 種溶劑提取測定黑枸杞中9 種酚酸化合物的回收率見圖1。

圖1 3 種溶劑提取測定黑枸杞中9 種酚酸化合物的回收率

水和0.01 mol/L 鹽酸溶液作為提取溶劑時的平均回收率分別為52.9%和64.1%。結果表明，在溶劑中加入低含量的酸可以提高酚類物質的提取效率，與Stenoeva J P 等人[12]研究結果相同。然而，在使用0.01 mol/L 鹽酸溶液作為提取溶劑時，香草酸、丁香酸和異阿魏酸的回收率低于60%。可能是因為水溶劑體系只對含有糖基的酚類物質才會有更高的提取效率。相比較乙酸乙酯，9 種目標化合物的加標回收率為74.0%～104.6%，回收率均較好。主要原因是乙酸乙酯作為提取溶劑時對樣品的滲透性更強，共萃取物較少。因此，選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。

2.2 方法學驗證

2.2.1 加標回收率試驗

為了評價所建立的黑枸杞中酚酸類化合物檢測方法的準確度和精密度，將酚酸混合標準溶液分別以50，100，200 μg/kg 的加標量添加到黑枸杞空白樣品中，測定回收率和RSD。

黑枸杞中9 種酚酸的加標回收率及其RSD（n=6） 見表2。

表2 黑枸杞中9 種酚酸的加標回收率及其RSD（n=6）

由表2 可知，在3 個加標水平下，9 種酚酸類化合物的平均回收率在76.4%～106.2%，重復測定5 次，RSD＜4.1%，結果表明所建立的方法準確度和精密度均較好。

2.2.2 線性范圍及檢出限、定量限

將酚酸混合標準溶液加入到空白樣品提取液中，使用建立的方法進行測定。分別以質量濃度和相應的色譜峰面積為橫坐標和縱坐標，繪制標準曲線。9 種酚酸化合物在相應的線性范圍內線性關系良好，R2＞0.999。

9 種酚酸的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限和定量限見表3。

表3 9 種酚酸的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限和定量限

所建立方法的檢測限LOD 定義為樣品溶液中信噪比為3 時計算檢出質量濃度；檢測限LOQ 定義為目標化合物在樣品溶液中信噪比為10 時計算檢出質量濃度。由表3 可知，9 種酚酸化合物的LOD 為0.3～1.6 μg/kg，LOQ 在1.0～5.0 μg/kg。與已報道的酚酸類化合物的檢測方法相比，該方法具有較低的LOD 和LOQ。

3 結論

黑枸杞具有多種生物學活性，其提取物在抗炎、抗氧化類功能食品開發中具有廣泛的應用前景。針對黑枸杞提取物中的酚酸類活性成分提取利用率低、定量分析困難的問題，利用高效液相色譜串聯三重四極桿質譜建立了一種可以快速定性定量分析黑枸杞中9 種酚酸的方法，并對提取溶劑進行了優化。結果表明，乙酸乙酯作為提取溶劑時，9 種酚酸的平均回收率為93.66%，提取效率最高。在最優條件下，9 種酚酸在線性范圍內具有良好的線性關系，相關系數R2＞0.999，檢出限在0.3～1.6 μg/kg，定量限在1.0～5.0 μg/kg。在50，100，200 μg/kg 的加標水平下，酚酸化合物回收率為76.4%～106.2%，RSD＜4.1%。該方法前處理操作簡單，具有較高的靈敏度和精密度，可用于天然植物提取物中酚酸類化合物的定性定量分析。