咖啡酸和迷迭香酸對黑比諾干紅葡萄酒香氣成分的影響

張 瑜， 張 波*， 楊 博， 牛見明， 史 肖，吳娟弟， 李寧寧， 韓舜愈

（1. 甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2. 甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；3. 甘肅省葡萄酒產業技術研發中心, 甘肅 蘭州 730030）

香氣不僅是葡萄酒重要的感官評價指標，更是影響消費者選購最直接的因素之一[1]。 葡萄酒香氣主要包括品種香氣、發酵香氣和陳釀香氣，會受多種因素（葡萄品種、氣候土壤、栽培模式、發酵工藝、陳釀環境等）的影響。 近年來大量研究表明，葡萄酒香氣還會受到酒中非揮發性成分的影響，例如蛋白質、多糖、乙醇、甘油、多酚化合物[1-4]等，這些基質成分會影響葡萄酒香氣的釋放程度及呈香特征，因此有關基質對葡萄酒香氣的影響已成為葡萄酒釀造工藝優化、過程質量控制、品質鑒別提升，以及風格特色認定等研究的熱點[5]。

多酚是葡萄酒的重要“骨架”，對葡萄酒香氣品質的影響尤為重要，其作用從葡萄被壓碎或壓榨開始，一直持續到葡萄酒的發酵和陳釀階段。 研究表明，多酚與香氣物質的相互作用會影響葡萄酒香氣的釋放和感知[6]。 利用HS-SPME/GC-MS 研究多酚對葡萄酒香氣品質的影響發現，兒茶素可明顯抑制己醛和己酸乙酯（抑制率為10%~20%）的釋放[7]。 而Dufour 等研究發現，在模擬酒溶液中添加縮合單寧（0~5 g/L）僅對檸檬烯有影響，而對其他物質（乙酸異戊酯和己酸乙酯）則無任何作用[8]。 同時，Mitropoulou 等還發現，多酚對香氣化合物的影響程度還與酚類物質濃度有關，例如在模擬酒溶液中添加不同濃度的單寧，乙酸異戊酯、2-甲基-1-丁醇和琥珀酸二乙酯的釋放程度會隨單寧濃度的增加而變大[9]。 多酚除影響酒中香氣物質的釋放，還對香氣物質感知產生作用，如咖啡酸的使用可明顯提高測試人員對葡萄酒中3-巰基己醇的感知[6]，但也有研究顯示，隨著多酚濃度的提高，部分樣品（馬爾貝克葡萄酒）中主要香氣物質的感知強度有下降的趨勢[10]。

咖啡酸是葡萄酒中主要的酚類化合物，而迷迭香酸是咖啡酸的結構類似物（由咖啡酸和丹參素酯化形成）， 兩者在自然界中均屬常見的多酚物質[11]。有學者測試了咖啡酸和迷迭香酸等酚類物質的輔色特性，發現其可較好地保護葡萄酒的色澤[12-13]。 不過作者在前期研究中發現上述酚酸除了存在輔色效應外，對葡萄酒香氣也產生作用，并且結構相似的多酚存在不同的作用效果[11]。

盡管目前對葡萄酒中酚類物質影響香氣釋放已有部分的研究，但是大多集中在模擬溶液條件中對靜態樣品的分析，而對于在真實葡萄酒發酵環境下的測定，特別是在陳釀過程中對香氣物質的動態跟蹤目前還鮮有報道。 因此，作者以甘肅河西走廊產區黑比諾葡萄為原料，通過在乙醇發酵前添加酚類物質咖啡酸和迷迭香酸， 利用HS-SPME/GC-MS技術，測定陳釀過程中干紅葡萄酒主要香氣物質的變化情況，分析添加酚類物質對香氣物質變化的影響，以期為酚類物質在干紅葡萄酒中的應用，以及葡萄酒的品質提升提供數據支撐和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑比諾葡萄：2018 年9 月采摘于甘肅景泰釀酒葡萄種植基地，糖度為21.7 °Bx，可滴定酸為6.50 g/L（以酒石酸計）、pH 為3.61；釀酒酵母（D254）、乳酸菌（Oenococcus oeni）：法國Laffort 公司產品；果膠酶：法國Lallemand 公司產品。

