布洛芬對缺血性腦中風大鼠的神經保護作用及對Nrf2/SLC7A11/GPX4信號通路的影響

何俊榮 劉仔 陳錫培

廣州中醫藥大學東莞醫院（廣東東莞 523000）

中風是全球死亡率和殘疾的重要引發因素，每年有1 030 萬人群出現中風病例，具有“四高一多”特點［1-2］，目前溶栓治療是缺血性腦卒中（isch?emic stroke，IS）最有效的治療方法，但僅少數患者可在腦卒中發病后4～6 h 內接受有效的溶栓治療。因此探索IS 的發病機制對于制定有效的治療策略至關重要［3］。布洛芬是一種非甾體抗炎藥，目前已被證明可改善認知功能障礙和神經炎癥［4］，但其對治療IS 鮮有報道。鐵死亡是一種依賴鐵的細胞死亡形式，與多種病理狀況有關，包括創傷性腦損傷、神經退行性疾病和中風［35］。核因子E2 相關因子2（nucler factor erythroid related factor 2，Nrf2）是控制細胞氧化還原穩態和炎癥的關鍵轉錄因子，Nrf2 作為轉錄因子可增加非糖基化的xCT（SLC7A11）和谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）的表達，激活Nrf2 信號還可以通過對抗鐵死亡保護細胞［6］。研究［7］顯示，布洛芬可通過調節Nrf2 信號通路誘導膠質母細胞瘤細胞的鐵死亡，是一種潛在的膠質瘤治療藥物，提示布洛芬與Nrf2 介導的鐵死亡具有一定的聯系，但布洛芬能否通過Nrf2/SLC7A11/GPX4 信號通路對IS 發揮保護作用目前并無報道。因此本研究通過大腦中動脈梗死模型復制IS 大鼠，旨在探討布洛芬對IS 大鼠神經保護的影響及相關作用機制，為IS 治療提供潛在治療方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物60 只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（體質量220～260 g，6～7 周齡）購自完美（廣東）日用品有限公司，許可證號：SYXK（粵）2022-0288。所有大鼠置于標準鼠籠（每個籠子少于5 只動物）中，溫度設定（22±1）°C，光照/黑暗周期為12 h，濕度為60%～70%。大鼠隨意獲取食物和水，根據《實驗動物護理和使用指南》進行。

1.1.2 實驗藥品與試劑上海吉至生化科技有限公司提供布洛芬（純度99.0%，CAS：15687-27-1，1 g）；美國Med-ChemExpress 公司提供Nrf2 抑制劑-ML385（純度99.55%，編號：S8790，25 mg）；天津科密歐化學試劑有限公司提供2，3，5-三苯四唑氯化物（TTC）；北京索萊寶科技有限公司提供蘇木精-伊紅染色液（HE）、RIPA 高效蛋白裂解液；浙江奧的特生物技術有限公司鐵離子試劑盒；Abcam公司提供Nrf2、SLC7A1、GPX4 一抗。

1.2 方法

1.2.1 IS 大鼠模型的制備及干預將適應性喂養1周的大鼠分為造模組（48只）及假手術組（12只），造模組大鼠參考文獻［8］制備IS 大鼠模型。首先將大鼠麻醉，將右側頸總動脈（CCA）和頸外動脈小心暴露并從周圍組織分離，將一根直徑為0.26 mm的尼龍絲經右側頸總動脈插入（約20 mm）到右側頸內動脈，阻斷大腦中動脈血流。缺血60 min 后，小心拉出尼龍絲開始再灌注24 h，假手術操作同上，但僅分離動脈，不進行缺血再灌注操作。IS 大鼠模型的選取標準為［9］：（1）大鼠蘇醒后出現左側旋轉；（2）參考Zea-Longa 評分對大鼠進行神經功能評分［10］，評分為1-3 分的大鼠進行后續實驗。造模過程中48 只大鼠均無死亡且符合IS 造模標準。

