半干旱草地土壤團聚體氮磷轉化相關酶活性對氮添加的響應

鄧 健,趙 雪,盧笑玥,張 丹,徐莉萍,朱 運,吳林豪,李江文,2

1 延安大學生命科學學院,延安 716100 2 陜西省紅棗重點實驗室(延安大學),延安 716100

人類活動導致的大氣氮沉降影響著陸地生態系統的養分生物地球化學循環過程[1]。尤其是在受養分和水分限制的干旱半干旱地區,生態系統穩定性差,對氣候變化十分敏感[2];日益嚴重的氮沉降導致生態系統氮、磷輸入失衡[3],這可能會強烈改變土壤養分吸收和轉化過程[4]。土壤微生物是養分循環的核心驅動力,而胞外酶調控是微生物調控養分循環的最主要過程[5]。氮轉化相關的酶如β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-1, 4-N-acetylglucosaminidase,NAG)和L-亮氨酸氨基肽酶(L-leucine aminopeptidase, LAP)主要參與蛋白質、核酸等的水解,促進氮素的釋放[6];而磷轉化相關的酶如磷酸單酯酶(phosphomonolipase, PME)、磷酸二酯酶(phosphodiesterase, PDE)可水解土壤有機磷中的酯鍵促進磷素轉化,植酸酶(phytases, phyA)能夠催化植酸鹽水解成肌醇和磷酸,決定著土壤有機磷利用效率和磷素的有效性[7]。氮添加引起的土壤pH下降和養分含量提高會強烈干擾微生物胞外酶的分泌,例如氮添加導致土壤N∶P的升高會刺激微生物分泌更多磷轉化相關胞外酶(如堿性磷酸酶)[8],催化穩定態無機磷水解和有機磷礦化[9];此外,N添加還會通過改變土壤pH、有機碳含量等其他途徑影響酶活性[10]。然而,現有氮添加對土壤中養分轉化相關的酶活性影響的研究存在增加[11]、減少[12]或者中性[13]等不同的影響結果。這說明氮添加影響土壤酶活性的機理還有待進一步深入探討。

土壤團聚結構強烈地影響著養分轉化過程,如不同粒級土壤團聚體中的理化環境和微生物特征存在顯著差異[14]。大團聚體主要依靠微生物和有機物質的膠結作用形成,結構疏松,水分和氧氣含量較多[15];其中的微生物數量和胞外酶活性也高,因此其養分轉化速率較快[16]。小團聚體中氧氣和水分少,微生物活性較低,有機質更加穩定,養分周轉速率緩慢[17]。氮添加對不同粒級團聚體中土壤養分的差異性影響已經被觀察到,如氮添加后,中國內蒙古草地土壤大團聚體中較小團聚體具有更高的磷含量[18],大團聚體中氮含量也會顯著提高[19];這種團聚體之間的差異很可能來自于不同團聚體中土壤胞外酶對氮添加的差異化響應。然而目前對不同團聚體水平中養分轉化所對應胞外酶的認識還十分有限,尤其是氮添加對團聚體中氮、磷轉化相關酶的調控還缺乏深入認識。

黃土丘陵區屬于典型的半干旱氣候區,草地是該地區主要的土地利用類型之一[20]。當地的草地生態系統受到水分和養分的強烈限制,尤其是土壤磷素有效性較低;近年來不斷增加的氮沉降引起不平衡的養分輸入加劇了這一問題,并對土壤微生物酶促反應過程產生影響,這可能導致土壤的退化[21]。目前雖然對該區域氮沉降影響土壤養分循環的基本過程有了一定的認識,然而對團聚體水平上土壤性質和氮、磷轉化相關的酶活性對氮沉降的響應并不清楚。因此,本研究的目的是分析草地不同粒級土壤團聚體中土壤理化性質和氮、磷轉化相關酶活性對短期氮添加的響應特征,和團聚體水平上氮添加調控土壤氮、磷轉化相關酶活性的關鍵影響因素。研究有助于加深對半干旱區氮沉降驅動的土壤養分循環過程的理解。

