根系去除改變了毛竹林土壤酶活性對氮磷添加的響應

王 一,欒軍偉,劉世榮

1 國際竹藤中心 國家林業和草原局/北京市共建竹藤科學與技術重點實驗室, 北京 100102 2 四川長寧竹林生態系統國家定位觀測研究站, 宜賓 644000 3 中國林業科學研究院 森林生態環境與自然保護研究所, 北京 100091

世界范圍內工業的發展、化石燃料使用以及氮(N)肥施用導致大氣活性N沉降量逐年增加,全球大氣N沉降速率預計在2050年會比工業革命前增加近3倍[1—2]。盡管近年來我國工業減排和農業減肥使我國氮沉降量趨于穩定,但我國仍是氮沉降較嚴重地區之一[1, 3]。通常來講,通過沉降作用進入生態系統的氮素可作為養分滿足植被對氮素的需求,增加地上部分生產力[1, 4]。但長期且過量的氮沉降會引起土壤酸化、地上植被組成和地下土壤微生物群落結構的改變、甚至生態系統功能改變[5—7]。亞熱帶森林常被認為我國重要的N沉降區且相對缺乏磷元素(P)[3, 8],持續的N輸入會加劇亞熱帶地區的P限制從而影響生態系統過程[9—11]。快速生長的植物由于在合成蛋白質過程中需要大量的P作為結構支撐[12],因此可能加劇與土壤微生物對P元素的競爭作用。盡管已開展大量氮磷添加試驗研究[13],但受限于不同氣候帶生態系統具有不同氮磷養分狀況,目前很多結論仍存在爭議。尤其是在具有爆發式生長特征的毛竹林生態系統中,開展N、P添加試驗對我們了解N沉降下毛竹和土壤微生物的響應具有重要的作用。

土壤酶作為土壤中植物根系和微生物協同作用產生的活性物質,在調節土壤碳(C)和養分循環中發揮重要的作用,其常被作為參與土壤中C、N、P轉化和養分釋放的重要工具,也被作為土壤微生物對全球變化響應的重要指示因子[14—15]。酶的分泌過程需要能量和養分,因此土壤養分狀況變化會改變土壤酶產量分配[14]。植物通過根系獲取養分,這可能會加劇根系和土壤微生物之間對養分的競爭[16]。根系也會以分泌物的形式和自身周轉為微生物生長提供必需的能量[17]。因此,根系輸入變化將會通過改變土壤養分狀況以及底物數量和質量進而影響與土壤微生物生長相關的C、N、P資源在土壤酶中的分配[18]。在該過程中,土壤微生物通過“優化資源配置”協調分配與C、N、P循環相關的酶產量以滿足其對能量和養分的需求[15]。目前,已開展了毛竹林土壤酶活性對N添加響應的研究[19],但基于土壤酶的功能多樣性[20],探究土壤C、N、P循環相關酶活性對N、P添加和根系輸入變化的響應差異將有助于我們預測全球變化對竹林生態系統C、N、P循環的潛在影響。

毛竹(Phyllostachysedulis)作為我國面積最大,分布最廣的竹種,廣泛分布于我國亞熱帶地區[21]。毛竹爆發式生長階段需要從根系獲取大量養分供應,根系輸入變化可能會改變毛竹與土壤微生物之間對養分的競爭,進而影響土壤酶活性的變化。壕溝處理作為一種有效的改變根系輸入的手段,可在對土壤擾動盡量小的情況下切斷植物根系達到根系去除的效果,進而改變植物與微生物之間的養分競爭作用[22]。我們之前研究發現四川長寧地區毛竹林生態系統P相對缺乏[23],根系輸入變化是否會改變毛竹林土壤酶活性對N和P添加的響應我們仍不清楚。因此開展毛竹林生態系統N和P添加試驗并結合樣地內壕溝樣方試驗,考察土壤C、N、P循環相關酶活性對氮磷添加和根系去除的響應,為深入理解N沉降對亞熱帶森林生態系統碳和養分循環的影響提供科學依據。

1 研究區概況

研究地點位于四川省宜賓市長寧縣蜀南竹海景區(28°15′—28°47′ N,104°44′—105°03′ E),位于云貴高原向四川盆地過渡區,屬中亞熱帶濕潤性季風氣候,降水豐富,溫暖濕潤,年均降雨量1141.7 mm,年均氣溫18.3 ℃[24]。土壤以山地黃壤和紫色土為主(本研究所在區域屬山地黃壤)。該區處于西南叢生竹林區,江南混合竹和西南高山竹的分布交界區。研究地點的毛竹林是我國毛竹林成片分布西北緣,林下優勢植物有紅蓋鱗毛蕨(Dryopteriserythrosora)、芒萁(Dicranopterisdichoyoma)、狗脊蕨(Woodwardiajaponica)、烏蕨(Stenolomachusanum)、亮毛蕨(Acystopterisjaponica)、千金子等(Leptochloachinensis)[25]。

