口腔鱗狀細胞癌中TRPV2的表達及其臨床病理意義

王亞 張林杰 仵楠 徐江 代海濤

1石河子大學醫學院（新疆石河子 832000）；2石河子大學第一附屬醫院口腔科（新疆石河子 832000）

在全球范圍內，癌癥仍是引起死亡的主要病因。國際癌癥研究機構2020年統計，口腔癌每年約有37萬新發病例和17萬例死亡病例，較2018年統計呈上升趨勢［1］，口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是其中最常見的亞型。（transient receptor potential vanilloid type-2，TRPV2）是瞬時受體感受器電位香草素家族第二位成員，是鈣滲透性陽離子通道，可被熱（> 52℃）、各種配體和機械應力激活［2］。TRPV2 廣泛表達，已被證實在不同類型的癌癥中發揮重要作用，參與癌細胞的凋亡、增殖和轉移等［3］。另外TRPV2 可被大麻素等抗腫瘤藥物激活，進而發揮抑癌作用［4-5］。其家族成員TRPV4 已被證明在口腔牙齦瘤及OSCC 中高表達且與預后不佳相關［6-7］，但是分布最為廣泛的成員TRPV2 目前在OSCC 中的表達及所發揮的作用尚不明確。因此，本實驗使用免疫組織化學及Western blot 實驗探索了TRPV2 在OSCC 中的表達水平，并探討了其與OSCC 患者臨床病理特征及預后的關系。最后，還進行了GSEA 及GO 富集分析及免疫浸潤分析，以進一步了解TRPV2 在OSCC發病機制中的生物學作用，以期為后期臨床應用提供可靠的理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2012-2020 年間在石河子大學第一附屬醫院確診為OSCC 的石蠟包埋組織標本129 例，另外選取配對癌旁組織50 例，依據AJCC 分期第8 版劃定TNM 分期，倫理審批號：KJX-2021-002-01。隨訪時間從手術日起，截止到2022年11月31日或死亡日期。OSCC細胞系（Cal-27、Scc-15）來自美國典型培養物保藏中心（ATCC），正常口腔角質細胞（HOK）來自北納生物。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化采用EnVision 兩步法檢測OSCC中TRPV2、巨噬細胞蛋白CD68 表達水平。由2 名中級以上職稱病理醫師采用雙盲法進行評定，TRPV2、CD68 定位于細胞膜和（或）細胞漿中。細胞染色程度（未著色=0，淺黃色=1，黃色=2，棕黃色=3），陽性細胞百分率（0%～5%=0，6%～25%=1，26%～50%=2，51%～75%=3，76%～100%=4）。根據細胞染色程度和陽性細胞百分率得分乘積計為總分：≤ 4 分標記低表達組，> 4 分標記高表達組。

1.2.2 Western blot 檢測將細胞在RIPA 裂解緩沖液中裂解，提取細胞總蛋白。通過SDS?PAGE 電泳將總蛋白進行分離后轉移到PVDF 膜上。抗體封閉液封閉30 min，TRPV2 抗體（1/500）4 ℃過夜孵育，室溫下二抗孵育2 h。使用ECL化學發光系統進行顯影，于暗室中暴露于X 射線膠片。使用Image J 軟件測蛋白灰度值。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參灰度值。

1.2.3 生物信息學方法使用R（4.2.1）采用DE?Seq2 R 包從TCGA 數據庫中獲取320 例OSCC 中TRPV2 的差異表達基因用于功能富集分析。使用GEOquery［2.64.2］從GEO 數據庫中下載共264 例OSCC 芯片表達數據（GSE30784、GSE41613，平臺GPL570），將樣本以TRPV2表達中位數分為高低表達組，使用limma［3.52.2］進行差異分析獲取差異基因，使用ClusteProfiler［4.4.4］包實施GO 功能分析及GSEA通路富集分析。GSEA選擇MSigDB 集合中的 c2.cp.all.v2022.1.Hs.symbols.gmt 作為參考基因集合。對TCGA 中OSCC 數據，使用GSVA R包（4.2.1）的ssGSEA 算法將TRPV2 與24 種免疫細胞進行免疫浸潤相關性分析。