1 材料與方法

1.1 研究樣地概況

研究區位于陜西省安塞區五里灣流域(36°52′N;109°21′E,海拔1061—1371 m)。該地區處于黃土高原腹地,具有典型的黃土丘陵溝壑地貌。研究區屬于暖溫帶半干旱氣候,年平均氣溫8.8℃,多年平均降水量505 mm。土壤主要為黃綿土(Calcaric Cambisols,FAO),平均土壤pH值為8.4。區域氮沉降主要形態為無機氮(銨態氮和硝態氮),自然氮沉降水平在10 kg N hm-2a-1到30 kg N hm-2a-1之間[22];研究樣地初始土壤有機碳、全氮和全磷含量分別為3.88 g/kg、0.52 g/kg和0.67 g/kg,速效磷含量低至4.89 mg/kg(僅占全磷含量0.73%),以往研究也表明該區域草地受到強烈的磷限制[23]。

1.2 試驗設計

研究采用野外施肥模擬氮添加控制試驗,2017年3月在流域內選擇典型的自然恢復草地作為試驗樣地,通過咨詢當地農戶了解土地利用歷史獲知該草地恢復年限約為30年。采用單因素隨機區組試驗設計。根據研究區域氮沉降水平為10—30 kg N hm-2a-1之間且在持續增加的特點,設置5個不同施氮水平的處理(0、10、20、40、80 kg N hm-2a-1,用N0、N1、N2、N3、N4表示),每個處理重復3次,共15個樣方,樣方面積9 m2(3 m×3 m),樣方之間設置1 m的緩沖帶以防止相互干擾。將15個樣方分為3個區組,以減少潛在地形位置和養分異質性造成的誤差。采用尿素(CH4N2O)作為氮添加劑;每年分四次將尿素溶解到1.5 L水中均勻噴灑。根據本區域主要為夏季濕沉降的特點,每年6月和9月分別施入全年氮添加量的1/3;3月和12月分別施入全年氮添加量的1/6;對照樣方噴灑等量的水。

1.3 樣品采集和土壤理化性質測定

于2020年8月采集土壤樣品,沿著每個樣方的對角線選擇3個點,清除表層雜物后,用鋁盒(20 cm×12 cm×6 cm)倒扣壓入土中收集表層土,以避免破壞土壤結構。隨即將土壤樣本運送至實驗室,并沿天然裂縫破碎成約1 cm3的小塊。去除細根、碎石、動物和植物殘留物之后,將同一樣方的土樣混合。采用最佳濕度篩分法進行團聚體分級[24],具體篩分方法為:首先將土壤鮮樣在4℃的條件下進行冷卻干燥,以達到10%的含水率。再將混合分取的土壤鮮樣放置于由2 mm和0.25 mm孔徑篩子組成的套篩上,以200 rpm的轉速震動3 min,最終得到大粒級團聚體(>2 mm)、中粒級團聚體(0.25—2 mm)和小粒級團聚體(<0.25 mm)三個粒級的團聚體樣品。每個粒級的土壤樣本分為兩部分,其中一部分儲存在4℃下,用于測定土壤酶活性;另一部分置于陰涼處風干后測定土壤的理化性質。

1.4 酶活性測定和計算

土壤酶活性測定采用96微孔板熒光光度法,使用多功能酶標儀(Synergy H4, BioTek)進行測定,其中β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶,亮氨酸氨基肽酶測定底物分別使用4-甲基傘形酮酰-β-D-吡喃葡糖酸苷(4-MUB-Nacetyl-β-D-glucosaminide)、L-亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素鹽酸鹽(L-leucine-7-amino-4-methylcoumarin);磷酸單酯酶、磷酸二酯酶和植酸酶測定底物使用對硝基苯磷酸二鈉(PNPP—NA2)和植酸鈉(Sodium phytate),詳細測定流程參考文獻[26],酶活性以干土質量計算。

氮、磷轉化相關酶活性計量比(EEAN∶P)采用對數轉化后的計量比值:

EEAN∶P= ln(LAP+NAG):ln(PME+PDE+phyA)

1.5 數據處理

數據經過正態性檢驗和方差同質性檢驗后采用單因素方差分析(One-way ANOVA)研究氮添加和團聚體對酶活性的影響差異,采用DUNCAN法進行多重比較;采用Spearman相關分析研究不同團聚體水平土壤酶活性與土壤養分及化學計量比間的相關關系;采用偏最小二乘回歸(Partial least squares regression, PLS)模型分析了氮添加對氮、磷轉化相關酶的影響路徑。所有的統計分析過程都通過R 3.6.2 (R Core Team, Vienna, Austria)來完成。數據和柱狀圖采用平均值±標準誤表示,養分計量比均采用摩爾比。

2 結果

2.1 氮添加對土壤團聚體理化性質的影響

表1 氮添加對不同粒級團聚體中土壤理化性質的影響

2.2 氮添加對土壤團聚體氮、磷轉化相關酶活性及酶計量比的影響

不同土壤團聚體中的土壤氮、磷轉化相關酶活性對氮添加的響應有顯著差異(P<0.05,圖1)。PME、PDE和phyA活性均在三個粒級團聚體中均總體表現為先降低后升高的變化趨勢,均在N2處理下最低(P<0.05)。不同粒級團聚體中LAP和NAG均隨著氮添加水平的升高而顯著升高(P<0.05)。小粒級和中粒級中氮、磷轉化相關酶活性均高于大粒級。EEAN∶P在三個團聚體中都隨著氮添加水平顯著升高(P<0.05)。

圖1 氮添加對不同土壤團聚體中氮、磷轉化相關酶活性及其計量比的影響Fig.1 Effects of nitrogen addition on the enzymes activities of related to nitrogen and phosphorus transformation and their stoichiometric ratios in different soil aggregates不同的大寫字母表示不同氮添加水平之間存在顯著差異(P<0.05);小寫字母表示不同粒級土壤團聚體之間存在顯著差異(P<0.05);N0、N1、N2、N3、N4表示5個不同施氮水平的處理(0、10、20、40、80 kg N hm-2a-1)

2.3 酶活性及其計量比和土壤基礎理化性質的關系

圖2 不同團聚體中土壤酶活性和土壤基礎理化性質的相關性Fig.2 Correlation coefficients between soil enzyme activities and basic soil physicochemical properties in different aggregatesSOC∶土壤有機碳 soil organic carbon;TN∶土壤全氮 total nitrogen;TP:土壤全磷 total 硝態氮 nitrate 銨態氮 ammonium nitrogen;AP:速效磷 available phosphorus;C∶N∶碳氮比 soil organic carbon: total nitrogen;C∶P:碳磷比 soil organic carbon: total phosphorus;N∶P:氮磷比 total nitrogen: total phosphorus;PME:磷酸單酯酶 phosphomonolipase;PDE:磷酸二酯酶 phosphodiesterase;phyA:植酸酶 phytases;NAG:β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶 β-1, 4-N-acetylglucosaminidase;LAP:亮氨酸氨基肽酶 L-leucine aminopeptidase;*表示在0.05水平下顯著;**表示在0.01水平下顯著

圖3 氮添加對不同團聚體土壤氮、磷轉化相關酶活性的影響Fig.3 Effects of nitrogen addition on soil enzyme activities related to nitrogen and phosphorus transformation in different aggregates采用氮添加梯度水平表示N添加;采用和表示氮相關養分;采用TP和AP表示磷相關養分;采用NAG和LAP表示氮轉化相關酶;采用PME、PDE和phyA表示磷轉化相關酶;虛線表示不顯著;實線表示顯著;紅色表示正向影響;藍色表示負向影響;*表示在0.05水平下顯著;**表示在0.01水平下顯著;***表示在0.001水平下顯著

圖4 不同團聚體土壤pH和酶活性氮磷比的關系Fig.4 The relationship between soil pH and nitrogen-phosphorus ratio of enzyme activities in different aggregates*表示在0.05水平下顯著; **表示在0.01水平下顯著

