大豆低聚糖的分離純化研究進(jìn)展

侯 越，李振江，王立東

（1.黑龍江赫益乳業(yè)科技有限公司，黑龍江 大慶 163000；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

大豆是主要油料作物之一，在世界各地均大面積種植，營養(yǎng)價(jià)值極高，是我國人民蛋白質(zhì)和脂肪的主要來源[1-2]。低聚糖（Oligosaccharides） 又稱寡聚糖，是由2~10 個(gè)單糖殘基通過糖苷鍵聚合而成，與糖類具有某些相同的共性。低聚糖由于進(jìn)入人體后無法被人體吸收，選擇性地作用于腸道中的有益菌（如雙歧桿菌和乳桿菌等）[3-4]。近年來，大豆低聚糖因其來源廣泛，在人體中難以消化吸收，不會(huì)對(duì)血糖產(chǎn)生較大波動(dòng)，并且可以改善腸道菌群等特點(diǎn)而受到關(guān)注，并被廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域。綜述了大豆低聚糖的分類、提取、純化和檢測方法，并對(duì)大豆低聚糖的應(yīng)用前景進(jìn)行展望，以期為后續(xù)研究提供參考。

1 大豆低聚糖的分類

大豆低聚糖是一種新型功能性低聚糖，主要包括蔗糖、水蘇糖和棉子糖，是美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)的公認(rèn)的安全成分和益生元[5-6]。大豆低聚糖在自然界中廣泛分布，在豆科植物中含量較多，尤其以成熟的大豆中含量最為豐富，約占干物質(zhì)總量的10%[7]。大豆低聚糖在攝入后會(huì)引起脹氣、腹瀉等不良反應(yīng)，曾一度被認(rèn)為是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子[8]；隨著研究發(fā)現(xiàn)，大豆低聚糖具有調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)、促進(jìn)營養(yǎng)元素和礦物質(zhì)吸收、降低血糖和血壓、提高免疫力等生理活性，因此受到廣泛關(guān)注[1，5，9]。

1.1 棉子糖

棉子糖是一種廣泛存在于自然界中的三糖，是由葡萄糖、果糖和半乳糖連接而成（見圖1）。棉子糖又稱蜜三糖，是一種優(yōu)良的雙歧因子，具有改善腸道菌群、增強(qiáng)免疫力、抗氧化和抗癌等優(yōu)良的生理功能[10-11]，因此被廣泛應(yīng)用于化妝品、食品等領(lǐng)域，具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。

圖1 棉子糖的結(jié)構(gòu)式

棉子糖的結(jié)構(gòu)式見圖1。

1.2 水蘇糖

水蘇糖是一種天然存在的四糖，由兩單位的半乳糖和一單位的蔗糖連接而成（見圖2）。水蘇糖是一種優(yōu)良的促進(jìn)雙歧桿菌等益生菌增值的功能性低聚糖，被譽(yù)為“超強(qiáng)雙歧因子”，對(duì)腸道中的雙歧桿菌和乳桿菌具有特異性增值作用，可以提高L- 乳酸的含量，促進(jìn)機(jī)體對(duì)礦物元素的吸收，也可以調(diào)節(jié)腸道菌群，改善腸道的糖代謝，以此調(diào)節(jié)血糖[12]。同時(shí)，水蘇糖還具有消炎、調(diào)節(jié)免疫力、降低食物過敏等功能，因此廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域[13-15]。

圖2 水蘇糖的結(jié)構(gòu)式

水蘇糖的結(jié)構(gòu)式見圖2。

2 大豆低聚糖的來源及純化

大豆低聚糖大多是從生產(chǎn)大豆蛋白的副產(chǎn)物大豆糖蜜和大豆乳清中進(jìn)行分離純化獲得，也可以從豆渣以及脫脂豆粕中進(jìn)行提取。目前，大豆低聚糖的提取方法主要包括溶劑浸提[16]、超聲波輔助提取法[17]、微波輔助提取法[18]、纖維素酶輔助提取[19]及2 種或2 種以上的方法相結(jié)合的提取方法，如微波結(jié)合酶解輔助提取[20]等。在大豆糖蜜、大豆乳清和大豆低聚糖提取液中低聚糖的含量相對(duì)較低，并且含有多種雜質(zhì)，如雜糖、蛋白、色素、鹽分等，若要獲得純度較高的大豆低聚糖還需將其進(jìn)行純化處理。