1.3 統計學方法對所有數據使用R（4.2.1）及Graphpad prism 8 進行統計學分析，采用Mann-WhitneyU檢驗來分析非配對樣本之間的表達水平差異。使用Pearson χ2檢驗分析TRPV2 表達與OSCC 臨床病理特征及免疫細胞浸潤之間的關聯。經Log-rank 檢驗分析TRPV2 表達OSCC 患者術后總生存時間之間的關系，并構建Kaplan Meier 生存曲線。以P< 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TRPV2表達情況免疫組化檢測TRPV2主要在胞質及細胞膜中顯色，OSCC 組織中TRPV2 的陽性表達率為81.4%（105/129），癌旁組織中為32.0%（16/50）（圖1A-B），差異有統計學意義（P< 0.001）。Western bolt 實驗發現在OSCC 細胞系Scc-15、Cal-27 中TRPV2 表達顯著高于口腔正常角化上皮細胞HOK，差異有統計學意義（P< 0.05，圖1C-D）。

圖1 TRPV2 在口腔鱗狀細胞癌中的表達Fig.1 Expression of TRPV2 in oral squamous cell carcinoma

2.2 TRPV2 表達與OSCC 臨床病理參數的關系結果表明TRPV2 蛋白表達與OSCC 患者的性別、年齡、頸部淋巴結轉移以及臨床分期TNM 以之間沒有明顯相關性（均P> 0.05），但與病理學分級（P=0.031，χ2=4.636）及腫瘤直徑范圍T 分期（P=0.024，χ2=5.109）有著密切關聯。見表1。

表1 TRPV2 蛋白表達與臨床病理參數的相關性Tab.1 Correlation of TRPV2 protein expression with clini?copathological parameters 例（%）

2.3 TRPV2高表達與預后不良結局相關在129例OSCC 患者中獲得118 例完整的預后隨訪信息。Log-rank 生存分析比較OSCC 中TRPV2 表達與患者預后的關系，結果顯示TRPV2 高表達OSCC 者生存時間較低表達組顯著縮短，TRPV2 高表達OSCC患者預后不佳（P=0.015，HR=2.697，圖2）。

圖2 TRPV2 蛋白表達與OSCC 患者預后的關聯Fig.2 Association of TRPV2 protein expression with the prognosis of OSCC patients

2.4 GO 及GSEA 信號通路分析GSEA 通路富集發現TRPV2 在OSCC 中主要參與細胞因子與細胞因子受體相互作用、PI3K/AKT、橫紋肌收縮途徑、Sarscov 2 參與的免疫反應、同種異體移植排斥反應等通路（圖3A、3B），GO 富集分析主要在白細胞介導的免疫、T 細胞參與的免疫反應、淋巴細胞參與的免疫反應、質膜外側及免疫受體活性等（圖3C、3D）。

圖3 OSCC 中TRPV2 富集分析Fig.3 TRPV2 enrichment analysis in OSCC

2.5 TRPV2 表達與免疫細胞浸潤的相關性GO及GSEA 富集分析發現TRPV2 與免疫反應具有密切相關性，所以基于TCGA 數據庫研究了OSCC 中TRPV2 表達與免疫細胞浸潤的關系。結果顯示，TRPV2 的表達與巨噬細胞、樹突狀細胞、輔助型T細胞1、T 細胞、調節性T 細胞這5 種免疫調節細胞的浸潤水平呈強正相關（R> 0.6，P< 0.001，圖4A）。進一步探索OSCC 中TRPV2 表達對免疫細胞浸潤的影響，將TRPV2 mRNA 依據中位數分為高、低表達組，以探究免疫細胞浸潤水平的表達差異。結果發現，上述5 種具有強相關的免疫細胞的浸潤水平具有顯著性差異（圖4B）。結果還表明，TRPV2 表達與NK CD56 bright cells、效應記憶T 細胞、Tgd 這三種細胞不相關。

