基于UPLC-Q-TOF-MS和網絡藥理學辨識白芍治療原發性痛經的質量標志物

李娜 劉孜 李哲 趙藍青青 熊輝

原發性痛經(primary dysmenorrhea,PD)是指生殖器官無器質性病變的痛經,常見行經前或月經期出現下腹疼痛、墜脹,伴腰酸或其他不適,程度較重可致影響生活和工作[1]。白芍為毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根,微寒,味苦、酸,具有養血調經、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽等功效。白芍化學成分豐富,主要包括萜類類、黃酮類、鞣質類等。程天緣[2]等人通過中醫傳承輔助平臺中的“方劑分析”功能,經過篩選與總結,得到治療痛經的中成藥配方中常用中藥10味,其中白芍排在第四位。《本草正義》記載“補血,益肝脾真陰,而收攝脾氣之散亂,肝氣之恣橫,則白芍也”“故益陰養血,滋潤肝脾,皆用白芍”,說明白芍正是治療痛經的首選中藥。白芍藥效的發揮與其質量密切相關,現行白芍質控指標主要定位在芍藥苷,指標單一,且與有效性和安全性關聯性差,無法有效控制白芍質量[3]。因此本研究擬采用UPLC-Q-TOF-MS對白芍中的化學成分進行系統表征,聯合網絡藥理學方法和質量標志物的理論,對白芍的質量標志物進行預測。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

SOIENTZ-18N型冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司);Triple TOFTM5600質譜儀(美國AB SCIEX公司);ExionLCTM型超高效液相色譜儀(美國AB SCIEX公司);Analsyt TF 1.6軟件(美國AB SCIEX公司);CPA225D型電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司);白芍飲片購自河北荷花池藥業有限公司(批號:C2232012004),經承德醫學院蘇占輝教授鑒定為毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根;屈臣氏飲用水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司);甲酸(賽默飛世爾科技(中國)有限公司);乙腈(美國Fisher公司);甲醇(德國Merck公司)。

1.2 供試品的制備

取白芍飲片粉末0.1 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇5 mL,稱定重量,超聲處理(800 W,40 kHZ)30分鐘,放冷,再稱定重量,用50%甲醇補足重量,13000 r/min 4℃離心10分鐘,取上清液過0.22 μm有機濾膜,即為供試品溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC?HSS T3 (2.1×100 mm, 1.8 μm );流動相A為0.1%甲酸水,流動相B為0.1%甲酸乙腈,梯度洗脫見表1;進樣量3 μL;柱溫:30 ℃。

表1 色譜條件

1.4 質譜條件

離子源為ESI源,采用正負離子化模式檢測:正負離子模式噴霧電壓為5.5 kV/-4.5 kV,裂解電壓為100 V/-100 V,碰撞能35 eV/-35 eV,霧化氣55 psi,輔助氣55 psi,氣簾氣35 psi。數據采用一級和二級結合的掃描模式(MS/MS2),質量范圍均為m/z50～1200,裂解電壓100 V/-100 V,離子源溫度為550 ℃,儀器每隔2小時校正一次質量軸。

1.5 化學成分鑒定

使用MarkerView軟件將質譜原始導入。進行保留時間矯正、峰識別、峰提取、峰積分、峰對齊等工作,同時創建復方中相應中藥代謝庫,利用標準品二級質譜數據庫(HMDB、Massbank等)、參考文獻及相應裂解規律匹配法對含有MSMS數據的峰進行物質鑒定。

1.6 網絡藥理學分析

1.6.1 白芍成分作用靶點預測 將鑒定得到的化合物根據OB≥20%或者DL≥0.1篩選出活性成分。在TCMSP中搜索成分,得到對應的相關靶點。未在TCMSP數據庫記錄靶點的化合物,通過PubChem搜索得到SMILE號,使用SMILE號在Swiss Target Prediction預測相關靶點。

1.6.2 疾病靶點篩選 在Therapeuic Tarrget Database數據庫與Comparative Toxicogenomics Database數據庫中搜索“primary dysmenorrhea”,將得到的疾病靶點取并集,作為疾病靶點。

1.6.3 蛋白相互作用網絡構建 將交集靶點導入String數據庫中,進行蛋白—蛋白相互作用網絡分析,并導出數據。將數據導入Cytoscape 3.9.1軟件,獲得PPI網絡圖,計算節點連接數degree,篩選出大于雙倍平均值作為核心靶點。