2.1 雜糖的去除

大豆低聚糖主要指大豆中的蔗糖、棉子糖和水蘇糖，其含量分別為籽粒干基的5%，1%，4%[21-22]，其中蔗糖占居主要地位，功能性成分含量較低，因此若想獲得高活性的大豆低聚糖需將其中無生物活性的蔗糖去除，棉子糖和水蘇糖與蔗糖在結(jié)構(gòu)及性質(zhì)上較為接近，無法使用物理方法（如膜過濾、樹脂分離等方法） 分離，因此常利用微生物對(duì)不同碳源的選擇性，采用微生物發(fā)酵的方式去除其中的蔗糖，最大限度保留其中的水蘇糖和棉子糖。目前，常用微生物有酵母菌[23-24]、乳酸菌[25]、曲霉[26]及混合發(fā)酵等。這些微生物發(fā)酵原理各不相同，有些是利用微生物產(chǎn)生一些轉(zhuǎn)移酶，將蔗糖轉(zhuǎn)換成棉子糖及水蘇糖；有些是利用微生物直接代謝掉蔗糖，以達(dá)到純化的目的。

由于在自然界中可以將蔗糖轉(zhuǎn)化為棉子糖和水蘇糖的微生物較少，目前主要的研究集中于利用微生物代謝將蔗糖去除，選用的微生物特點(diǎn)為α - 半乳糖苷酶活力較低，無法代謝水蘇糖和棉子糖或?qū)λK糖及棉子糖的代謝較低，可以最大限度地消耗蔗糖，保留水蘇糖及棉子糖。微生物發(fā)酵去除蔗糖主要受菌種的影響（見表1），有研究表明對(duì)比了酵母菌、乳酸菌和紅曲霉對(duì)大豆糖蜜的純化效果，發(fā)現(xiàn)酵母菌對(duì)大豆糖蜜的純化效果較好，蔗糖消耗率為95%，棉子糖和水蘇糖保留率分別為99.61%和95.72%，使功能性成分由原來的40.24%提高為88.57%。陸薇幃等人[27]通過篩選土壤中的酵母菌，得出一種異常威克漢姆酵母菌對(duì)大豆乳清中蔗糖具有強(qiáng)降解作用，通過對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化，該菌發(fā)酵30 h 可以將大豆乳清廢水中的功能性低聚糖純度達(dá)到94.12%。劉飛等人[28]利用一些常用酵母對(duì)大豆糖蜜進(jìn)行發(fā)酵純化，得出啤酒酵母103 對(duì)大豆糖蜜純化效果較好，蔗糖去除率在90%左右，棉子糖和水蘇糖保留率分別為81.0%和92.5%，發(fā)酵周期為11 h。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，酵母菌具有較強(qiáng)的降解蔗糖的作用，同時(shí)對(duì)棉子糖和水蘇糖降解率較低，在微生物純化大豆低聚糖中具有廣泛的應(yīng)用前景。

表1 微生物發(fā)酵去除蔗糖

微生物發(fā)酵去除蔗糖見表1。

2.2 脫色

大豆糖蜜是采用乙醇洗滌方式生產(chǎn)大豆?jié)饪s蛋白時(shí)的副產(chǎn)物，一般呈黃棕色黏稠液體；大豆乳清水為堿提酸沉法生產(chǎn)大豆分離蛋白和生產(chǎn)豆腐所產(chǎn)生的副產(chǎn)物，一般呈黃色[29]；大豆糖蜜和大豆乳清水中均含有大量的色素，因此生產(chǎn)大豆低聚糖需進(jìn)行脫色處理。目前，在脫色處理中應(yīng)用較多的是活性炭脫色，其次是樹脂脫色（見表2），謝瑩等人[30]、張立峰等人[31]和嚴(yán)玲[32]均研究了活性炭脫色，脫色率均在80%~90%，多糖損失率在10%~20%，不同的是研究所采用的原料不同，分別為豆粕堿提取液、大豆乳清水和大豆糖蜜，由此可以看出，活性炭吸附對(duì)溶液中的物質(zhì)沒有選擇性，并且活性炭對(duì)低聚糖吸附性較強(qiáng)，導(dǎo)致低聚糖的損失率較高。

表2 不同脫色方式比較

王秋霜等人[33]研究了不同樹脂對(duì)大豆糖蜜的脫色效果，研究發(fā)現(xiàn)AB-8 型樹脂和DM-130 型樹脂對(duì)大豆糖蜜脫色效果最好，將AB-8 型樹脂參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，靜態(tài)吸附脫色率可達(dá)到93.96%，低聚糖損失率為3.13%，動(dòng)態(tài)吸附脫色率為92%，低聚糖保留率為98.3%。由此可以看出，活性炭吸附脫色雖然操作簡單，脫色時(shí)間短，但脫色率和低聚糖保留率均低于樹脂脫色，損失率較高；但樹脂脫色操作較為復(fù)雜，脫色時(shí)間長，在前期實(shí)驗(yàn)量較大，因此應(yīng)根據(jù)原料實(shí)際情況，選擇適宜的脫色方式。

