黃芩苷通過PGE2在腦缺血再灌注損害小鼠認知功能中的作用研究

鄧翕仁 曾道君 張官鵬 段曉霞

西南醫科大學附屬醫院 1麻醉科，3心電圖室（四川瀘州 646000）；2西南醫科大學麻醉學系，麻醉與重癥醫學瀘州市重點實驗室（四川瀘州 646000）

術后認知功能障礙（postoperative cognitive dys?function，POCD）是指患者術后出現思維力、定向力、記憶力和專注力障礙，是常見的圍術期認知功能相關并發癥，具有發生率高、危害嚴重的特點，在非心臟手術中的發生率高達36.6%～41.4%［1］。探究影響術后認知功能的因素對改善患者術后功能恢復及預后、縮短住院時間，甚至降低患者病死率具有重要意義［2］。目前對POCD 機制的探討主要集中在神經炎癥、退行性變等方面［3］。圍術期血流動力學劇烈波動引起腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）所造成的神經炎癥，是誘發POCD 的重要原因［4］。前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）是抑制神經炎癥的潛在靶點，研究［5］顯示，PGE2 在腦缺血再灌注后表達上調，而抑制PGE2 通路可以減輕CIRI 造成的神經炎癥以及神經功能障礙［6］。中藥單體黃芩苷是源于黃芩的黃酮類化合物，具有抗菌、抗炎、抗氧化和抗凋亡等生物活性［7-8］，能顯著改善CIRI 后認知功能，減輕神經元損傷，減少腦梗死體積［9-10］。相關研究［11］顯示，黃芩苷可通過抑制PGE2 表達，減輕外周炎癥反應，然而黃芩苷是否通過PGE2 發揮減輕神經炎癥和改善認知功能的作用目前鮮有報道。為明確黃芩苷是否通過影響神經中樞PGE2表達及神經炎癥從而改善認知功能，本研究采用tBCCAO 法建立CIRI 小鼠模型，探討黃芩苷對海馬PGE2、神經炎癥及認知功能的影響，為中醫藥及單體在圍術期認知功能中的保護提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6～8 周齡健康雄性SPF 級C57BL/6J 小鼠80 只，購自成都達碩實驗動物有限公司［實驗動物生產許可證號：SCXK（川）2020-030］，體質量20～25 g。所有小鼠飼養在光照/黑暗循環12 h 的房間中，室溫維持在23～25 ℃，可自由獲取食物和水。所有動物已通過學校倫理委員會實驗動物福利倫理審查（批準文號：SWMU20220073）。

1.2 處理及分組第一部分動物實驗研究黃芩苷對腦缺血再灌注小鼠神經認知、海馬神經炎癥及鐵死亡的調控作用，分為對照（Con）組、黃芩苷（Bai）組、CIRI 組、Bai+CIRI 組，每組各9 只。參考ZHOU 等［12］的研究，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）進行麻醉后，采用短暫雙側頸總動脈閉塞法（tBCCAO）建立CIRI 模型，即為CIRI 組；根據DAI 等［13］的研究，以黃芩苷50 mg/kg 灌胃，1 次/d，連續7 d，為Bai 組；在此基礎上進行tBCCAO 造模，即為Bai+CIRI 組；等量生理鹽水灌胃的小鼠進行對照即為Con 組。第二部分動物實驗研究黃芩苷對PGE2 上調小鼠海馬神經炎癥及鐵死亡的調控作用，分為對照組、Bai 組、PGE2 組、Bai+PGE2 組，每組各6 只。以0.5 μL/min 的流速向雙側腦室分別注入20 μg/kg 的PGE2［14］，建立PGE2 上調的小鼠即PGE2 組，然后進行tBCCAO 造模即為PGE2+CIRI 組；Con 組與Bai 組處理方法同第一部分。第三部分動物實驗研究PGE2 對CIRI 小鼠認知功能的影響，分為Con 組、CIRI 組、Bai+CIRI 組、Bai+CIRI+PGE2 組，每組各4 只。黃芩苷灌胃后進行PGE2 側腦室注射，然后行tBCCAO 造模，為Bai+CIRI+PGE2 組；Con 組、CIRI 組、Bai+CIRI 組處理同方法同第一部分。