2 研究方法

2.1 試驗設計

2016年11月采用隨機區組試驗設計[24],在長勢健康的毛竹林設置4個區組,每個區組隨機安排對照處理(CK: control)、氮添加處理(N: N addition)、磷添加處理(P: P addition)和氮磷添加處理(N+P: N and P addition)。4個處理安排在4個區組內,共4個重復,共計16塊樣地。每個樣地面積為20 m × 20 m,樣地間至少預留5 m緩沖帶。同時為防止毛竹鞭根生理整合效應,在每個樣地周圍埋入0.3 cm厚、80 cm寬的PVC軟板。翌年4月在每塊樣地冠層下空地隨機選擇3個1 m × 1 m樣方進行深60 cm壕溝斷根處理(Trench),去掉樣方內灌草的地上部分,并用相同規格PVC軟板插入以阻隔根系重新長入,整個試驗期間保持壕溝樣方內無活植物體。同年6月,采用林冠下自動噴灌方式進行外源氮磷添加。其中,N添加量依據我國亞熱帶地區實際氮沉降量和未來增加趨勢設置高氮濃度[26],P添加量參考Cleveland方法[27]按照其與N添加量的相同配比進行。N添加選用NH4NO3,添加量為10 g N m-2a-1;P添加選用NaH2PO4,添加量為10 g P m-2a-1,添加量在每年平均分成6次隔月進行添加。每次添加將NH4NO3或NaH2PO4溶解于100 L水中并通過自動噴施系統均勻噴灑于樣地內,對照樣地噴施等體積的水,以防止氮磷添加導致的水分效應。樣地空間分布圖和植被信息分別見圖1和表1。

表1 樣地信息

圖1 樣地空間分布圖Fig.1 Spatial distribution of the plots

2.2 土壤樣品采集和化學性質測定

2.3 土壤酶活性測定

采用熒光微平板法測定土壤酶活性[29]:把1.00 — 1.25 g鮮土加入125ml的醋酸鈉緩沖液中(50 mmol/L pH=4.2),在攪拌機中均質1 min制成土壤懸液。將參與土壤C、N、P循環相關的共7種水解酶底物(表2)取50 μL加入已有200 μL土壤懸液的96孔微平板中作為樣品控制,樣品控制采用200 μL土壤懸液和50 μL酶底物,對照控制采用200 μL土壤懸液和50μL醋酸鈉緩沖液,淬火控制為200 μL土壤懸液和50 μL標準底物,底物控制為200 μL醋酸鈉緩沖液和50 μL酶底物。每個土壤樣品的每種控制設置1列,共計8個孔。在25 ℃培養箱中暗培養3 h后加入5 μL NaOH(0.5 N)停止反應,并使用酶標儀(LAMBDA 35,PerkinElmer,USA)進行熒光掃描讀數。

表2 土壤酶活性、功能和底物信息表

2.4 數據統計分析

根據German等人[30]方法計算AG、BG、BX、CB、NAG、AP和LAP活性,根據Moorhead等人[20]和Jing等人[13]方法進行土壤酶活性矢量分析,以明確土壤微生物受到碳限制還是養分限制。其中:矢量長度(VL,Vector length)表示土壤微生物碳和養分的相對限制,矢量角度(VD,Vector degree)表示土壤微生物N和P的相對限制,矢量角度>45°表示P限制,矢量角度<45°表示N限制。計算公式如下:

X=(BG+CB)/[(BG+CB)+AP]

Y=(BG+CB)/[(BG+CB)+(NAG+LAP)]

Vector length=SQRT(X2+Y2)

Vector degree=DEGREES(ATAN2(X,Y))

采用一般線性模型將氮添加(N)、磷添加(P)和根系去除(Trench)作為固定效應,將區組作為隨機效應,檢驗氮磷添加和根系輸入變化的主效應(N、P、Trench)及交互效應(N×P、N×Trench、P×Trench以及N×P×Trench)對未壕溝樣地和壕溝樣方土壤和細根化學性質、土壤酶活性、和土壤酶活性矢量特征的影響,采用Pearson相關分析分別檢驗未壕溝樣地和壕溝樣方土壤酶活性與土壤和細根化學性質相關性。以AG、BG、BX、CB、AP、NAG和LAP作為物種,使用Canoco 4.5進行主成分分析,并以土壤化學性質作為環境因子,使用Canoco 4.5進行冗余分析。所有統計分析均采用SPSS 17.0(SPSS Inc., Chicago, USA)進行。