不同脫色方式比較見表2。

2.3 脫蛋白

大豆中蛋白質(zhì)豐富，含量為35%~50%，因此大豆低聚糖提取液或加工副產(chǎn)物中均含有一定量的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)會(huì)與溶液中的還原糖（如葡萄糖等）發(fā)生美拉德反應(yīng)，使糖液顏色加深，產(chǎn)品品質(zhì)下降，因此在純化大豆低聚糖時(shí)將其中蛋白質(zhì)去除是非常重要的。低聚糖中脫蛋白的方法主要有Sevage 法、三氯乙酸法、醇沉法、等電點(diǎn)沉淀法等，由于Sevage 法和三氯乙酸法除蛋白中使用的試劑就有一定毒性，存在安全隱患；醇沉法在沉淀蛋白的過程中會(huì)使低聚糖損失嚴(yán)重，因此這幾種方法使用較少。目前，大豆低聚糖純化過程中去除蛋白質(zhì)的方法主要有等電點(diǎn)沉淀法和鹽析法。

2.3.1 等電點(diǎn)沉淀

等電點(diǎn)法是利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小，使溶液中的蛋白質(zhì)沉淀出來，達(dá)到去除蛋白質(zhì)的目的。目前，等電點(diǎn)沉淀蛋白通常采用鹽酸和氫氧化鈉作為pH 值調(diào)節(jié)劑。王昌濤等人[34]研究了等電點(diǎn)法純化大豆糖蜜，最終得到采用鹽酸調(diào)節(jié)pH 值為3，以轉(zhuǎn)速6 000 r/min 離心10 min，最終蛋白質(zhì)的去除率可以達(dá)到55.5%，多糖保留率為99.7%，剩余蛋白質(zhì)可以通過后續(xù)去除其他雜質(zhì)的同時(shí)去除，由此可以看出，等電點(diǎn)法除蛋白多糖損失率極低，蛋白質(zhì)脫除率較高，并且引入的新雜質(zhì)較少，是目前較常用的脫蛋白方法。

2.3.2 鹽析法

鹽析法是利用鹽在水中電離出的離子打破蛋白質(zhì)的電荷平衡，破壞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性而促進(jìn)蛋白的析出。但在去除蛋白時(shí)需將溶液中加入較多的鹽分，在一定程度上造成了經(jīng)濟(jì)上的浪費(fèi)，也為后續(xù)脫鹽造成一定的困難，因此在實(shí)際應(yīng)用中較少。

2.4 脫鹽

大豆加工副產(chǎn)物和低聚糖粗提液受加工工藝和前處理等工藝影響，其中含有大量鹽分，同時(shí)原料本身也含有一定量的礦物成分，若不除去會(huì)導(dǎo)致最終產(chǎn)物純度降低，并且在應(yīng)用中會(huì)受到一定的限制。目前應(yīng)用于大豆低聚糖中的脫鹽方法有陰陽離子交換樹脂脫鹽、電滲析法脫鹽等。

2.4.1 離子交換樹脂脫鹽

離子交換樹脂是在苯乙烯或丙烯酸（酯） 形成的三位立體網(wǎng)狀骨架上結(jié)合不同化學(xué)基團(tuán)，根據(jù)基團(tuán)不同，可以分為陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂和特殊離子交換樹脂。陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂是通過內(nèi)部電離出的離子和溶液中的離子通過半透膜進(jìn)行擴(kuò)散交換，并且樹脂骨架上的離子生排斥。離子交換樹脂具有韌性高、化學(xué)穩(wěn)定、處理量大、效率高和選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)被廣泛使用。研究對(duì)比了001×7 強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂與D301 型和201×7 樹脂串聯(lián)使用對(duì)大豆糖蜜脫鹽研究，通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)001×7 與201×7 樹脂聯(lián)用，得到的產(chǎn)品顏色泛黃，口感微辣，而與D301 型樹脂聯(lián)用得到的產(chǎn)品與市面上的產(chǎn)品較為接近。薛艷芳[35]研究了采用陰陽離子交換樹脂同時(shí)脫色和脫鹽的研究，發(fā)現(xiàn)001×7 和D301-T 串聯(lián)得到的產(chǎn)品脫色率和脫鹽率較高，分別為94%和81.12%，低聚糖保留率也比較高，為91%。由此可以看出，離子交換樹脂同時(shí)兼?zhèn)涿撋兔擕}，并且低聚糖的保留率較高；但該方法連續(xù)性較差，不同型號(hào)的樹脂對(duì)不同離子的吸附性不同，并且離子交換樹脂型號(hào)較多，在選擇上具有一定困難，需要進(jìn)行大量試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)選。