造模組大鼠隨機分為假手術組IS 組、治療組、抑制劑組、治療+抑制劑組。其中假手術組及IS 組給予生理鹽水干預；治療組以腹腔注射30 mg/kg布洛芬（1 mL/kg 的布洛芬藥液為30 mg/kg）干預；抑制劑組以腹腔注30 mg/kg ML385 干預（1 mL/kg的ML385 為30 mg/kg）；治療+抑制劑組同時給予腹腔注射30 mg/kg 布洛芬、30 m/kg ML385 干預；每天干預1 次，連續干預1 周。

1.2.2 神經功能評分給藥結束后，參考Zea-Longa評分對各組大鼠進行神經功能評分，評分越高，表明大鼠神經功能受損越嚴重。

1.2.3 TTC 檢測大鼠腦梗死率各組隨機選取3 只大鼠，麻醉大鼠并快速斷頭取腦，在-20 ℃下快速冷凍30 min，將大腦從額極到枕極切成2 mm厚的冠狀切片，然后加入2% TTC 溶液在37 ℃下避光染色20 min，然后在4%多聚甲醛中固定2 h以上，正常組織為紅色，而梗塞組織呈白色。通過Image J 軟件分析梗塞區域，計算梗死率［（缺血對側半球體積-缺血側非梗死體積）/缺血對側半球體積×100%］。

1.2.4 腦水腫含量測定各組隨機選取3 只大鼠，取出大腦，制備5 mm 厚冠狀腦切片，電子天平稱取重量，記為腦濕重，然后在真空烘箱中100 ℃下干燥48 h 并重新稱重，記為腦干重，計算腦水腫含量［（腦濕重-腦干重）/腦濕重×100%］。

1.2.5 樣本采集各組剩余6 只大鼠經麻醉后，開顱取腦，快速取出缺血半暗帶區域腦組織，一式2 份，一份經4%多聚甲醛固定，用于HE 染色；另一份保存在-80 ℃冰箱中用于試劑盒檢驗及qRTPCR、Western blot 檢測。

1.2.6 HE檢測大鼠腦組織神經元形態學變化取出1.2.5 中經4%多聚甲醛固定的腦組織，經脫水，石蠟包埋后，制備厚度為4 μm 切片，經HE 染色后，在光學顯微鏡觀察腦組織中神經元形態學變化。

1.2.7 試劑盒檢測大鼠腦組織中鐵離子含量變化取出1.2.5 中部分腦組織0.25 g 制作組織勻漿，離心取上清，按照鐵離子試劑盒說明書操作，進行檢測腦組織中鐵離子含量。

1.2.8 qRT?PCR 檢測腦組織中SLC7A11、GPX4 mRNA 表達水平使用TRIzol 試劑從組織提取RNA，將RNA 以逆轉錄盒逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板，以Applied Biosystems 7900 實時PCR 系統上進行RT-qPCR，引物序列為GPX4，上游引物5′-AAGGACCTGCCCCACTATTTC-3′，下游引物5′-ACGCTGGATTTTCGGGGTCT-3′；SLC7A1，上游引物5′-GGTACTGCAATCACAATGCCAGA-3′，下游引物5′-GCACATGCATCAAGAGTTTCCATAA-3′；βactin，上游引物5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游引物5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′，2-ΔΔCt方法計算基因表達。

1.2.9 Western blot 檢測腦組織中Nrf2/SLC7A11/GPX4 信號通路相關蛋白表達使用RIPA 裂解緩沖液從剩余腦組織中提取蛋白質，分離并轉膜上，封閉之后將膜與Nrf2、SLC7A1、GPX4 一抗在4 ℃下孵育過夜。第2 天，將膜與二抗在室溫下孵育1 h。使用ECL 檢測試劑顯色條帶，Image J 軟件用于分析蛋白條帶，其中β-actin 作為內參。

1.3 統計學方法采用SPSS 27.0統計軟件分析實驗數據，P< 0.05時，認為差異有統計學意義。計量資料以均數±標準差表示；單因素方差分析用于多組間比較，以SNK?q檢驗進一步兩兩比較。