3 結果與分析

3.1 氮磷添加和根系去除對土壤和細根化學性質的影響

氮添加處理(N)導致土壤碳磷比和氮磷比分別顯著降低17.5%和16.2%(P=0.035,P=0.006)(表3),磷添加處理(P)導致細根全磷含量顯著增加88.6%(P<0.001),二者交互作用(N×P)顯著改變了細根有機碳含量(P=0.003),其中P處理降低了N處理對細根有機碳含量的促進作用。根系去除處理(Trench)導致土壤全氮含量和銨態氮含量分別顯著降低33.6%(P=0.004)和66.0%(P=0.014),土壤全磷含量和碳氮比分別顯著增加74.4%(P=0.008)和38.8%(P=0.001)。根系去除處理與氮添加交互作用(N×Trench)顯著改變了土壤銨態氮(P=0.034)、土壤碳磷比(P=0.003)和土壤氮磷比(P=0.001),Trench處理抑制了N處理對土壤銨態氮的增加,但進一步增加了土壤碳磷比和土壤氮磷比。P處理與Trench處理(P×Trench)及二者與N處理的交互作用(N×P×Trench)對土壤和細根化學性質無顯著影響(表3,圖2—3)。

圖3 不同處理細根化學性質Fig.3 Fine root properties in different treatments

表3 氮磷添加和根系去除及其交互作用對土壤和細根化學性質的影響(P值)

3.2 氮磷添加和根系去除對土壤酶活性和矢量特征的影響

N處理導致土壤α-糖苷酶(AG)活性顯著增加了29.7%(P=0.048),P處理導致土壤酸性磷酸酶(AP)活性顯著降低34.0%(P=0.004),二者交互作用顯著改變了β-糖苷酶(BG)(P=0.032)和纖維二糖水解酶(CB)(P=0.002)活性,其中P處理降低了N處理對BG和CB的促進作用。Trench處理導致土壤AG、纖維二糖水解酶(CB)和亮氨酸氨基肽酶(LAP)活性分別顯著增加了313.4%(P=0.003)、113.7%(P=0.023)和25.6%(P=0.020),AP活性顯著降低了62.3%(P=0.024)。Trench處理與N處理(N×Trench)及其與P處理(P×Trench)的交互作用分別顯著改變了AG(P=0.011)和AP活性(P=0.048),其中,與未壕溝樣地相比,N處理在壕溝樣方增加了AG活性而P處理在壕溝樣方降低了AP活性。P處理和Trench處理分別導致土壤酶活性矢量角度顯著降低4.7%(P=0.013)和11.1%(P=0.005),N處理與P處理交互作用(N×P)顯著改變了土壤酶活性矢量長度(P=0.027)和角度(P=0.027),P處理將N處理對矢量長度的促進作用轉為抑制作用,而將N處理對矢量角度的抑制作用轉為促進作用。N處理與Trench處理交互作用(N×Trench)(P=0.036)及其與P處理三者交互作用(N×P×Trench)(P=0.032)顯著改變了土壤酶活性矢量角度(表4,圖4)。

表4 氮磷添加和根系去除及其交互作用對土壤酶活性和矢量特征的影響(P值)

3.3 土壤和細根化學性質對土壤酶活性的影響

綜合7種參與土壤C、N、P循環相關酶活性發現:未壕溝樣地和壕溝樣方以第一主成分軸顯著分開,解釋率為55.1%,而N處理與其他三種處理以第二主成分軸分開,解釋率為30.8%(圖5)。RDA分析發現:土壤化學性質共揭示土壤酶活性整體變異的93.6%,其中土壤碳氮比(P=0.001)、有機碳(P=0.007)、硝態氮(P=0.009)、銨態氮(P=0.026)和全氮(P=0.043)含量是影響土壤酶活性變異的主要原因(圖6)。通過進一步相關分析發現(表5):在未壕溝樣地,土壤養分含量(硝態氮和銨態氮)和細根化學性質(全氮和全磷)是影響土壤酶活性的主要因子;而在壕溝樣方,土壤有機碳和全氮含量則是影響土壤酶活性的主要因子。