2.4.2 電滲析脫鹽

電滲析是指在膜兩側(cè)電壓的推動(dòng)下，帶正、負(fù)電荷的離子分別通過陰、陽離子交換膜從淡室向濃室移動(dòng)，從而對(duì)料液進(jìn)行淡化處理。

電滲析過程原理見圖3[36-37]。

圖3 電滲析過程原理

電滲析技術(shù)相對(duì)于其他脫鹽將技術(shù)具有能耗低、原料預(yù)處理簡單、設(shè)備損耗小、選擇性高、裝置應(yīng)用靈活、產(chǎn)生的廢水少等優(yōu)點(diǎn)，因此廣泛應(yīng)用于各種原料的脫鹽處理中[38]。嚴(yán)玲[32]對(duì)比了離子交換樹脂和電滲析技術(shù)對(duì)大豆黃漿水脫鹽率的影響，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，電滲析技術(shù)和離子交換樹脂的脫鹽率分別為97.15%和95.89%，低聚糖保留率分別為85.23%和83.02%，通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，電滲析技術(shù)的脫鹽率和低聚糖保留率均優(yōu)于離子交換樹脂，處理量遠(yuǎn)大于離子交換樹脂。王秋霜等人[33]采用電滲析技術(shù)對(duì)大豆低聚糖溶液進(jìn)行脫鹽處理，得到脫鹽參數(shù)為工作電壓20 V，流量為60 L/h，脫鹽率達(dá)到96.07%，低聚糖保留率為83.82%。由此可以看出，電滲析技術(shù)在大豆低聚糖溶液脫鹽中脫鹽效果及處理效率均優(yōu)于離子交換樹脂，因此可以廣泛應(yīng)用于糖類物質(zhì)的脫鹽中。

3 大豆低聚糖的檢測方法

目前，大豆低聚糖的定性及定量檢測方法有離子色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法和液相色譜法[40-41]。

離子色譜法準(zhǔn)確性高，但糖類物質(zhì)會(huì)有電極發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而影響檢測準(zhǔn)確性。薄層色譜法的成本低、時(shí)間少，但是需要人工點(diǎn)樣，對(duì)試驗(yàn)人員的要求高，并且薄層色譜法的誤差較大，所需的樣品量較大，因此使用較少。氣相色譜法具有快速高效、靈敏度高、用量少等優(yōu)點(diǎn)，但由于糖類物質(zhì)不具有較強(qiáng)的揮發(fā)性，需先將樣品進(jìn)行衍生化反應(yīng)，制備成易揮發(fā)、熱穩(wěn)定的衍生物，操作較為繁瑣，因此較少使用。而液相色譜是采用液體為流動(dòng)相的檢測技術(shù)，可以直接對(duì)糖類物質(zhì)進(jìn)行檢測，該方法對(duì)樣品的預(yù)處理簡單，損失小，并且操作簡單快速，準(zhǔn)確性高，廣泛應(yīng)用。潘城等人[42]和王曉巖等人[43]均研究了高效液相色譜法測定大豆低聚糖中蔗糖、棉子糖和水蘇糖的含量，證明該方法不僅可以將蔗糖、棉子糖和水蘇糖完全分開，并且操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確。

4 結(jié)語

大豆低聚糖是作為大豆中的一種功能性成分，在生理功能中越來越受到重視。由于具有調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)、促進(jìn)營養(yǎng)元素和礦物質(zhì)吸收、降低血糖和血壓、提高免疫力等多種生理功能，具有廣泛的應(yīng)用前景。因此，如何高效提取和純化大豆低聚糖日益重要。由于大豆低聚糖在大豆中含量低，成分復(fù)雜，并且蔗糖、棉子糖和水蘇糖分子質(zhì)量和性質(zhì)較為接近，分離純化的難度大。研究中主要存在以下問題：①目前多種高效技術(shù)主要處于實(shí)驗(yàn)室階段，提取率低，不適宜工業(yè)化生產(chǎn)；②在純化方面，由于單一手段無法很好地去除其中雜質(zhì)，需多種純化技術(shù)聯(lián)合使用才能達(dá)到較高的純度，但損失率較高；③由于3 種成分性質(zhì)較為接近，因此想獲得高純度的單一組分較為困難，導(dǎo)致高純度的組分成本較高。在未來研究中，如何提高大豆低聚糖提取率、研發(fā)高效、便捷、經(jīng)濟(jì)的純化方法獲得高純度的大豆低聚糖及相應(yīng)的分離手段來獲得經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的高純度單品，為大豆低聚糖的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)指明方向。