2 結果

2.1 布洛芬對各組大鼠神經功能評分、腦梗死率、腦水腫及鐵離子含量的影響神經功能評分、腦梗死率、腦水腫、鐵離子含量比較：IS 組較假手術組、抑制劑組較IS 組、治療+抑制劑組較治療組增加，但治療組較IS 組、治療+抑制劑組較抑制劑組降低（P< 0.05）。見表1。

表1 各組大鼠神經功能評分、腦梗死率、腦水腫、鐵離子含量的比較Tab.1 Comparison of neurological function score，cerebral infarction rate，brain edema and iron ion content of rats in each group ±s

表1 各組大鼠神經功能評分、腦梗死率、腦水腫、鐵離子含量的比較Tab.1 Comparison of neurological function score，cerebral infarction rate，brain edema and iron ion content of rats in each group ±s

注：與假手術組比較，aP<0.05；與IS組比較，bP<0.05；與治療組比較，cP<0.05；與抑制劑組比較，dP<0.05

組別假手術組IS組治療組抑制劑組治療+抑制劑組鐵離子含量95.12±9.51 171.29±17.13a 99.38±9.94b 216.45±21.65b 189.72±18.98cd神經功能評分（分）0.00±0.00 2.11±0.22a 0.84±0.10b 3.16±0.32b 1.52±0.16cd腦梗死率（%）0.00±0.00 20.51±2.06a 11.29±1.13b 32.19±3.22b 19.43±1.95cd腦水腫含量（%）62.34±2.14 71.15±2.32a 63.15±2.12b 81.42±3.15b 72.11±2.25cd

2.2 布洛芬對大鼠腦組織神經元形態學的影響假手術組大鼠腦組織中神經元結構清晰、排列緊密；IS 組細胞形態模糊不清，排列無規則，神經元數目減少；治療組神經元變性有所改善；抑制劑組神經元數目驟減，細胞排列雜亂無章，細胞核嚴重固縮；治療+抑制劑組神經元數目及細胞排列稍有所改善。見圖1。

2.3 布洛芬對大鼠腦組織SLC7A11、GPX4 mRNA表達水平SLC7A11、GPX4 mRNA 表達：IS 組較假手術組、抑制劑組較IS 組、治療+抑制劑組較治療組均降低，但治療組較IS 組、治療+抑制劑組較抑制劑組均增加（P< 0.05）。見表2。

表2 各組大鼠腦組織中SLC7A11、GPX4 mRNA 表達的比較Tab.2 Comparison of the expression of SLC7A11 and GPX4mRNA in brain tissue of rats in each group xˉ±s

2.4 布洛芬對大鼠腦組織Nrf2/SLC7A11/GPX4通路相關蛋白的表達水平Nrf2、SLC7A11、GPX4表達比較：IS 組較假手術組、抑制劑組較IS 組、治療+抑制劑組較治療組降低，但治療組較IS 組、治療+抑制劑組較抑制劑組增加（P< 0.05）。見圖2、表3。

圖2 大鼠腦組織中各蛋白表達（Western blot 圖）各組大鼠腦組織中Nrf2、SLC7A11、GPX4 表達的比較Fig.2 Expression of proteins in rat brain （Western blot）Comparison of expression of Nrf2，SLC7A11 and GPX4 in brain tissue of rats in each group

表3 各組大鼠腦組織中Nrf2、SLC7A11、GPX4 表達的比較Tab.3 Comparison of expression of Nrf2，SLC7A11 and GPX4 in brain tissue of rats in each group ±s

表3 各組大鼠腦組織中Nrf2、SLC7A11、GPX4 表達的比較Tab.3 Comparison of expression of Nrf2，SLC7A11 and GPX4 in brain tissue of rats in each group ±s