咖啡酸、迷迭香酸（均為食品級）：陜西潤生生物科技有限公司產品；2-辛醇 （色譜純）： 美國Sigma-Aldrich 公司產品；乙醛、偏重亞硫酸鉀、沒食子酸、碳酸鈉、氫氧化鈉、碘、碘化鉀、淀粉（均為分析純）：上海源葉生物科技有限公司產品；乙酸鈉、乙酸、鹽酸、氯化鉀、氯化鈉（均為分析純）：天津市光復科技發展有限公司產品；斐林試劑、次甲基藍指示劑等：按照GB/T 603—2002《化學試劑試驗方法中所用制劑及制品的制備》進行配制。

1.2 儀器設備

pH 計（PHS-3C）：上海雷磁儀器有限公司產品；TU-1810 紫外-可見分光光度計： 北京普析通用儀器有限責任公司產品；TD5A-WS 臺式低速離心機：東莞康潤試驗科技有限公司產品； 固相微萃取裝置、50/30 μm 二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅萃取頭： 美國Surpelco 公司產品；TRACE1310-ISQ 氣相色譜-質譜聯用儀：法國Salleron 公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 干紅葡萄酒的釀制 黑比諾葡萄經人工篩選、 除梗破碎后均勻分裝在9 個20 L 的不銹鋼罐中， 添加60 mg/L SO2溶液和20 mg/L 果膠酶溶液，并設置未添加酚酸、分別添加150 mg/L 咖啡酸和迷迭香酸處理組（酚酸用量參考相關文獻[14]并經預實驗篩選確定），置于4 ℃下恒溫冷浸漬48 h 后，于室溫回溫至17 ℃， 添加200 mg/L 釀酒酵母啟動乙醇發酵，乙醇發酵結束后進行皮渣分離，添加20 mg/L乳酸菌啟動蘋果酸-乳酸發酵，待發酵結束后，裝瓶陳釀12 個月（陳釀溫度為（15±1） ℃，相對濕度為75%~85%）。 分別在乙醇發酵前、乙醇發酵結束，及陳釀0、3、6、9、12 個月取樣，取樣后迅速置于-20 ℃冰箱保存，待測。 每個處理重復3 次。

1.3.2 葡萄酒基本理化指標測定 乙醇體積分數、總糖、揮發酸、總酸、pH、游離SO2和總SO2參照國家標準 《葡萄酒、 果酒通用分析方法》（GB/T 15038—2006）進行測定[15]；單寧、總酚參照《葡萄酒分析檢驗》中的方法測定[16]。

1.3.3 葡萄酒香氣化合物測定 香氣物質萃取和GC-MS 檢測條件參照魯榕榕的方法[17]。

定性分析：采用保留指數（RI）和譜庫檢索比對進行定性，在譜庫比對時要求與系統自帶的標準質譜庫（NIST-11、Wiley 及香精香料庫） 匹配度大于800[18-19]。

定量分析：采用內標法進行半定量分析，內標物質為2-辛醇。 計算公式如下：

式中：ρ 為各香氣成分質量濃度，μg/L；S 為各組分的峰面積；ρ1為內標物質量濃度，μg/L；S1為內標物峰面積。

1.3.4 葡萄酒香氣OAV 分析 參考Capone 等的方法[19]，并根據葡萄酒香氣輪中的香氣類型將香氣物質分為果香、花香、植物味、化學味、脂肪味、香料味等。 按氣味特征將樣品中檢測到的主要揮發性物質進行分組，氣味特征類似的物質歸為同類，并計算該類物質的OAV 總和， 即可對香氣輪廓進行模擬分析，計算公式如下：

式中：O 為樣品OAV；ρ2為香氣化合物質量濃度，μg/L；L 為閾值，μg/L。

1.4 數據分析

利用Microsoft Office Excel 2010 和Origin 2018對所得數據進行處理和繪圖。 使用IBM SPSS Statistics 20.0 進行多因素方差分析（Duncan 法，P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 理化指標分析

葡萄酒的理化指標常作為衡量葡萄酒品質的最基本指標。 作者對陳釀12 個月葡萄酒樣的基本理化指標進行測定。 由表1 可知，酒樣各項理化指標均符合國標GB/T 15038—2006 要求。 此外，咖啡酸處理酒樣中總酚質量濃度（1 070.11 mg/L）明顯高于對照組和迷迭香酸處理組， 分別高出11.43%和1.89%。 與對照相比，咖啡酸和迷迭香酸處理葡萄酒樣中的單寧質量濃度略有下降。

