雷帕霉素對多囊卵巢綜合征大鼠子宮內膜的作用及機制

許 鑫，楊 君，2，趙金金，吳霏霏，張 瑾，李柯欣

(1.新鄉醫學院第一附屬醫院婦科,河南 衛輝 453100;2.新鄉市婦科惡性腫瘤防治重點實驗室,河南 衛輝 453100; 3.新鄉醫學院第一附屬醫院生命科學研究中心,河南 衛輝 453100)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是育齡期婦女常見的內分泌、生殖障礙性疾病[1]。PCOS往往始于月經初潮,可導致月經不調、不孕、高雄激素血癥、肥胖、卵巢多囊改變等[2],遠期可增加子宮內膜癌、心血管疾病、2型糖尿病非依賴性肥胖、代謝綜合征等疾病風險[3]。不孕是PCOS患者突出的臨床問題,其主要原因是卵巢排卵障礙及子宮內膜功能異常[4]。有研究表明,哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)相關信號通路是PCOS的重要病理生理基礎,可參與控制細胞的增殖、生長和代謝等,而雷帕霉素是一種mTOR蛋白特異性抑制劑,可以直接或間接抑制mTOR相關信號通路的激活[5-6]。近年來,關于mTOR相關信號通路在PCOS大鼠卵巢病理變化中作用機制的研究較多,但關于mTOR相關信號通路對PCOS子宮內膜功能障礙的影響及機制相關研究較少。基于此,本研究旨在探討雷帕霉素對PCOS大鼠子宮內膜的作用及機制,以期為PCOS的基礎與臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康清潔級Sprague Dawley雌性大鼠30只,6周齡,體質量180～200 g,購自山西醫科大學實驗動物中心。大鼠分籠飼養,自由飲水、進食,飼養溫度(22±2)℃,相對濕度40%～60%,每日光照及黑暗時間各12 h。

1.2 主要試劑與儀器

脫氫表雄酮、雷帕霉素購自上海麥克林生化科技股份有限公司,醫用大豆油購自浙江田雨山藥用油有限公司,蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒、Masson染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司,末端脫氧核苷酸轉移酶介導的脫氧尿苷三磷酸缺口末端標記測定法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated deoxyuridine triphosphate nick-end labeling,TUNEL) 細胞凋亡檢測試劑盒、抗熒光淬滅封片劑、mTOR抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體購自鄭州賽維爾生物科技有限公司,磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated-mammalian target of rapamycin,p-mTOR)抗體購自艾博抗(上海)貿易有限公司,磷酸化p70核糖體蛋白S6(phosphorylated-p70 ribosomal protein S6,p-p70S6)抗體購自美國Santa公司;輪轉切片機、恒溫培養箱購自美國Thermo Scientific公司,熒光生物顯微鏡系統購自日本 Nikon公司,BM-IX 生物組織包埋機、冷凍臺購自孝感宏業醫用儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及干預

6周齡雌性大鼠斷乳,適應性喂養1周后稱質量,于7周齡時將大鼠隨機分為對照組、PCOS組、雷帕霉素組,每組10只。PCOS組和雷帕霉素組大鼠經頸背部皮下注射脫氫表雄酮(60 mg·kg-1),每日1次,連續注射28 d;對照組大鼠每日注射等量生理鹽水。造模成功后,雷帕霉素組大鼠每日腹腔注射雷帕霉素10 mg·kg-1,PCOS組和對照組大鼠每日腹腔注射等量生理鹽水,連續注射28 d。

1.3.2 各組大鼠體質量檢測

分別于造模前、造模后和給藥28 d后稱各組大鼠體質量。

1.3.3 HE染色法觀察大鼠子宮內膜病理學變化

給藥28 d后,給予各組大鼠100 g·L-1水合氯醛麻醉,解剖取子宮,分離表面多余組織,生理鹽水沖洗血管。將分離的子宮組織用40 g·L-1多聚甲醛固定,脫水、透明后進行石蠟包埋,制備石蠟切片(厚4 μm)。將石蠟切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇復水,蘇木精、伊紅溶液依次染色,常規脫水、透明后,用中性樹膠封片,晾干后置于光學顯微鏡下觀察大鼠子宮內膜病理學變化,并拍照。

1.3.4 Masson染色法檢測大鼠子宮內膜纖維化

將“1.3.3” 項中制備的子宮組織石蠟切片經二甲苯脫蠟后進行Masson染色,嚴格按照試劑盒說明書進行操作,在光學顯微鏡下觀察各組大鼠子宮內膜纖維化情況,子宮內膜纖維化分布顯示為藍色,每張切片隨機選取3個視野,應用Image J軟件分析子宮內膜纖維化面積占比。