3 討論和結論

3.1 氮添加后不同粒級團聚體酶活性和養分特征

由于不同土壤粒級的空間異質性和資源可用性不同[27—28],導致其中的微生物群落的組成、活性和多樣性以及土壤酶活性也具有顯著差異[29],例如隨著團聚體粒徑的減小,土壤氮、磷轉化相關酶的活性反而顯著增加[30]。本研究也發現PME、PDE、phyA、NAG和LAP等氮、磷轉化相關酶在小團聚體中的活性顯著高于大團聚體,此前在黃土高原地區的多項研究也均表明土壤碳、氮、磷轉化相關酶活性均隨著土壤團聚體粒級的減小而增加[31—32]。一方面,可能是團聚體物理結構差異導致的,小團聚體內部孔徑小,養分和水分很容易通過擴散作用進入其內部,為微生物代謝和酶促反應提供更多可用基質,使得酶活性較高[33];而大團聚體孔隙大,結構相對疏松,總體穩定性低,土壤酶活性容易受到環境變化的影響,酶活性較低[34]。另一方面,不同粒級團聚體土壤底物質量的高低對酶活性也有影響[35]。土壤小團聚體通過礦物結合等過程對土壤有機質具有更強的保護作用,其有機質穩定性更高[36],因而其中的微生物需要分泌更多的胞外酶來獲取所需養分資源;而大團聚體中新輸入有機物多,更容易分解的有機體較含量高,微生物很容易從中獲取所需養分[28,37]。此外,從微生物組成的角度,小團聚體中細菌多樣性較高,而大團聚體中真菌多樣性較高[38],相對于真菌,細菌對氮、磷等養分的需求更大,因而其在小團聚體中需要更多氮磷轉化相關的酶來獲取營養[27]。最后,本研究發現小團聚體中SOC、TP等養分含量總體高于大團聚體,可能是由于微團聚體中主要以穩定的腐殖質碳為主,而大團聚體中則主要以易分解、礦化的活性有機碳為主[39]。因此,小團聚體中有機碳不斷累積富集,而大團聚體中的活性有機碳被微生物分解利用,導致土壤總有機碳含量小團聚體中高于大團聚體。

3.2 氮添加對土壤團聚體氮、磷轉化相關酶活性的影響

本研究中氮添加對氮、磷轉化相關的酶均有顯著影響,尤其是高濃度氮添加導致了土壤團聚體磷轉化相關的酶活性的顯著增加,這與藏北高寒草地氮添加試驗[40]和全球養分添加的Meta分析[41—42]的研究結果類似,都表明土壤磷酸酶活性會隨著氮添加濃度的增加而增加。其主要原因是氮添加提高了土壤氮素含量及其有效性,導致土壤N∶P的升高(表1),導致微生物對磷的相對需求增加,因而通過分泌更多植酸酶、磷酸酶等磷轉化相關的酶的方式獲取代謝所需的磷元素[43],資源分配理論認為微生物胞外酶產量隨著復合營養物質的投入和簡單營養物質的匱乏而增加[44]。一般來說,氮添加引起土壤氮的可利用性增加[45],最終會限制氮轉化相關酶(NAG+LAP)的活性[46]。然而本研究中,氮添加之后氮轉化相關酶(NAG+LAP)的活性卻有所升高,這與前人氮添加試驗的研究結果類似[47—48],其原因可能來自于氮添加劑的影響。尿素作為有機氮被施入土壤之后,不能直接被微生物所利用吸收,因而微生物需要通過提高NAG、LAP酶的分泌來分解利用尿素[49];而如硝酸銨(NH4NO3)等無機氮添加劑施入土壤后,微生物可以直接利用吸收,因此氮轉化酶(NAG+LAP)的活性反而降低[50]。