表5 土壤和細根化學性質與土壤酶活性相關分析

圖5 土壤酶活性主成分分析Fig.5 Principle component analysis of soil enzyme activities

圖6 土壤酶活性與土壤化學計量特征冗余分析(RDA)Fig.6 Redundancy analysis of soil enzyme activity and soil characteristicsAG:α-葡糖苷酶;BG:β-葡糖苷酶;BX:木糖苷酶;CB:纖維二糖水解酶;NAG:N-乙酰-葡糖苷酶;AP:酸性磷酸酶;LAP:亮氨酸氨基肽酶;TOCsoil:土壤有機碳;TNsoil:土壤全氮;TPsoil:土壤全磷;Soil C:N:土壤碳氮比;Soil C:P:土壤碳磷比;Soil N:P:土壤氮磷比;NO3:土壤硝態氮;NH4:土壤銨態氮;pH:土壤pH值

4 討論與結論

4.1 氮磷添加對土壤酶活性的影響

氮添加和磷添加主效應對參與土壤C循環相關酶(BG、CB和BX)無顯著影響(除AG外)。與Chen等人[31]研究一致,認為短期的養分添加尚未引起土壤C循環相關酶活性的改變[32]。與C循環相關酶活性響應相似,氮添加和磷添加主效應對土壤N循環相關酶活性亦未產生顯著影響,這可能是因為在非N限制型生態系統繼續添加N素(10 g N m-2a-1)超過了生態系統內植物和微生物對N的吸收[33],故對土壤氮循環過程無影響;此外,趙陽等人[34]研究亦發現短期磷添加尚未改變熱帶森林土壤氮循環過程。鑒于N獲取策略的多樣性及其與C循環過程的耦合關系,土壤N循環相關酶分泌將受到土壤底物數量、質量和微生物等多因素調控[31,35],這也會增加N循環相關酶對養分添加響應的不確定性,故養分添加未對NAG和LAP產生顯著影響。與土壤C和N循環相關酶活性不同,磷添加主效應顯著降低了AP活性。已有大量研究表明磷添加對土壤磷酸酶活性有顯著的抑制作用[36—37]。這是因為P添加緩解了生態系統磷元素限制作用,降低了土壤微生物和植物對P的競爭性利用[36],因此土壤微生物和植物的協同互作關系會降低以獲取磷為目的的AP分泌量。“資源配置理論”和“最優分配原則”認為養分添加會改變土壤酶活性,且優先分配給缺乏的資源以緩解土壤養分的限制作用[15, 20,38]。研究發現P循環相關酶活性比C和N循環相關酶活性對氮磷添加的響應更敏感,且AP活性遠高于C和N循環相關酶活性。這可能是因為我們的研究區域屬于P缺乏型生態系統[23],所以在C、N、P資源分配中優先滿足用于磷酸酶的分泌,以保證在植物和微生物在低磷環境的生長發育。氮添加和磷添加二者交互作用顯著影響了土壤BG和CB活性,主要表現為氮磷共添加降低了單一氮或磷添加對BG和CB的促進作用。這可能是因為單一氮或磷添加可能會相應造成磷和氮元素的限制作用,進而引發土壤微生物對有機質氮磷養分的開采作用[39—40],微生物在該過程中分泌更多的酶以降解大分子有機物并從中獲取更多的能量和養分。因此,當氮磷共添加時,氮磷養分的協調供應可能會降低土壤微生物以養分開采為目的的酶產量。

4.2 根系去除對土壤酶活性的影響

與氮磷添加對土壤酶活性的影響不同,壕溝處理顯著改變了土壤C、N、P循環相關酶活性(表4)。其中,根系去除顯著增加了AG、CB和LAP的活性,但顯著降低了AP活性(表4,圖4)。作為土壤中重要的生物組分,根系通過自身周轉和分泌物的形式向土壤提供底物以供微生物利用[41—42]。壕溝切斷根系勢必會降低細根周轉和根系分泌物等活性有機碳輸入,進而改變降解纖維素的CB活性和分解可溶性糖的AG活性[18,43]。根系去除引起土壤活性底物輸入減少降低了土壤質量,增加了土壤碳氮比(表3,圖2)。土壤微生物需要分泌更多的酶分解較難利用的底物以應對土壤質量降低,故導致AG和CB活性增加。RDA分析(圖6)亦表明根系去除引起土壤碳氮比的增加是促使未壕溝樣地和壕溝樣方土壤酶活性產生分異的主要原因。土壤中含C底物輸入的減少也會伴隨著含N底物輸入的減少[44],可以從壕溝樣方中土壤全氮和銨態氮含量的降低得到驗證(表3,圖2)。土壤氮素狀態作為調控LAP活性的重要影響因子[43],根系去除引起土壤全氮和銨態氮含量降低亦是影響土壤酶活性變異的主要原因(圖6)。根系去除一定程度降低了土壤氮磷比(表3,P=0.055),增加了土壤氮限制作用,微生物需要分泌更多的LAP酶開采有機質中的氮素供吸收利用。與土壤C和N循環相關酶不同,根系去除顯著降低了AP活性(表4,圖4)。這主要是因為根系去除降低了根系對土壤中磷元素的吸收,進而間接增加了土壤中全磷含量(表3,圖2)。在土壤中磷含量增加的情況下,土壤微生物會降低AP的分泌量以降低其對有機質中磷元素的開采作用[39],故壕溝樣方中AP活性顯著降低。

