油茶葉黃酮超聲輔助提取工藝優化

張寧蕓，鄧愛華，王 云，危 婷，譚萬紅，劉大宏

（1. 湖南文理學院生命與環境科學學院，湖南 常德 415000；2. 湖南泥頭山油茶開發有限公司，湖南 常德 415700）

據《中華本草》記載，山茶科植物油茶（Camellia oleiferaAbel） 的葉片具有治療瘡疽，鼻衄和皮膚瘙癢等多種功效[1]。現代研究也表明，油茶葉含有多種活性成分，如多糖、多酚、蛋白及茶皂素和黃酮類等[2]，具有抑制癌細胞生長、降血糖、抗血栓及治療雄性激素依賴性疾病[3]等功效。植物中黃酮的分離工藝主要有低共融溶劑萃取法、離子液體萃取法[8]及超臨界流體萃取法[4]等，這些方法存在耗時長、溶劑昂貴或設備投資大，不利于工業化生產應用。基于熱效應及空化效應的超聲輔助提取技術可以有效彌補這些缺陷，已廣泛應用于植物黃酮的提取生產[5]。采用木瓜蛋白酶結合超聲波輔助提取油茶葉黃酮，通過響應面法優化油茶葉黃酮提取工藝參數，以期為油茶葉黃酮的工業化生產提供理論依據。

1 材料與儀器

1.1 試驗材料

新鮮油茶葉，湖南泥頭山油茶開發有限公司提供；蘆丁（>99%），生工生物工程（上海） 股份有限公司提供；木瓜蛋白酶（活性80 萬U/g），合肥巴斯夫生物科技公司提供；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，均為分析純，湖南匯虹試劑有限公司提供。

1.2 試驗儀器

Q5200E 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產品；UV-1600 型紫外可見分光光度計，翱藝儀器（上海） 有限公司產品；LGJ-10 型冷凍干燥機，北京四環科學儀器廠產品；EX225D 型分析天平，美國奧豪斯儀器有限公司產品；YB-700A 型高速多功能粉碎機，永康市速鋒工貿有限公司產品；SHZ-DⅢ型循環水真空泵，鞏義市予華儀器有限公司產品。

2 試驗方法

2.1 標準曲線的繪制

參考文獻[6]報道方法，進行適當修改。稱取100.0 mg 蘆丁溶于60%的乙醇中，用250 mL 容量瓶定容，得到0.4 mg/mL 蘆丁標準液。吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL 標準液分別裝入25 mL 容量瓶中，用30%乙醇補充到10 mL，加入質量分數為5%的亞硝酸鈉溶液1.0 mL 搖勻，5 min 后加質量分數為10%的硝酸鋁溶液1.0 mL 搖勻，5 min 后再加質量分數為4%的氫氧化鈉溶液10.0 mL 搖勻，用30%乙醇定容，放置15 min。于波長510 nm 處測定其吸光度，試劑空白為參比液，繪制標準曲線及回歸方程。

2.2 單因素試驗設計

取5 份凍干油茶葉粉各5.0 g，加入設定參數的木瓜蛋白酶乙醇水溶液，固定超聲功率240 W，頻率40 kHz，考查乙醇體積分數（40%，50%，60%，70%，80%）、超聲時間（30，45，60，75，90 min）、超聲溫度（30，40，50，60，70 ℃）、料液比（1∶10，1∶14，1∶18，1∶22，1∶26）、木瓜蛋白酶添加量（0.8%，1.6%，2.4%，3.4%，4.0%） 和提取次數（1，2，3，4，5 次） 等因素對黃酮得率的影響。考查單個因素影響時，其他參數為乙醇體積分數50%，料液比1∶14（g∶mL），超聲時間30 min，超聲溫度40 ℃，木瓜蛋白酶添加量0.8%下提取1 次。

2.3 響應面試驗設計

根據單因素試驗結果，設定超聲溫度50 ℃，料液比1∶22（g∶mL），以乙醇體積分數（A）、超聲時間（B） 和木瓜蛋白酶添加量（C） 作為自變量，油茶葉黃酮得率（Y） 為因變量，根據Box-behnken中心組合設計原理，設計響應面法試驗方案。