圖4 TRPV2 的表達與24 種免疫細胞浸潤的關系Fig.4 Relationship between TRPV2 expression and the infiltration of 24 immune cells

圖5 TRPV2 及CD68 的表達Fig.5 TRPV2 and CD68 expression

2.6 TRPV2與巨噬細胞免疫浸潤的關系通過對90 例同一OSCC 組織進行免疫組化驗證，結果提示TRPV2 高表達伴隨高的巨噬細胞蛋白CD68 浸潤表達水平，差異分析具有統計學意義（R=0.562，P< 0.001）。

3 討論

目前研究發現TRPV2 可以作為大麻二酚等抗腫瘤藥物的作用靶點，而且在順鉑藥物治療方面發揮重要作用，可以作為順鉑耐藥性的潛在靶標。據報道，大麻二酚可以通過調控TRPV2 對子宮內膜癌［8］，肺癌［9］、乳腺癌［10］、膠質母細胞瘤［11］等發揮抑癌作用。此外，子宮內膜癌中TRPV2 高表達且增加對順鉑的化學敏感性［8］，在非小細胞肺癌中TRPV2 高表達可以降低順鉑耐藥性［9］，但在胃癌TRPV2 高表達可以加強胃癌細胞對順鉑的耐藥性且其表達與順鉑敏感性呈負相關［12］?；谀壳暗难芯?，將TRPV2 列入了重要的抗腫瘤藥物靶點，發現TRPV2 可以作為OSCC 個性化治療靶點的良好候選者。

本研究從細胞及組織學水平分別證實TRPV2在OSCC 中較鄰近正常組織中顯著高表達，與目前研究發現一致。TRPV2 蛋白在各種類型的癌癥中高度表達，包括：胃癌［12］、子宮內膜癌［8］、非小細胞肺癌［9］、乳腺癌［10］、食管鱗狀細胞癌［13］。這些結果表明，TRPV2 有可能成為OSCC 的診斷標志物。此外，我們還發現TRPV2 與OSCC T 分期及組織學分級具有相關性，進一步支持TRPV2 的表達可能與OSCC 的惡性程度有關。MARINELLI 等［8］證實子宮內膜癌中TRPV2 的表達隨著腫瘤組織的惡性程度而增加，GUéGUINOU 等［14］證實RPV2 在乳腺癌中高表達且與腫瘤組織學分級關，與G0-1 組織相比，TRPV2 在G2-3 乳腺癌組織相中高表達。這與本研究具有一致性，TRPV2 在多數腫瘤中與腫瘤組織學分級具有相關性。

目前研究表明，TRPV2 高表達是各種腫瘤的不良預后生物標志物，所以實驗進一步分析TRPV2表達與OSCC 預后的關系，在112 例隨訪的OSCC患者中發現，TRPV2 高表達患者的生存期顯著縮短，預后不佳。另有多項研究都表明TRPV2 與預后密切相關，包括在子宮內膜癌，肺癌、乳腺癌、膠質母細胞瘤、消化系統腫瘤、血液腫瘤［8-15］等都發現TRPV2 高表達患者預后不佳。這與本研究結果相同，證明了TRPV2 是OSCC 中具有預后價值的新型生物標志物。

TRPV2 作為調節Ca2+通道的因子，在導致腫瘤發展的各種生物學功能如遷移、侵襲及增殖凋亡方面發揮重要作用。但目前尚無研究發現TRPV2在OSCC 中所具體發揮的作用機制，所以本實驗使用生物信息學方法探索TRPV2 在OSCC 中的作用機制。富集分析發現TRPV2 在OSCC 主要參與PI3K/AKT、橫紋肌收縮途徑、SARS?Cov?2 免疫反應、同種異體移植排斥反應、細胞因子和細胞因子受體相互作用等通路。目前實驗研究發現，TRPV2可通過PI3K/AKT/途徑促進食管鱗癌的腫瘤形成和轉移及乳腺癌的遷移［13-14］。另外，在IWATA等［16］的研究中通過產生中和TRPV2 的功能抗體，可以改善擴張型心肌病和肌肉萎縮癥，這也進一步說明了TRPV2 可能參與心臟橫紋肌的收縮。這與我們的研究相一致，但是TRPV2 是否參與其余通路目前尚沒有明確的研究，后期有望通過實驗進一步證實。