4.3 土壤酶活性變異的生物和非生物驅動因素

冗余分析表明除土壤碳氮比外,土壤有機碳、全氮、硝態氮和銨態氮含量也是影響土壤酶變化的重要原因(圖6)。通過進一步的相關分析,發現土壤有機碳和全氮是影響壕溝樣方土壤C、N循環相關酶(BG、CB和LAP)活性的重要因子,而在未壕溝樣地,土壤養分含量(硝態氮和銨態氮)和細根養分含量(全氮和全磷)則是影響土壤C、N循環相關酶(AG、BG、CB和NAG)活性的重要因子(表5)。這可能是因為根系去除加劇了土壤底物輸入的限制作用[17],故土壤底物性質(有機碳和全氮)主要調控酶活性變化;而在未壕溝樣地內,土壤底物輸入并非主要限制因子,毛竹細根和土壤微生物對養分的競爭作用可能造成土壤和細根養分在調控酶活性變化中的重要作用[43]。土壤酶活性對氮添加和磷添加的中性響應主要是因為短期的養分添加并未顯著改變土壤有機碳、硝態氮和銨態氮含量(表3)。而根系去除顯著降低了土壤全氮含量和銨態氮含量,故根系輸入變化對土壤酶活性的影響整體上大于氮磷添加效應(表3和4)。

除土壤C和N循環相關酶活性外,我們發現磷添加和根系去除主效應及二者交互效應均顯著改變了土壤P循環相關酶活性(表4),其中磷添加主效應和根系去除主效應均顯著降低AP活性,但二者交互效應(P×Trench)則表現出在磷添加背景下未壕溝樣地AP活性顯著高于壕溝樣方,說明毛竹根系可加劇土壤磷元素對微生物的限制作用,故未壕溝樣地土壤微生物分泌更多的AP酶。這是因為外源養分添加的磷元素被毛竹細根吸收,磷添加主效應顯著增加了毛竹細根全磷含量(圖3)。我們亦發現未壕溝樣地AP活性與細根全磷含量呈顯著負相關關系(表5),磷添加在增加毛竹細根全磷含量的同時降低了AP活性,且壕溝樣方磷添加使AP活性降低了73.4%,未壕溝樣地磷添加使AP活性降低了58.4%(圖3和圖4),壕溝樣方AP活性降低的更多說明毛竹根系和土壤微生物在對土壤中磷元素競爭性利用中具有優勢,因此當有毛竹根系存在時,土壤微生物仍需分泌更多的AP以保證對磷元素的需求。此外,磷添加主效應和根系去除主效應均顯著降低矢量角度,但矢量角度仍大于45°(圖4),說明短期磷添加和根系去除一定程度緩解了磷缺乏[32],但研究區毛竹林生態系統土壤微生物仍然受到磷限制作用。這也進一步驗證了研究區毛竹根系比土壤微生物具有更強的磷競爭能力,因此短期磷添加并未徹底改變土壤微生物的磷限制作用。

短期氮添加和磷添加對毛竹林土壤C、N循環相關酶活性影響較小,但根系去除顯著改變了土壤C、N循環相關酶活性。其中,土壤有機碳、全氮和銨態氮含量對短期氮添加和磷添加的中性響應是土壤C、N循環相關酶活性無變化的主要原因,而根系去除降低土壤全氮和銨態氮含量則是調控土壤酶活性變異的主要原因。短期磷添加和根系去除雖顯著降低了土壤P循環相關酶活性,但研究區土壤微生物仍受到磷限制作用。這主要是因為在磷缺乏的毛竹林生態系統中,毛竹根系比土壤微生物具有更強的磷吸收能力。在磷缺乏的毛竹林生態系統中,土壤C、N、P循環相關酶活性對土壤環境因子(氮磷養分添加)和生物因子(根系去除)變化的響應具有不同的敏感性。因此,應注重區分環境和生物因子協調調控的土壤酶活性變異,以進一步認識不同功能土壤酶在參與調控土壤碳和養分循環中的作用。