1.3.5 免疫組織化學法檢測大鼠子宮內膜組織中mTOR、p-mTOR及p-p70S6的相對表達量

將“1.3.3” 項中制備的子宮組織石蠟切片經二甲苯脫蠟后,浸入枸櫞酸鈉緩沖液中,95 ℃高壓鍋內煮沸3 min后,室溫下充分冷卻,滴加體積分數3%過氧化氫,室溫孵育 20 min,滴加山羊血清室溫封閉30 min,滴加mTOR、p-mTOR、p-p70S6一抗(滴度均為1200),4 ℃孵育過夜,滴加二抗(滴度1200),室溫孵育 50 min,滴加二氨基聯苯胺孵育 10 min,自來水沖洗終止顯色,蘇木精染色1 min,鹽酸乙醇溶液分化,梯度乙醇中脫水,二甲苯溶液透明,滴加中性樹脂封片,置于顯微鏡下觀察并拍照。陽性細胞被染成棕黃色。每張切片隨機選取3個視野,應用 Image J-Pro 軟件分析每個視野中mTOR、p-mTOR 及p-p70S6的吸光度值,以吸光度值表示各組蛋白的相對表達量。

1.3.6 TUNEL法檢測大鼠子宮內膜細胞凋亡

將“1.3.3” 項中制備的子宮組織石蠟切片經二甲苯脫蠟后,滴加蛋白酶 K于 37 ℃溫箱中孵育 20 min,洗片后滴加 Triton X-100于室溫下孵育 20 min,洗片后滴加反應混合液(末端轉移酶+脫氧尿嘧啶)避光孵育 2 h,洗片后于二脒基苯基吲哚染液中避光孵育 5 min,沖洗后滴加含抗熒光淬滅劑的封片液進行封片,于熒光顯微鏡下避光觀察子宮內膜細胞凋亡情況,凋亡細胞呈現為綠色,每張切片隨機選取3個視野,以視野下的凋亡細胞數占細胞總數的百分比表示細胞凋亡率。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 3組大鼠體質量比較

造模前各組大鼠體質量比較差異無統計學意義(F=0.506,P>0.05)。造模后,PCOS組、雷帕霉素組大鼠的體質量顯著高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05);PCOS組與雷帕霉素組大鼠的體質量比較差異無統計學意義(P>0.05)。給藥28 d后,PCOS組大鼠的體質量顯著高于對照組和雷帕霉素組,雷帕霉素組大鼠的體質量顯著低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。結果見表1。

表1 3組大鼠體質量比較Tab.1 Comparison of body mass of rats among the three groups

2.2 3組大鼠子宮內膜病理學變化

給藥28 d后,對照組大鼠子宮內膜腺體為多個腺體簇狀排列,腺腔較大且迂曲較多;PCOS組大鼠子宮內膜腺體數目較對照組減少,為單個腺體分散排列,腺腔小且少有迂曲;雷帕霉素組大鼠子宮內膜腺體數目較多,呈簇狀排列,但腺腔多小而直,部分可見到一些皺褶和分支,結果見圖1。

A:對照組;B:PCOS組;C:雷帕霉素組。圖1 3組大鼠子宮內膜病理學變化(HE染色,×200) Fig.1 Pathological changes of endometrium of rats in the three groups (HE staining,×200)

2.3 3組大鼠子宮內膜纖維化情況比較

對照組、PCOS組、雷帕霉素組大鼠子宮內膜纖維化面積占比分別為(56.0±8.8)%、(77.0±9.4)%、(74.4±8.2)%。3組大鼠的子宮內膜纖維的面積占比比較差異有統計學意義(F=8.271,P<0.05)。PCOS組和雷帕霉素組大鼠子宮內膜纖維化面積占比顯著高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。 PCOS組與雷帕霉素組大鼠子宮內膜纖維化面積占比比較差異無統計學意義(P>0.05)。 結果見圖2。

A:對照組;B:PCOS組;C:雷帕霉素組。圖2 3組大鼠子宮內膜纖維化情況(Masson染色,×200)Fig.2 Endometrial fibrosis of rats in the three groups (Masson staining,×200)

2.4 3組大鼠子宮內膜細胞凋亡情況比較

對照組、PCOS組、雷帕霉素組大鼠子宮內膜細胞凋亡率分別為 (3.582±0.709)%、(6.606±0.844)%、(2.132±0.744)%。3組大鼠子宮內膜細胞凋亡率比較差異有統計學意義(F=88.390,P<0.05)。PCOS組大鼠子宮內膜細胞凋亡率顯著高于對照組和雷帕霉素組,差異有統計學意義(P<0.05)。對照組與雷帕霉素組大鼠子宮內膜細胞凋亡率比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.5 3組大鼠子宮內膜組織中mTOR、p-mTOR及p-p70S6相對表達量比較

PCOS組大鼠子宮內膜組織中mTOR、p-mTOR及p-p70S6的相對表達量顯著高于對照組和雷帕霉素組,差異有統計學意義(P<0.05)。雷帕霉素組大鼠子宮內膜組織中p-mTOR的相對表達量顯著低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。對照組與雷帕霉素組大鼠子宮組織內膜組織中mTOR、p-p70S6 的相對表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)。 結果見圖3和表2。