目前已知可通過樹突狀細胞疫苗等免疫治療方法治療口腔鱗狀細胞癌［17］。通過生物信息學技術發現在OSCC 中TRPV2 與免疫反應密切相關，包括白細胞介導的免疫、T 細胞參與的免疫反應、淋巴細胞參與的免疫反應、質膜外側及免疫受體活性等?；谀壳把芯堪l現，TRPV2 發揮免疫作用主要與其傳導Ca2+相關，其C 端具有一個鈣調蛋白結合位點（654-683），可進行細胞內外Ca2+的轉運，而Ca2+參與免疫系統的激活和維持［18］，進而發揮免疫作用。由于腫瘤微環境中不同免疫細胞發揮的作用不同，所以本實驗基于TCGA 數據庫分析了OSCC 中TRPV2 表達與24 種免疫細胞浸潤的關系。發現TRPV2 的表達與巨噬細胞、樹突狀細胞及輔助型T 細胞1、T 細胞、調節性T 細胞、漿細胞樣樹突狀細胞等免疫調節細胞的浸潤水平呈強正相關。此外，將TRPV2 表達分為高、低表達時上述免疫細胞的浸潤水平具有顯著差異。通過免疫組化證明在OSCC 中TRPV2 高表達時伴隨巨噬細胞浸潤蛋白CD68 高表達，且目前研究發現TRPV2在巨噬細胞中呈密集陽性表達，參與調節巨噬細胞結合及吞噬功能［19］。另外，在抗原呈遞過程中發現TRPV2 以協調Ca2+信號在T 細胞活化、增殖發揮效應［20］，同時已證明TRPV2 在和B 淋巴細胞、樹突狀細胞中均過表達［21-22］。上述研究結果與本研究分析結果具有高度一致性，所以TRPV2 可以通過影響巨噬細胞等免疫細胞浸潤水平進而調控OSCC 的發生發展，但腫瘤免疫微環境的調控具有高度復雜性，其他類型免疫細胞也可能影響腫瘤細胞的發生發展。

本研究為TRPV2 在OSCC 中的所發揮的作用機制提供了全面的認識，但仍有一定的局限性：與臨床病理及巨噬細胞的相關性研究中樣本量相對不足，隨訪時間較短等，造成實驗可能存在一定的誤差，后期尚需擴大樣本量及長期隨訪便于實驗數據更加精確。對于通路富集分析及與免疫浸潤的相關性研究，是基于公共數據庫進行的分析，存在一定的不足，后期會進一步通過實驗驗證。下一步研究方向是明確TRPV2 是否通過PI3/AKT通路參與調控OSCC 的表型表達等，及通過干擾TRPV2 明確其是否通過影響巨噬細胞的浸潤水平進而調控OSCC。

綜上，本研究發現TRPV2 在OSCC 中高表達，與腫瘤病理分級、T 分期具有相關性，且TRPV2高表達患者常常預后不佳。功能富集分析發現，TRPV2 可通過PI3K/AKT 等通路參與調控OSCC 進展，另外，TRPV2 通過影響腫瘤微環境中巨噬細胞等免疫細胞的浸潤水平參與免疫反應。本研究為闡明TRPV2 在腫瘤發生發展機制中的潛在作用提供了前期研究基礎，考慮到TRPV2 可以被大麻二酚等抗腫瘤藥物作用進而發揮抑癌作用，而且TRPV2 表達與免疫反應密切相關，使用TRPV2 進行口腔鱗狀細胞癌靶向治療可能是一種新的研究方向。