注：與假手術組比較，aP < 0.05；與IS組比較，bP < 0.05；與治療組比較，cP < 0.05；與抑制劑組比較，dP < 0.05

GPX4/β-actin 0.76±0.08 0.43±0.05a 0.72±0.08b 0.19±0.02b 0.49±0.05cd組別假手術組IS組治療組抑制劑組治療+抑制劑組Nrf2/β-actin 0.94±0.10 0.43±0.05a 0.86±0.09b 0.18±0.02b 0.52±0.06cd SLC7A11/β-actin 1.16±0.12 0.64±0.07a 1.02±0.11b 0.35±0.04b 0.67±0.07cd

3 討論

缺血性中風可占中風病例的約80%，局灶性缺血性中風是由大腦中動脈閉塞引起的，導致血液供應不足使神經細胞中葡萄糖和氧氣短缺，致使神經功能受損，給患者和社會都帶來了沉重的經濟負擔［11］。由于靜脈溶栓治療中風的窗口期較短，許多患者沒有得到及時治療，因此有必要開發新的治療策略［12］。

布洛芬是一種非甾體抗炎藥，具有解熱、抗炎和鎮痛作用［13］。本研究發現IS 組大鼠神經元數目減少，細胞排列無規則，神經功能評分增加，TTC染色顯示腦梗死率增加，而經布洛芬干預后，腦梗死率降低，提示布洛芬對IS 大鼠神經功能障礙具有改善作用，與先前結果一致［14］。本研究還發現IS 組大鼠腦水腫含量增加，與前人研究結果一致［15］，在此基礎上布洛芬干預，腦水腫含量降低，可進一步表明布洛芬可保護IS 大鼠神經功能。此外，布洛芬對短暫前腦缺血的大鼠可減少炎性因子的分泌，具有神經保護作用［16］。布洛芬還可減少神經元損傷，降低宮內生長受限新生兒大腦的炎癥反應，可作為保護新生兒大腦的潛在治療策略［17］。本研究推測布洛芬可能通過抗炎作用降低神經功能評分，抑制腦梗死率、腦水腫含量，進而發揮對IS 大鼠神經功能的保護作用，但相關實驗驗證還在進行中。

GPX4 是一種抗氧化防御酶，是多種細胞類型中鐵死亡的關鍵調節因子，通過誘導鐵死亡并引發前腦神經元的神經變性［18］。Nrf2 是一種重要的抗氧化轉錄因子，可調節SLC7A11 和GPX4 的表達，如山奈酚通過激活Nrf2/SLC7A11/GPX4 信號通路保護氧-葡萄糖剝奪/再灌注誘導的神經元損傷及鐵死亡［19］。本研究發現IS 組大鼠腦組織中Nrf2、SLC7A11、GPX4 表達降低，提示IS 大鼠神經受損可能與Nrf2/SLC7A11/GPX4 信號通路被抑制有關。除此之外，葡萄籽原花青素通過激活Nrf2/SLC7A11/GPX4 信號通路，減輕高糖高脂誘導的鐵死亡，提高細胞生存率［20］。鹿紅方可減輕心肌缺血再灌注損傷，可能是通過上調SLC7A11/GPX4 信號通路實現［21］。而本研究發現經布洛芬干預后，Nrf2、SLC7A11、GPX4 表達顯著增加，大鼠神經受損得到改善，猜測布洛芬可能是通過激活Nrf2/SLC7A11/GPX4 信號通路改善IS 大鼠神經受損。為驗證該猜測，實驗在布洛芬干預的基礎上以Nrf2 抑制劑-ML385 進行驗證，結果發現ML385 逆轉了布洛芬對IS 大鼠神經功能的保護作用，進一步表明布洛芬可以保護IS 大鼠神經功能受損，可能與激活Nrf2/SLC7A11/GPX4 信號通路介導的鐵死亡有關。

綜上所述，布洛芬通過激活Nrf2/SLC7A11/GPX4 信號通路實現對IS 大鼠神經功能的保護作用，為IS 治療提供理論依據。但藥物發揮作用機制較為復雜，文章僅從抑制劑方面進行驗證，存在一定的不足，后續使用激活劑及炎癥相關的實驗均將進一步驗證該結論。