液相色譜-三重四級桿質譜法測定水中硝基酚類化合物

王建軍

（甘肅省中心實驗室，甘肅 蘭州 730050）

硝基酚類化合物對生態環境有較大的破壞，對人體健康也會造成較嚴重的傷害，它會與生物體中蛋白質發生一系列化學反應，導致細胞變異，嚴重時會使體內蛋白質凝固，導致昏迷或者死亡[1]。硝基酚類化合物一般呈現為黃色的晶體狀，在工業、醫學、材料領域發揮著不可或缺的作用[2-4]，酚類化合物所釋放出的毒性在自然環境中降解緩慢[5]，早年國外已將酚類化合物作為環境污染重點監測因子，中國在20世紀90年代也將部分酚類化合物作為主要監測對象[6]。到目前為止對硝基酚類化合物的監測分析較為重要，主要的分析方法有分光度光度法[7]、液相色譜法[8-9]、液相色譜/串聯質譜法[10]、氣相色譜法[11]、氣相色譜-質譜法[12-13]等。文章前處理采用超聲萃取凈化、離心及過濾，用超高效液相色譜-三重四級桿質譜儀測定水中4種硝基酚類化合物，該方法操作簡便，精密度和準確度良好。

1 實驗

1.1 儀器和試劑

超高效液相色譜-三重四級桿質譜儀，型號TQD，配備ESI和多反應監測模式，Waters公司；色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（1.5 μm，2.1×100 mm）；KH-500 DE型數控超聲波清洗器（昆山禾創）；離心機（博科）。

4種硝基酚類化合物標準貯備液（Reagecon公司，Ireland，100 μg/mL）；內標貯備液（2，4-二硝基苯酚-d3，Reagecon公司，Ireland，50 μg/mL）；甲醇、正己烷、二氯甲烷、甲酸、甲酸銨均為液相色譜純；氨水（優級純）；濾膜（0.22 μm，聚氟乙烯）。

1.2 實驗條件

1.2.1 液相條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（1.5 μm，2.1×100 mm）；進樣量：2.0 μL；流速：0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；流動相：甲醇（相A）和甲酸銨-甲酸溶液（相B，0.01 mol/L，pH=4），梯度洗脫程序見表1。

表1 液相洗脫程序

1.2.2 質譜條件

電噴霧離子源，負離子電離模式；MRM多反應監測模式；離子源溫度：150 ℃；毛細管電壓：2.95 kV；干燥氣溫度：450 ℃；干燥氣流量：60 L/hr，駐留時間：0.028 s。其他參數見表2。

表2 質譜參數

1.3 實驗步驟

1.3.1 標準使用液

取4種硝基酚類化合物標準貯備液（100 μg/mL）100 μL用甲醇定容到10.0 mL作為中間液（1.0 μg/mL），取中間液100 μL用甲醇定容到1.0 mL作為標準使用液（100 μg/L）。

取內標貯備液（2，4-二硝基苯酚-d3，50 μg/mL）40 μL用甲醇定容到10.0 mL作為標準使用液（200 μg/L）。

1.3.2 工作曲線繪制

分別用純水稀釋4種硝基酚類化合物的混合準使用液（10 μg/L）至1.0 mL，配制標準曲線濃度點為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L，加入內標使用液（200 μg/L）10 μL，內標物的濃度為2.0 μg/L。以酚類化合物濃度為橫坐標（x），以相應化合物與內標峰面積的比值為縱坐標（y），制作工作曲線。

1.3.3 樣品的采集、保存及前處理

采集水樣時需要將250 mL帶蓋的棕色玻璃瓶采集滿，不能留有空隙，將水樣的pH用甲酸或者氨水調節到7～9。樣品于4 ℃以下冷藏避光保存，且不能超過7 d。選用玻璃注射器移去取5.0 mL樣品于10.0 mL的具塞玻璃管中，加入1.0 mL二氯甲烷和正己烷混合溶液（體積比2∶1），于常溫下超聲萃取凈化10 min，轉移至離心機，在4 500 r/min的速度下離心10 min，靜置5 min后，取1.0 mL經0.22 μm濾膜過濾后的水相層，加入1.0 mL內標使用液，搖勻后上機測定。以保留時間和特征離子定性，內標法定量。