試驗因素與水平設計見表1。

2.4 油茶葉黃酮得率計算

移取油茶葉黃酮提取待測液1 mL 于具塞試管中，加入體積分數為30%的乙醇溶液4 mL、質量分數為5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL。搖勻放置5 min，再加入質量分數為10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，放置6 min，加入質量分數為4%的氫氧化鈉溶液4 mL，搖勻，用體積分數為30%的乙醇溶液補充至10 mL。用分光光度計于波長510 nm 處測定吸光度值。根據標準曲線方程計算油茶葉提取物中黃酮的質量濃度，根據式（1） 計算黃酮得率（Y）。

式中：M1——提取的油茶葉中黃酮的質量，g；

M——干燥油茶葉粉質量，g。

3 結果與分析

3.1 蘆丁標準曲線的繪制

根據檢測結果得出了不同質量濃度的蘆丁標準液吸光度，以吸光度（Y） 為縱坐標，質量濃度（X） 為橫坐標，繪制標準曲線圖1。回歸方程為Y=0.010 0X+0.007 2，相關系數R2=0.999 6。說明在16~80 μg/mL 的質量濃度范圍里蘆丁質量濃度同吸光度的線性關系良好。

圖1 蘆丁標準曲線

蘆丁標準曲線見圖1。

3.2 單因素試驗

3.2.1 乙醇體積分數對黃酮得率的影響

乙醇體積分數對油茶葉黃酮得率的影響見圖2。

圖2 乙醇體積分數對油茶葉黃酮得率的影響

由圖2 可知，乙醇體積分數為40%~70%時，黃酮得率呈上升趨勢；當乙醇體積分數繼續增加，得率不斷降低。乙醇體積分數過低，水溶性雜質易溶出，而乙醇體積分數過高，極性降低不利于黃酮的提取，選擇合適的乙醇體積分數為70%左右。

3.2.2 超聲時間對黃酮得率的影響

超聲時間對油茶葉黃酮得率的影響見圖3。

圖3 超聲時間對油茶葉黃酮得率的影響

由圖3 可知，超聲時間在30~60 min 時，油茶葉黃酮得率呈上升趨勢；當超聲時間繼續增加，得率不斷降低；超聲波的空化作用導致細胞壁的破裂，有助于黃酮的溶出，也會導致其他可溶性雜質（如蛋白、膠質等） 的溶出，不利于后續分離純化，合適的超聲時間為60 min 左右。

3.2.3 料液比對黃酮得率的影響

料液比對油茶葉黃酮得率的影響見圖4。

圖4 料液比對油茶葉黃酮得率的影響

由圖4 可知，當料液比低于1∶18（g∶mL）時，油茶葉黃酮得率隨料液比的增加而增加；繼續增大料液比，黃酮得率增加趨勢不顯著；可能是溶劑體積增大，單位體積的超聲效果降低，不利于黃酮的溶出，合適的料液比為1∶18（g∶mL） 左右。

3.2.4 超聲溫度對黃酮得率的影響

超聲溫度對油茶葉黃酮得率的影響見圖5。

圖5 超聲溫度對油茶葉黃酮得率的影響

由圖5 可知，適當提高超聲溫度，油茶葉黃酮呈現增加的趨勢，在超聲溫度為50 ℃時，油茶葉黃酮得率達到最大值；提高超聲溫度，有利于黃酮及其他雜質的溶出，也可能導致黃酮結構的破壞，合適的超聲溫度為50 ℃左右。

3.2.5 木瓜蛋白酶添加量對黃酮得率的影響

木瓜蛋白酶添加量對油茶葉黃酮得率的影響見圖6。

圖6 木瓜蛋白酶添加量對油茶葉黃酮得率的影響

由圖6 可知，適當添加木瓜蛋白酶的量，油茶葉黃酮得率呈現增加的趨勢，在木瓜蛋白酶添加量為1.6%時，油茶葉黃酮得率達到最大值；木瓜蛋白酶穩定性好，有助于黃酮的溶出，量太大也可能導致吸附在物料表面，合適的木瓜蛋白酶添加量為1.6%左右。