1.6.4 GO和KEGG通路富集 將核心靶點導入DAVID數據庫,進行白芍治療原發性痛經的基因本體論(gene ontology,GO)與KEGG通路富集分析。篩選條件為FDR≤0.01和P-Value≤0.05。將數據按照counts降序排序,分子功能(molecular function,MF)、生物過程(biological process,BP)、細胞組分(cell components,CC)分別取前10,KEGG通路取前20,作為分析對象,并進行可視化繪圖。

1.6.5 候選質量標志物與核心靶點分子對接分析 利用Cytoscape在“成分—靶點—疾病網絡圖”中選擇Degree值高的活性成分作為候選質量標志物,與核心靶點進行分析對接。從PubChem數據庫中下載候選質量標志物小分子SDF格式文件,使用Chem3D軟件將SDF文件轉化為mol文件。從PDB數據庫獲得核心靶點的蛋白結構。運用AutoDockTools1.5.6軟件對蛋白結構進行優化,找到蛋白活性口袋。使用AutoDock Vina和Python腳本進行分子對接,得到結果數據。在Protein-Ligand Interaction Profiler網站進行驗證。然后使用PyMOL對小分子和蛋白結合模式進行可視化,并分析關鍵結合位點。

2 結果

2.1 基于UPLC-QTOF-MS/MS的白芍化學成分識別

共鑒定得到64種化合物(表2和表3),在PeakView軟件中導出基峰色譜圖(如圖1,圖2),將64個化合物標在相應位置上。這些化合物主要包括有機酸類、單萜苷類、黃酮類化合物等。有機酸類化合物有檸檬酸、丹皮酚等。單萜類化合物主要有芍藥內酯苷、牡丹皮苷F、羥基芍藥苷、芍藥苷亞硫酸酯等。黃酮類有柚皮素、兒茶素、表兒茶素,鞣質有沒食子酸、沒食子酸乙酯等。以芍藥內酯苷為例進行成分表征闡述,如圖2,二級質譜有m/z77.0387、m/z121.0284、m/z283.0817、m/z479.1542四個峰。根據參考文獻推斷,m/z479.1542為[M-H]-準分子離子峰,特征離子峰m/z283為[M-H-CO2-C7H5O2]-,其中CO2為內酯環斷裂失去酯基,m/z121.0287是分子源內裂解形成的苯甲酸負離子。

圖1 在正負離子模式下采集白芍飲片的基峰色譜圖

圖2 在負離子模式下推斷的芍藥內酯苷二級裂解機制

表2 負離子模式下鑒定白芍飲片的化學成分信息

表3 正離子模式下鑒定的白芍化學成分信息

2.2 活性成分靶點與疾病靶點預測

篩選得到活性成分36個,在TCMSP與Swiss Target Prediction數據庫檢索到對應的靶點697個。Therapeuic Tarrget Database與Comparative Toxicogenomics Database數據庫搜索到疾病靶點1693個。共有靶點去除重復后結果表明,36個有效成分與原發性痛經有共同靶基因76 個。將白芍活性成分、原發性痛經及其共同靶點導入Cytoscape進行可視化得到成分—靶點—疾病網絡圖(圖3)。結果表明,同一個化合物分子可以對應多個靶標,一個靶標基因亦對應多個化合物,體現了白芍多成分、多靶點和多通路的作用機制。

2.3 蛋白相互作用網絡構建

利用String數據庫獲得各個核心靶點的Degree值,并進行排序,篩選得到核心靶點10個(圖4),包括腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、白細胞介素6(interleukin 6,IL-6)、雌激素受體1(estrogen receptor1,ESR1)、前列腺素內過氧化物酶合酶2(prostaglandin-endoperoxidase synthase 2,PTGS2)、Bcl-2樣蛋白1(Bcl-2-like protein 1,BCL2L1)、熱休克蛋白90α(heat shock protein HSP 90-alpha,HSP90AA1)、基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP9)、信號傳導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARG)、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)使用Cytoscape將蛋白互作網絡進行可視化(圖5)。

圖4 基于String數據庫獲得的核心靶點Degree排序條狀圖

圖5 基于Cytoscape軟件繪制76個核心蛋白靶點互作網絡和Degree熱圖

2.4 GO分類富集分析

將蛋白靶點互作網絡中的76靶點蛋白靶點導入DAVID數據庫,導出通路分析結果,篩選FDR≤0.01,且PValue≤0.05的通路,得到BP 55條,CC 16條,MF 19條。根據Counts值分別取前10條進行GO分析(圖6)。