圖3 3組大鼠子宮內膜組織中mTOR、p-mTOR及p-p70S6的表達(免疫組織化學染色,×400)Fig.3 Expressions of mTOR,p-mTOR and p-p70S6 in the endometrium of rats in the three groups (immunohistochemical staining,×400)

表2 3組大鼠子宮內膜組織中mTOR、p-mTOR及p-p70S6相對表達量比較Tab.2 Comparison of the relative expressions of mTOR,p-mTOR and p-p70S6 in the endometrium of rats among the three groups

3 討論

PCOS 是一種以高雄激素血癥為特征的疾病,可導致子宮內膜增生、子宮內膜癌、胚胎植入失敗、復發性流產、子宮內膜功能障礙等[7-9]。mTOR是磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/mTOR信號通路的成員,該通路涉及許多下游靶點,可參與細胞生長、增殖、蛋白質合成、轉錄、血管生成、凋亡和自噬等生物過程[10]。研究表明,mTOR途徑的過度表達參與PCOS病理生理過程,可導致胰島素抵抗,促進卵巢顆粒細胞的凋亡、膜細胞的增殖,從而影響卵泡的發育,雷帕霉素可通過抑制mTOR信號通路異常激活,保護卵泡儲備功能[11]。WANG等[12]研究表明,雌激素可誘導大鼠子宮內膜組織中p-mTOR、磷酸化核糖體蛋白S6水平明顯升高,雷帕霉素可通過抑制mTOR通路降低p-mTOR、磷酸化核糖體蛋白S6的蛋白質和DNA合成,表明雷帕霉素可用于治療雌激素導致的子宮內膜增生性疾病。

本研究通過經頸背部皮下注射脫氫表雄酮構建PCOS大鼠模型[13-14],造模后,PCOS組、雷帕霉素組大鼠的體質量顯著高于對照組,符合PCOS大鼠模型的病理特點;給藥28 d后,PCOS組大鼠的體質量顯著高于對照組和雷帕霉素組,雷帕霉素組大鼠的體質量顯著低于對照組,說明雷帕霉素可抑制PCOS大鼠體質量的增加,PCOS組大鼠體質量低于對照組大鼠可能與雷帕霉素濃度過高或雷帕霉素引起的不良反應有關,仍待進一步研究證明。

本研究中,HE染色顯示,雷帕霉素組大鼠子宮內膜腺體數目較多,呈簇狀排列,但腺腔多小而直,部分可見到一些皺褶和分支,說明雷帕霉素能緩解PCOS大鼠子宮內膜病理形態改變。本研究結果顯示,PCOS組和雷帕霉素組大鼠子宮內膜纖維化面積占比顯著高于對照組,PCOS組與雷帕霉素組大鼠子宮內膜纖維化面積占比比較差異無統計學意義;這說明,PCOS大鼠子宮內膜纖維化程度較高,而雷帕霉素并未明顯改善PCOS大鼠子宮內膜纖維化情況。

本研究結果顯示, PCOS組大鼠子宮內膜細胞凋亡率顯著高于對照組和雷帕霉素組,對照組與雷帕霉素組大鼠子宮內膜細胞凋亡率比較差異無統計學意義;說明,PCOS大鼠子宮內膜細胞凋亡增加,原因可能與mTOR通路異常激活有關。機體正常細胞凋亡可清除子宮內膜功能層的衰老細胞,從而維持內膜組織的正常結構和功能,而子宮內膜癌早期患者的子宮內膜細胞凋亡調控表現出異常[15]。

有研究表明,雷帕霉素可通過抑制mTOR信號通路,抑制始基卵泡激活,減緩始基卵泡向生長卵泡的轉化速率,保護卵泡儲備能力并改善排卵功能,并可減少肥胖小鼠的體質量,這為解決肥胖女性生育能力的問題帶來了希望[16-17]。本研究結果顯示,PCOS 組大鼠子宮內膜組織中mTOR、p-mTOR及p-p70S6 的相對表達量顯著高于對照組和雷帕霉素組;雷帕霉素組大鼠子宮內膜組織中p-mTOR的相對表達量顯著低于對照組;對照組與雷帕霉素組大鼠子宮內膜組織中mTOR、p-p70S6的相對表達量比較差異無統計學意義;說明雷帕霉素處理后PCOS大鼠子宮內膜組織中mTOR、p-mTOR及mTOR信號通路下游的p-p70S6水平下調,雷帕霉素可抑制 mTOR信號通路的異常激活,與YABA等[11]研究一致。

4 結論

雷帕霉素能緩解PCOS大鼠體質量增加、子宮內膜病理形態改變,減少子宮內膜細胞凋亡,其作用機制可能與抑制mTOR信號通路異常激活有關。本研究僅初步探討了雷帕霉素對PCOS大鼠子宮內膜細胞凋亡的影響及機制,雷帕霉素對子宮內膜細胞增殖、遷移、侵襲等其他細胞過程的影響及機制尚需深入研究。