3.2.6 提取次數對黃酮得率的影響

提取次數對油茶葉黃酮得率的影響見圖7。

圖7 提取次數對油茶葉黃酮得率的影響

由圖7 可知，油茶葉黃酮從細胞壁中擴散至溶液中需要一定的時間，當提取達到3 次時，油茶葉黃酮得率增加趨勢不明顯，綜合考慮操作和經濟成本，提取次數為3 次較為合適。

3.3 響應面試驗

3.3.1 響應面試驗設計及結果

響應面試驗設計及結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果

3.3.2 回歸模型的建立與分析

將表2 試驗數據代入Design Expert 8.0 軟件進行響應面分析，油茶葉黃酮得率與各變量的響應面回歸數學模型：

響應面回歸模型方差分析見表3。

表3 響應面回歸模型方差分析

表3 方差分析結果表明，該回歸模型非常顯著（p<0.01），失擬項不顯著（p>0.05），說明模型可靠；R2=0.940 1，R2Adj=0.863 1，說明模型與試驗值擬合較好；由F值可知，各因素對油茶葉黃酮得率影響大小依次為超聲時間（B） >乙醇體積分數（A） >木瓜蛋白酶添加量（C）；交互項AC和二次項A2對黃酮得率的影響非常顯著（p<0.001）；一次項B、交互項AB和二次項B2對黃酮得率的影響顯著（p<0.05），說明乙醇體積分數和酶添加量兩兩交互作用對黃酮得率影響非常顯著，乙醇體積分數和超聲時間兩兩交互作用對黃酮得率影響顯著。

3.3.3 交互作用分析

乙醇體積分數與超聲時間交互作用的響應面與等高線見圖8，乙醇體積分數與木瓜蛋白酶添加量交互作用的響應面和等高線見圖9，超聲時間與木瓜蛋白酶添加量交互作用的響應面和等高線見圖10。

圖8 乙醇體積分數與超聲時間交互作用的響應面與等高線

圖9 乙醇體積分數與木瓜蛋白酶添加量交互作用的響應面和等高線

圖10 超聲時間與木瓜蛋白酶添加量交互作用的響應面和等高線

對比曲面陡峭程度，發現乙醇體積分數（A） 與超聲時間（B） 之間存在顯著的交互作用（p<0.05），乙醇體積分數（A） 與木瓜蛋白酶添加量（C） 之間存在非常顯著的交互作用（p<0.001），超聲時間（B）與酶添加量（C） 之間交互作用不顯著（p>0.05），與方差分析結果一致。

3.3.4 最佳提取工藝條件確定

利用Design Expert 8.0 軟件由所建立的數學模型進行參數最優分析，得出最佳萃取工藝條件為乙醇體積分數75.1%，超聲時間55.69 min，木瓜蛋白酶添加量0.8%，油茶葉黃酮得率為2.840%。考慮到實際操作的方便，選取調整后的最優參數為乙醇體積分數75%，超聲時間55 min，木瓜蛋白酶添加量0.8%，預測油茶葉黃酮得率為2.839%。在此條件下進行3 次驗證試驗，平均得率為（2.837±0.371） %，與預測值無顯著性差異（p>0.05），說明模型可靠。

4 結論

超聲輔助溶劑法提取油茶葉中黃酮最佳工藝參數為超聲功率240 W，頻率40 kHz，乙醇體積分數75%，木瓜蛋白酶添加量0.8%，料液比1∶22（g∶mL），超聲溫度50 ℃，超聲時間55 min，油茶葉黃酮平均得率為（2.837±0.371） %。為了進一步拓展油茶葉黃酮在提高免疫力、抗腫瘤等功能食品及保健產品方面的應用，可繼續開展油茶葉黃酮純化工藝及藥理學等方面的研究。