表1 供試酒樣基本理化指標Table 1 Basic physicochemical indexes of wine samples

2.2 處理組香氣成分比較

作者共檢出61 種（主要包括酯類、醇類、酸類、萜烯及降異戊二烯類和其他類等） 香氣化合物，這些香氣化合物可通過累積、協同、抑制和掩蔽等作用使葡萄酒的香氣復雜多變。 為了直觀體現葡萄酒的香氣特征，作者參考已有的文獻資料[20-23]，并綜合考慮各揮發性物質的質量濃度、閾值水平及是否具有特征香氣等因素，最終篩選出共同含有且質量濃度較高的24 種香氣物質進行具體分析。

由表2 可知，共檢測到乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯等8 種主要的酯類物質。 經分析，咖啡酸處理酒樣中的主要酯類物質顯著增加，其中辛酸乙酯和己酸乙酯對該樣品的水果香味貢獻較大，最高質量濃度分別為5 228.96、1 646.01 μg/L。而部分乙酸酯類物質質量濃度在陳釀過程中呈現先上升后降低，整體下降的變化趨勢，例如乙醇發酵結束時，3種樣品中乙酸乙酯質量濃度分別為631.65 μg/L（對照組）、561.53 μg/L （咖啡酸處理組）、213.54 μg/L（迷迭香酸處理組），在陳釀第6 個月時，3 種樣品中其質量濃度分別增加1.40 倍、1.87 倍和1.55 倍。 但相比其余兩組， 咖啡酸處理組在陳釀12 個月時乙酸乙酯的質量濃度較高，同時，咖啡酸對其他乙酯類物質（丁酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯等）也有類似的效果，說明咖啡酸處理可減少酒樣中乙酯類香氣物質的損失，有利于葡萄酒陳釀期間花果香味的保持。 而對照組中丁酸乙酯和乙酸異戊酯在陳釀第9 個月時出現質量濃度最低點，分別為16.45 μg/L 和70.76 μg/L， 原因可能是這些酯類物質在陳釀時發生水解導致質量濃度降低[24]。同時，對照酒樣中乳酸異戊酯的質量濃度隨著陳釀時間的延長而呈上升趨勢，這與蔡建的研究結果相似[25]。而具有果香味的丁二酸二乙酯質量濃度在整個陳釀過程中呈現先上升后下降， 再上升至峰值 （對照組：1 695.69 μg/L；咖啡酸處理組：2 234.70 μg/L；迷迭香酸處理組：76.33 μg/L）的動態變化趨勢。 綜上，推測發酵前添加咖啡酸在陳釀過程中對葡萄酒整體香氣品質的提升具有積極作用。

表2 供試酒樣陳釀過程中主要酯類化合物變化Table 2 Changes of main ester compounds of wine samples during aging

由表3 可知，共檢測到丙醇、正己醇和異戊醇等6 種主要醇類物質，主要醇類物質總質量濃度呈下降趨勢，這與Fedrizzi 等的研究結果相似[29]。 比較對照組中各醇類物質質量濃度變化發現， 異戊醇、苯乙醇和苯甲醇在陳釀0 個月到陳釀末期基本呈先逐漸升高之后緩慢下降并趨于穩定的變化趨勢。其中異戊醇變化幅度較大，對照組中其質量濃度在陳釀12 個月時（1 303.94 μg/L）相比于陳釀0 個月（1 462.89 μg/L）降低了10.86%，而咖啡酸處理組中異戊醇質量濃度明顯高于對照組。 研究表明，酵母可利用亮氨酸經埃爾利希等途徑（Ehrlichpathway）形成異戊醇，而酚類物質會與亮氨酸發生作用而影響上述途徑的轉氨反應，進而影響異戊醇的變化，因此推測，咖啡酸可能產生了類似的作用效果[30]。同時，具有玫瑰花香及蜂蜜味的苯乙醇也有類似的現象， 苯乙醇在陳釀后期有明顯積累的現象， 陳釀12 個月時咖啡酸處理組中苯乙醇的質量濃度分別比對照組、迷迭香酸處理組高出22.83%和67.01%。 有學者認為苯乙醇可能由發酵中的苯丙烷代謝產生，這對葡萄酒的花香具有積極貢獻[31]，咖啡酸為此代謝過程中的一種中間產物，因此，可能是外源添加的咖啡酸作為苯乙醇合成的底物參與了其積累過程，使酒樣中其質量濃度較高。 添加咖啡酸可明顯抑制具有青草味的正己醇積累，與先前的研究結果相似[11]。此外，添加迷迭香酸會導致酒樣中丙醇、2，3-丁二醇和苯甲醇顯著增多， 這可能會對酒體的香甜和脂肪味有微弱增強。