2 結果與討論

2.1 4種硝酚類化合物的定性分析

配制好的標準樣品經Waters-TQD超高效液相色譜-三重四級桿質譜儀分離檢測，其響應高，分離度好，如圖1所示。

圖1 4種硝基酚類化合物標準色譜圖

2.2 4種硝基酚類化合物的線性范圍和檢出限

根據以上實驗條件，4種酚類化合物在0.5～50.0 μg/L的線性范圍內，線性良好，相關系數均大于0.995，能夠滿足定量檢測要求。當取1.0 mL空白樣品（加標量為2.0 μg/L），依據上述方法重復測定7次，計算標準偏差S，依據公式MDL=S×t（n-1，0.99）計算檢出限，得到檢出限和測定下限見表3。能夠滿足生活污水、工業廢水、地表水和地下水的檢測要求。

表3 線性回歸方程

2.3 精密度和準確度

取地下水樣品，加標濃度為5.0 μg/L、10.0 μg/L和20.0 μg/L的低、中、高3個濃度點，依據上述實驗條件，每個濃度點重復測定6次，計算相對標準偏差和加標回收率。實驗數據見表4。

表4 精確度和準確度實驗

由表4可知，加標量在5～20 μg/L范圍內，回收率為71.5%～128%，相對標準偏差為1.0%～4.6%，其準確度高，精密度良好。

2.4 實驗條件的優化

2.4.1 pH對目標化合物的影響

實驗分析了不同pH條件下，對目標化合物加標回收率的影響程度。調節水樣的pH分別為3.5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0，根據上述實驗過程，進行超聲萃取凈化、離心，上機分析得到加標回收率。發現4種硝基酚類化合物的回收率伴隨水樣pH的升高而增加，當pH升高至7時，4種酚類化合物的回收率呈現平穩狀態，并且回收率基本大于90%。結果如圖2所示。

圖2 pH對目標化合物的影響

2.4.2 超聲萃取凈化與振蕩萃取凈化的對比

實驗中對比了超聲萃取凈化和振蕩萃取凈化2種方法，對4種酚類化合物的加標回收率和凈化效果的影響。取廢水樣品5.0 mL，加標量分別為1.0 μg/L、10.0 μg/L、20.0 μg/L，每個濃度點準備2個樣品，分別進行超聲萃取凈化和振蕩萃取凈化。結果如圖3所示。

分別取5.0 mL地下水、廢水、地表水各2份，進行超聲萃取凈化和振蕩萃取凈化，比對2種凈化方法的凈化效率，結果如圖4所示。

圖3 超聲萃取與振蕩萃取加標回收率的對比

圖4 超聲萃取與振蕩萃取的凈化效率對比

由圖3和圖4可知，在實驗條件下，相同的加標濃度，超聲萃取凈化和振蕩萃取凈化的加標回收率均在80%以上，但超聲萃取凈化的加標回收率普遍高于振蕩萃取凈化，而且超聲萃取凈化的效率優于振蕩萃取凈化的效率，說明在樣品量較少的情況下，應用超聲波的空化效應和機械效應，使得分子運動速度增大，從而加強其擴散和傳播過程，大大提高了萃取效率。振蕩萃取在樣品量較少的情況下，受振蕩幅度的限制，物質反應相比超聲萃取不完全，從而影響其萃取效率。

3 結論

通過超聲萃取凈化-超高效液相色譜-三重四級桿質譜法測定水中4種酚類化合物的實驗表明：水樣pH在7～9時，4種硝基酚類化合物的響應高、分離度和回收率較好。采用超聲萃取凈化，提高了目標化合物的加標回收率，降低了雜質的響應，提高了凈化效率。在實驗條件下，4種硝基酚類化合物加標濃度范圍為5～20 μg/L時，平均回收率為71.5%～128%，相對標準偏差為1.0%～4.6%。該實驗精密度和準確度良好，并且操作較為簡便，檢出限較低，可以滿足地下水、地表水、污水、工業廢水中4種硝基酚類化合物的檢測要求。