圖6 基于76個核心靶點富集的排名前10的GO富集分析氣泡圖

2.5 KEGG通路分析

在DAVID數據庫導出結果中,按照counts進行排序,篩選FDR≤0.01,且PValue≤0.05的通路,選取前20條進行分析,結果如圖7。包括15條通路與人類疾病相關,有癌癥通路、心血管疾病、神經變性疾病、病毒性傳染病、細菌性傳染病、內分泌和代謝性疾病相同通路;4條為環境信息處理類,參與信號轉導,包括磷脂酰肌醇三羥基激酶—蘇氨酸激酶(phosphoInositide-3 kinase-protein kinase B,PI3K/Akt)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、低氧誘導因子1(hypoxia induced factor 1,HIF-1)的信號通路;1條為免疫系統相關,是白細胞介素17(interleukin 17,IL-17)信號通路。

圖7 基于76個核心靶點富集的排名前20的KEGG通路氣泡圖

2.6 分子對接

選擇6個核心靶點蛋白BCL2L1、HSP90AA1、MMP9、STAT3、PPARG、VEGFA與對應的4個活性成分(柚皮素、牡丹皮苷I、芍藥內酯苷、芍藥內酯C)進行分子對接。一般認為結合能<-5 kcal/mol的對接結果較為理想,對接結果均滿足要求,結合位點視圖如圖7。小分子多用非共價鍵相互作用與蛋白連接,包括氫鍵、離子鍵與π-π堆積作用。如牡丹皮苷I與HSP90AA1的分子對接(圖8 K),有平行π-π堆積作用(PHE-138)、垂直的π-π堆積作用(TRP-162)以及5個氫鍵連接位點(ASN-51、ASN-51、ASP-54、LYS-58、GLY-135)和疏水相互作用(VAL-150)。芍藥內酯苷通過離子鍵(ARG-143)與MMP9的連接(圖8B)。

注:A 柚皮素-BCL2L1;B 牡丹皮苷I-HSP90AA1;C 芍藥內酯苷-HSP90AA1;D 牡丹皮苷I-MMP9;E 芍藥內酯苷-MMP9;F 芍藥內酯C-MMP9;G 芍藥內酯C-STAT3;H 柚皮素-PPARG;I 柚皮素-VEGFA;J 牡丹皮苷I-VEGFA;K 芍藥內酯苷-VEGFA圖8 活性成分與核心靶點分子對接結合能<-5 kcal/mol的各個對接可視化圖

3 討論

本實驗聯合UPLC-Q-TOF-MS與網絡藥理學技術對白芍治療原發性痛經的質量標志物進行探究。首先利用液質聯用技術共鑒定出62種化學成分,篩選出活性成分36個。在“白芍—成分—靶點—疾病”網路圖中,篩選出高degree值作為關鍵成分,包括芍藥內酯苷、牡丹皮苷I、柚皮素和芍藥內酯C。Liu等[4]發現芍藥內酯苷對神經病理性疼痛大鼠具有鎮痛作用,其機制可能與調控中樞核苷酸結合寡聚結構域,富含亮氨酸重復序列和含1個Pyrin結構域(nucleotide- binding oligomerization domain, leucine- rich repeat and pyrin domain- containing 1,NLRP1)和核苷酸結合寡聚結構域,富含亮氨酸重復序列和含Pyrin結構域3(nucleotide- binding oligomerization domain, leucine- rich repeat and pyrin domain- containing 1,NLRP1)炎癥小體活性以及抑制脊髓膠質細胞激活降低白細胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)水平有關。柚皮素來源豐富,藥理作用廣泛。Arora等[5]研究柚皮素對慢性睡眠剝奪誘導的小鼠機械和熱痛覺過敏的影響,發現柚皮素對抗痛覺過敏反應的同時降低氧化應激和炎癥因子的表達水平。Kim等[6]發現芍藥甘草湯中治療神經性疼痛的有效成分包括芍藥內酯C、丹皮酚和苯甲酸等,其發揮作用的機制與調節亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝和花生四烯酸代謝等途徑有關。牡丹皮苷I目前尚無藥理學研究和報道,但從本實驗可以看出與核心靶點親合力強。從以上文獻調研可以看出芍藥內酯苷、牡丹皮苷I、柚皮素和芍藥內酯C對原發性痛經具有潛在的止痛效應。