表3 供試酒樣陳釀過程中主要醇類化合物變化Table 3 Changes of main alcohol compounds of wine samples during aging

由表4 可知，共檢測到α-松油醇、香茅醇和β-大馬士酮等5 種主要萜烯及降異戊二烯類化合物。其中，香茅醇和β-大馬士酮在整個陳釀過程中質量濃度較高，尤其是具有極低閾值（0.14 μg/L）的β-大馬士酮對酒樣香氣貢獻較大，可賦予酒樣濃郁的紫丁香和果香。 在陳釀期間，對照組的香茅醇（具有檸檬香、柑橘香）質量濃度先逐漸上升，在陳釀3 個月時達到峰值（52.07 μg/L），之后略有降低并趨于穩定， 陳釀12 個月時相比乙醇發酵結束降低了49.74%。 而咖啡酸處理組中香茅醇質量濃度與其余兩組有明顯差異，例如在陳釀12 個月時，該組酒樣中其質量濃度為46.58 μg/L，分別是對照組、迷迭香酸處理組的1.31 倍和1.69 倍， 表明咖啡酸的添加有助于葡萄酒中檸檬香、柑橘香等果香的保持。 反式-橙花叔醇、α-松油醇和芳樟醇也有類似的現象，這與Aronson 等的研究結果一致[32]。 值得注意的是，在乙醇發酵結束時3 種處理酒樣中均未檢測到反式-橙花叔醇，但隨陳釀時間的延長，反式-橙花叔醇在各酒樣中均被檢出，推測可能是其前體物質通過特殊的反應途徑產生，具體原因還有待進一步研究。 有研究認為，萜烯類物質在整個陳釀過程中基本保持穩定[25]，這與該實驗結果相異，可能與陳釀環境等因素有關。 此外，在陳釀12 個月時，咖啡酸處理酒樣中萜烯及降異戊二烯類物質總質量濃度為93.59 μg/L， 相比對照組和迷迭香酸處理組分別增加了54.98%和27.77%， 這與前人的研究結果相似[33]，推測酚類物質影響萜烯及降異戊二烯類香氣物質的釋放可能是物理化學作用導致，且與酚類物質的化學結構密切相關。

表4 供試酒樣陳釀過程中主要萜烯及降異戊二烯類香氣化合物變化Table 4 Changes of main terpene and norisoprenoid compounds of wine samples during aging

由表5 可知，共檢測出正己酸、正癸酸和辛酸3種主要的酸類物質。 乙醇發酵結束時，咖啡酸處理酒樣中正己酸和辛酸較對照酒樣分別多出44.63%和31.74%，并且隨著陳釀時間的延長，咖啡酸處理酒樣中主要酸類物質質量濃度整體呈上升趨勢，例如正己酸從乙醇發酵結束到陳釀12 個月增加了81.77 μg/L，辛酸和正癸酸也有類似的現象。 研究表明，正己酸和辛酸（具有乳酪、奶油味）主要由乙酰輔酶A 與丙二酰輔酶A 在酵母細胞中反應產生，當質量濃度較低時將有助于改善葡萄酒的風味[34]，咖啡酸雖會促進這3 種酸類物質的積累，但酒樣中主要酸類物質在陳釀階段均未超過閾值（正己酸、正癸酸和辛酸閾值分別為420、30 000、1 000 μg/L[11]），因此不會對酒體產生負面影響。 而迷迭香酸處理組表現出顯著抑制主要酸類物質積累的現象（P＜0.05），例如乙醇發酵結束時，該酒樣中主要酸類物質質量濃度僅占對照酒樣總和的51.52%，且這種作用效果可延續至陳釀末期。 同時，酚酸處理使酒樣中2，4-二叔丁基苯酚和2，6-二叔丁基對甲酚基本均高于對照組，但因其閾值或香氣類型未查閱到，對香氣的影響還無法推測。

表5 供試酒樣陳釀過程中主要酸類及其他化合物變化Table 5 Changes of main acid and other compounds of wine samples during aging

2.3 樣品主要香氣物質的主成分及OAV 分析

為了進一步描述咖啡酸和迷迭香酸的添加對香氣物質的影響，考慮以上揮發性物質的閾值及香氣類型情況，采用主成分分析法對3 種處理酒樣中共同含有的22 種揮發性物質進行綜合評價。

