重組纖連蛋白制備及其應(yīng)用

纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)n)是一種細(xì)胞外基質(zhì)中的高相對分子質(zhì)量糖蛋白，廣泛參與細(xì)胞的多種生理活動，包括細(xì)胞的遷移、黏附、增殖、止血及組織修復(fù)等過程。纖連蛋白還能調(diào)動單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)清除損傷組織處有害物質(zhì)，有利于傷口快速修復(fù)，具有生長因子作用。纖連蛋白也能顯著提高DNA、RNA 及蛋白質(zhì)合成速度，成為應(yīng)用規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)新藥品的基礎(chǔ)物質(zhì)。纖連蛋白應(yīng)用廣泛，但天然纖連蛋白產(chǎn)量極為有限，成本昂貴，限制了其應(yīng)用；傳統(tǒng)纖連蛋白生產(chǎn)工藝耗時長、提取流程復(fù)雜，且最終得率極低，也存在安全問題。

現(xiàn)階段對重組類人蛋白的研究與日俱増，對重組類人纖連蛋白的研宄也越來越多，已有研究者成功生產(chǎn)了自主研發(fā)的產(chǎn)品并展開基礎(chǔ)和臨床的應(yīng)用。 中國專利CN202211088313.8 公開了一種重組人源纖連蛋白制備及其在畢赤酵母中的表達(dá)方法。所述的重組人源纖連蛋白是將人源纖連蛋白中與膠原蛋白和細(xì)胞整合素結(jié)合的功能區(qū)域進(jìn)行理性設(shè)計優(yōu)化后所得，包含1 個膠原蛋白結(jié)合區(qū)域和2 個重復(fù)的細(xì)胞整合素協(xié)同結(jié)合區(qū)域。 所述的重組人源纖連蛋白是高拷貝重組菌株將重組人源纖連蛋白序列轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中，并經(jīng)G418 抗性梯度篩選獲得。 該重組人源纖連蛋白在護(hù)膚品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。CN201910891483.1 公開了一種密碼子優(yōu)化的重組纖連蛋白基因， 通過基因工程的方法在體外進(jìn)行表達(dá)純化。 該發(fā)明中利用畢赤酵母作為表達(dá)宿主細(xì)胞，可以解決人工提取纖連蛋白量少并且生物活性低的技術(shù)缺陷。 CN201910281043.4 公開了一種巴斯德畢赤酵母及其應(yīng)用。 所述的巴斯德畢赤酵母的保藏編號為CCTCC NO:M 2016763。 該發(fā)明中巴斯德畢赤酵母菌株的多肽表達(dá)量與現(xiàn)有技術(shù)中的同種菌株相比有大幅提高，提高幅度可達(dá)36.32%。 另外，巴斯德畢赤酵母的表達(dá)產(chǎn)物對于緊密連接蛋白ZO-1、層粘連蛋白和纖連蛋白的表達(dá)量具有明顯的增強作用，可作為緊密連接蛋白ZO-1、層粘連蛋白和纖連蛋白的基因表達(dá)上調(diào)劑。CN201910388775.3 公開了一種酵母發(fā)酵小分子重組纖連蛋白肽，包括至少一個鈉鉀ATP 酶β 亞基結(jié)合域，該發(fā)明還公開了該酵母發(fā)酵小分子重組纖連蛋白肽的制備方法以及應(yīng)用。 酵母發(fā)酵小分子重組纖連蛋白肽能夠有效被皮膚吸收， 對創(chuàng)傷型皮損或角質(zhì)完整的皮下?lián)p傷有優(yōu)秀的愈合和修復(fù)作用。CN202010116877.2 公開了一種重組人纖連蛋白制備方法和應(yīng)用。 根據(jù)密碼子表達(dá)偏好性先優(yōu)化了目的基因片段， 再將所得的基因片段插入pET32a 中構(gòu)建重組質(zhì)粒； 將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化導(dǎo)入表達(dá)載體BL21(DE3)中，經(jīng)篩選得到了能高效表達(dá)的陽性克隆菌；再將陽性克隆菌經(jīng)放大發(fā)酵培養(yǎng)后誘導(dǎo)表達(dá)，再將破碎、離心得到的上清液經(jīng)親和層析柱洗脫、透析、過濾步驟純化后，得到蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度高達(dá)1.0 mg/mL 以上，純度大于90%的rhFNⅢ1-C 優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)溶液。通過促細(xì)胞黏附性實驗檢測觀察，顯示rhFNⅢ1-C 具有明顯促進(jìn)MDBK 細(xì)胞和Balb/c/3T3 細(xì)胞貼壁、黏附和細(xì)胞快速分裂生長的性能，表明該蛋白質(zhì)具有作為藥妝醫(yī)美護(hù)膚原料和成品的巨大潛力。 CN202210844025.4 公開了一種重組纖連蛋白突變體及其應(yīng)用，通過對重組纖連蛋白突變體的核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化， 通過部分片段的重復(fù)， 可以更有效地促進(jìn)細(xì)胞增殖活性及黏附活性。CN202111056589.3 涉及一種復(fù)合透皮重組纖連蛋白及其應(yīng)用。 該復(fù)合透皮重組纖連蛋白包括透皮短肽、纖連蛋白和膠原蛋白順次連接的融合多肽，能有效解決現(xiàn)有纖連蛋白存在的透皮能力低、細(xì)胞黏附差、伸展及生長能力差的技術(shù)問題。 CN202010438531.4 涉及具有抗皺修復(fù)功能的重組纖連蛋白，包括至少一個可以和細(xì)胞整合素受體結(jié)合的RGD 結(jié)構(gòu)域、至少一段可作用于鈉離子通道的結(jié)合肽段，所述RGD 結(jié)構(gòu)域與所述鈉離子通道結(jié)合肽段之間用包含0~300 個氨基酸殘基的多肽連接片段進(jìn)行連接，同時具有結(jié)合鈉離子通道以及整合素受體的能力，具有促進(jìn)皮膚修復(fù)、代謝更新、增強淡斑、減少皺紋的效果，其采用高密度發(fā)酵、超耐受金屬親和層析純化、特異性蛋白酶切除標(biāo)簽、離子柱精制純化方法，得到的重組纖連蛋白rFN 不含純化標(biāo)簽、純度高、比活力高，制備過程簡單高效、低成本、適合大規(guī)模生產(chǎn)。

隨著人們對重組纖連蛋白應(yīng)用效果認(rèn)可度的提高和產(chǎn)品需求量的增長，相信相關(guān)的研究會不斷向前推進(jìn)。 如研究纖連蛋白功能域片段設(shè)計與優(yōu)化、纖連蛋白表達(dá)載體構(gòu)建與篩選，以及纖連蛋白的分離純化、結(jié)構(gòu)與功能分析、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)等技術(shù)，開發(fā)多功能的重組纖連蛋白，在未來會有更好的發(fā)展前景。