通過蛋白互作網絡分析獲得6個核心靶點,包括BCL2L1、HSP90AA1、MMP9、PPARG、STAT3、VEGFA。將這些核心靶點進行KEGG通路富集分析,涉及PI3K-Akt、MAPK、TNF、HIF-1、IL-17等信號通路。IL-17和TNF信號通路被認為是炎癥反應的關鍵通路,在類風濕關節炎動物模型中發現關節內注射IL-17可增加TNF-α、IL-1β的表達,誘導痛覺反應發生[7]。MMP9參與IL-17與TNF信號通路的調節,推測白芍可能通過調節體炎癥因子的表達,抑制炎癥反應,從而起到緩解痛經的作用。PI3K/Akt信號通路是調節細胞增殖和凋亡的重要通路,該通路中的PI3K、Akt以磷酸化的形式發生激活后能夠對凋亡調節因子BAX(apoptosis regulator BAX,Bax)、Bcl-2相關細胞死亡激動劑(Bcl-2 associated agonist of cell death,Bad)等促凋亡基因的表達產生抑制作用而促進Bcl-2等相關抗凋亡基因的表達。而當缺血缺氧、缺血再灌注等病理因素作用于細胞時,PI3K/Akt通路受到抑制并使其抗凋亡作用減弱。Pi等[8]研究發現在小鼠心臟手術期間,異氟醚通過PI3K/Akt信號通路減輕疼痛并抑制小鼠心肌細胞凋亡,提示激活PI3K/Akt信號通路,可能緩解疼痛。也有研究顯示單神經病理性疼痛的早期發展階段MAPK信號通路發揮重要作用,一旦被激活會介導TNF-α引發痛覺效應[9]。有報道激活HIF-1信號通路可減少神經病理性疼痛中的機械性痛覺反應行為,其通路上的關鍵靶點VEGFA,可特異性地作用于內皮細胞,誘導內皮細胞生長,促進細胞遷移和抑制細胞凋亡[10]。實驗研究發現原發性痛經患者子宮內膜VEGFA的表達顯著高于正常女性子宮內膜的表達[11],說明我們篩選出的靶點的可信度較高。STAT3是一種轉錄激活因子,STAT3能與HIF-1α結合促進炎癥因子的釋放,研究發現STAT3的激活有效減輕大鼠神經病理性疼痛和炎癥反應[12]。HSP90AA1屬于HSP家族的HSP90亞家族,是最重要的熱休克蛋白之一,在免疫和炎癥中發揮重要作用。PPARG是一種配體依賴的核轉錄因子,可通過調節IL-17和TNF信號通路參與免疫炎癥反應調控機體的生理和病理過程[13]。將6個核心靶點與其對應的4個活性成分進行分子對接。我們發現對接結果均符合結合能<-5 kal/mol,可認為親和力較強。

質量標志物需要滿足復方配伍、質量傳遞與溯源、特有性、有效性、可測性的五原則。芍藥內酯苷是芍藥屬植物主要的單萜類,就目前所知僅分布于芍藥屬植物,因此是芍藥屬特征性化學成分。芍藥內酯C是來自芍藥的薄荷烷類似物,也屬于白芍特有成分,滿足特有性原則。曾潔等[14]利用高效液相色譜—質譜聯用方法建立測定大鼠血漿中芍藥內酯苷含量的分析方法,發現芍藥內酯苷在大鼠體內能夠被迅速吸收。另有中藥復方的藥動學研究發現,白芍與當歸配伍可以顯著增加芍藥內酯苷的達峰時間以及末端消除半衰期,延長其在體內的滯留時間[15],證明芍藥內酯苷能有效傳遞至血液中,滿足傳遞性原則。而牡丹皮苷I和柚皮素來源豐富,特有性較差,不適合作為質量標志物。結合芍藥內酯苷、芍藥內酯C的化學結構分析可知有紫外吸收,推測其可用于定性定量分析。綜上所述,我們認為芍藥內酯苷、芍藥內酯C可作為白芍的質量標志物。

本項目以辨識白芍治療原發性痛經的定向藥效質量標志物為主要研究目標,綜合采用UPLC-Q-TOF-MS和網絡藥理學技術探究白芍化學物質基礎及其作用機制,鎖定白芍治療原發性痛經定向功效的質量標志物,包括芍藥內酯C、芍藥內酯苷,為基于定向功效的白芍質量有效性評價提供科學依據。