如圖1 所示，在乙醇發酵結束時，咖啡酸處理酒樣中主要香氣化合物為乙酸異戊酯、 癸酸乙酯、苯乙醇和異戊醇等， 這些物質可賦予酒體果香、醇香等香氣特征。 陳釀6 個月時，咖啡酸處理酒樣的主要香氣貢獻物在前期（乙醇發酵結束）的基礎上增加了乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、α-松油醇和β-大馬士酮等物質。 隨著陳釀時間的延長，在陳釀12 個月時，酒樣中主要香氣貢獻物在陳釀6 個月的基礎上增加了乳酸異戊酯、丁二酸二乙酯、苯乙醇和正己酸等，表明咖啡酸處理酒樣中具有花果香的物質質量濃度及種類逐漸增多，有利于陳釀階段葡萄酒花果香味的保持和酒體香氣品質的提升。 而迷迭香酸處理酒樣的香氣特征較差。

圖1 供試酒樣主要香氣物質主成分分析Fig. 1 Principal component analysis of main aroma compounds in wine samples

如圖2 所示，酒樣的香氣主要是由果香、花香組成，其次為脂肪味，而其他香氣類別（化學味和香料味）的呈味很弱（OAV 均小于1.0），其中果香的香氣強度最高。 隨著陳釀時間的延長，添加咖啡酸的酒樣中果香OAV 先增大后減小， 在陳釀6 個月時出現峰值， 這一現象主要與該酒樣中己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和β-大馬士酮等物質的積累情況有關，可賦予酒體濃郁的花果香味。 同時，咖啡酸對酒樣中花香OAV 的影響與果香類似， 這種效果可一直延續到陳釀末期，進一步證實了主成分分析中的結果。 酒樣中果香、花香的增強說明添加咖啡酸對葡萄酒陳釀過程中香氣品質的提升有積極作用。

圖2 供試酒樣香氣物質的OAVFig. 2 OAV values of the aroma components of the wine samples

了解基質成分的作用，在為釀造優質葡萄酒提供一定理論參考的同時，也對葡萄酒風味預測具有重要意義。 近年來，有大量研究表明葡萄酒基質成分如蛋白質、多糖、乙醇及多酚等[1-4]均會對香氣物質的釋放有不同程度的影響，在葡萄酒復雜的溶液體系中，其基質成分不同會導致香氣物質的揮發性存在很大的差異，究其原因可能是非揮發性基質成分與香氣物質產生特異性的相互作用導致，最終賦予酒體不同的香氣風格特征[35]。 多酚是一種不穩定的化合物， 其對葡萄酒香氣的作用從葡萄破碎開始，一直持續到葡萄酒的發酵和陳釀階段，過程中可能涉及多酚與香氣物質的相互作用，從而影響香氣的釋放和感知。

該研究發現咖啡酸和迷迭香酸在影響主要香氣物質積累方面效果不同。 推測造成兩種酚類物質對香氣影響效果不同的原因可能與其結構相關。 相比咖啡酸分子的單個苯環平面，迷迭香酸分子結構中含有2 個酚環基團，使后者可以提供更大的作用表面[36]。 不過具體有關結構差異是如何影響香氣物質的問題還需進一步探索。 此外，對于整個陳釀過程而言，酚類物質對香氣化合物的影響，除可能與香氣物質和基質間的結合性能差異有關外，是否還存在如pH、離子強度、溫度等溶液環境因素影響酚類物質對葡萄酒香氣組分的作用，還需進一步研究。

3 結 語

研究了發酵前添加咖啡酸和迷迭香酸對干紅葡萄酒發酵和陳釀階段主要香氣成分的影響，結果表明：1）咖啡酸處理酒樣中代表花果香味的主要酯類、醇類、萜烯及降異戊二烯類、酸類香氣物質顯著高于對照組和迷迭香酸處理酒樣（P＜0.05），對葡萄酒陳釀過程中花果香味的保持具有積極意義。 而迷迭香酸處理酒樣中香氣物質質量濃度較低且香氣種類單一，整體香氣品質較差。 2）進一步通過主成分和OAV 分析表明，陳釀過程中，咖啡酸處理酒樣與乙酸乙酯、乙酸異戊酯、苯乙醇、β-大馬士酮等具有果香、紫丁香味的物質有較高的相關性，而迷迭香酸處理酒樣與2，3-丁二醇、芳樟醇等具有黃油和乳酪香味、草本植物味的物質相關性較高。 因此，推測發酵前添加咖啡酸對葡萄酒在陳釀過程中花果香味的保持有積極意義，可有效避免葡萄酒中主要香氣物質隨陳釀時間延長而損失。