氮添加對土壤氮磷轉化相關酶活性的影響特征及其路徑在不同粒級團聚體中存在較大差異,這可能主要來自于不同粒級團聚體中基礎養分含量及其物理性質的差異(圖3)。尤其是在中粒級和大粒級團聚體中,氮添加通過影響土壤N相關的養分,從而顯著調控P轉化酶的活性(圖3)。一方面可能是因為外部輸入的養分更容易進入孔隙較大的大團聚體中,而小粒級團聚體對養分的物理保護作用比較強,因而大粒級和中粒級團聚體中氮素相關養分對外部氮添加的響應更加敏感[51],本研究中從N0到N4處理下大粒級團聚體中TN的增加幅度(72.90%)顯著高于小粒級團聚體(-11.19%)也證實了這一推測。另一個可能的原因是微生物群落在大和中團聚體中具有更高活性,對土壤養分的周轉更快[16],因而磷轉化相關酶活性更容易受到土壤氮素變化的干擾;此前的研究結果也表明氮添加會顯著改變土壤大團聚體微生物群落和酶活性,而對小團聚體微生物沒有顯著影響[52]。

氮添加導致的土壤pH下降(即酸化)也是其對酶活性調控的重要路徑之一,且已經被廣泛證實[53—55],主要是pH的降低可能改變土壤養分如磷、鐵等元素有效性,并引起土壤微生物群落和土壤酶活性的顯著變化[56]。但本研究雖然觀察到了不同團聚體粒級中pH的顯著下降(表1),但pH與除NAG活性外的其他酶活性均無顯著關系,這與此前研究結論并不一致。盡管如此,本研究卻發現土壤pH在不同團聚體粒級中均與土壤EEAN∶P呈顯著負相關關系(圖4,P<0.05)。這表明pH主要影響氮、磷轉化相關酶活性的相對平衡特征,這很可能來自于pH對氮、磷轉化功能微生物的調控[57]。土壤酸化可以直接改變土壤微生物群落組成[47],例如細菌的相對豐度和多樣性都與pH值呈正相關[58],而且氮、磷轉化功能微生物也對土壤pH比較敏感,例如pH是調控土壤phoD基因豐度和功能微生物群落的主要變量,而phoD基因則是編碼磷酸酶基因的主要基因[54,59]。因此,未來有必要繼續探索不同粒級團聚體氮磷轉化功能微生物群落對氮添加引起pH變化的響應。

土壤水分也是影響土壤酶活性的關鍵因子之一,在半干旱地區一定范圍土壤水分的升高能提高微生物活力和土壤氮磷轉化相關酶活性[60],而氮添加可能會通過改變地表植被覆蓋、有機物輸入或改變土壤結構等影響土壤水分特征[61],由此引起土壤酶活性的變化。然而本研究對水分指標并未涉及,這可能導致對氮添加影響團聚體酶活性機理認識的不確定性,因此有必要在今后將水分因子納入研究中。同時,本研究采用的最佳濕度篩分法在樣品處理中需要將土壤水分調節到10%左右,而處理時不同粒級團聚體由于結構差異其水分散失比例不同[62],這有可能引起不同粒級團聚體中的酶活性的改變,這也會對研究結果產生一定的影響。

4 結論

本研究證實了草地不同粒級團聚體中參與土壤氮、磷轉化相關的酶活性和土壤性質的差異化響應?？傮w上,磷轉化相關的酶活性在低濃度氮添加下降低而在高濃度氮添加下增加,而氮轉化相關的酶活性和EEAN∶P在不同氮添加水平下均顯著增加;小粒級團聚體比大粒級具有更高的酶活性;氮添加通過改變土壤養分含量及其計量比(如TN、SOC、C∶P等)調控著土壤氮、磷轉化相關的酶活性,其中大粒級和中粒級中對磷轉化相關酶活性的調控主要是通過改變土壤氮素養分含量來實現;此外氮添加引起土壤pH的降低顯著影響了不同團聚體粒級中土壤氮、磷轉化相關的酶計量比。研究結果有助于預測未來氮沉降背景下半干旱區土壤的養分循環過程的變化,為草地管理提供一定理論依據。