1.3 主要實驗試劑和儀器黃芩苷（95%純度，上海玻爾化學試劑有限公司）；前列腺素E2（98%純度，北京百靈威科技有限公司）；GPX4、DMT1、PTGS2、GAPDH 兔抗鼠一抗、山羊抗兔二抗（江蘇親科生物研究中心有限公司）；MDA、PGE2、TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA 試劑盒（廣東安迪基因生物科技有限公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、ECL 化學發光檢測試劑盒（上海雅酶生物醫藥科技有限公司）等；水迷宮（上海欣軟信息科技有限公司）、電子光學顯微鏡（Nikon，日本）、電泳儀（北京博邁德基因技術有限公司）、酶標儀（Thermo，美國）、立體定向注射儀（深圳瑞沃德生命科技有限公司）等。

1.4 檢測指標

1.4.1 Morris 水迷宮小鼠在手術（T0）后第3 天（T3）至第6 天（T6）進行定位航行實驗，連續4 天，術后第7 天（T7）進行探針試驗，檢測小鼠游泳的軌跡及游泳速度、逃避潛伏期和總的游泳距離，記錄60 s 內跨平臺次數。

1.4.2 HE 染色小鼠在行為學后予以深度麻醉，以4%多聚甲醛心臟灌注后迅速斷頭取腦，中性甲醛固定腦組織不少于2 d。腦組織脫水后，石蠟包埋、4 μm 切片，行HE 染色。高倍顯微鏡下（400 ×）觀察各切片相同部位細胞形態結構，隨機選擇海馬CA1 區的 10 個視野拍照并計數正常神經元數量。

1.4.3 ELISA法測定MDA、PGE2、TNF-α、IL-1β、IL-6 表達水平按照ELISA 試劑盒說明書操作步驟制備試劑和樣品，加入標準品和樣品，室溫避光孵育后洗板、顯色，加入終止液，混勻后立即測量450 nm 吸光度值，制作標準曲線，計算樣本濃度。

1.4.4 Western blot 法測定GPX4、DMT1、PTGS2水平取行為學后小鼠海馬組織，加入RIPA 組織裂解液勻漿之后冰浴徹底裂解，高速離心后取上清液，用BCA 試劑盒測定樣品蛋白濃度。制膠、上樣、電泳、轉膜后5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST洗膜后加入一抗4 ℃孵育過夜，用TBST 漂洗3 次后加入二抗孵育，再以TBST 漂洗，ECL 曝光顯影。IMAGE-J 軟件分析灰度值，目標帶灰度值/GAPDH灰度值用以表示蛋白相對表達水平。

1.5 統計學方法本研究所采用的統計分析由GraphPad Prism 9.0 和SPSS 27.0 統計軟件完成。計量資料用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P< 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芩苷對CIRI 小鼠認知功能的影響與Con 組相比較，CIRI 組小鼠術后游泳速度差異無統計學意義（P> 0.05）。與CIRI 組相比較，Bai+CIRI 組小鼠術后游泳速度差異無統計學意義（P> 0.05）。與Con 組相比較，CIRI 組小鼠逃避潛伏期在測試第3 天（T5）及第4 天（T6）明顯延長，差異有統計學意義（P< 0.01）。與CIRI 組相比較，Bai+CIRI 組小鼠逃避潛伏期在T3、T4 時間點明顯縮短，差異有統計學意義（P< 0.05）。CIRI 組小鼠跨平臺次數較Con 組顯著減少，差異有統計學意義（P< 0.01）。Bai+CIRI 組較CIRI 組顯著增多，差異有統計學意義（P< 0.01）。見圖1、表1。

圖1 黃芩苷對CIRI 小鼠認知功能的影響——探針實驗軌跡圖Fig.1 Effects of baicalin on cognitive function in CIRI mice-Track plotting of probe test

表1 黃芩苷對CIRI 小鼠認知功能的影響——定位航行實驗及探針實驗結果Tab.1 Effects of baicalin on cognitive function in CIRI mice-Place navigation and probe test ±s

表1 黃芩苷對CIRI 小鼠認知功能的影響——定位航行實驗及探針實驗結果Tab.1 Effects of baicalin on cognitive function in CIRI mice-Place navigation and probe test ±s

注：與Con組比較，*P < 0.01；與CIRI組比較，#P < 0.05，##P < 0.01

項目逃避潛伏期（s）第1天第2天第3天第4天游泳速度(cm/s)目標象限停留時間（s）逃避潛伏期（s）跨平臺次數（次）Con組Bai組CIRI組Bai+CIRI組F值P值0.15 0.06< 0.01< 0.01 0.16< 0.01< 0.01< 0.01 45.3±3.7 42.8±3.5 33.0±1.6 28.9±0.6 18.3±2.5 34.9±3.2 28.9±0.6 6.4±1.6 44.9±2.4 40.2±3.1 32.3±1.5 28.8±0.5 18.9±2.4 32.3±1.8 28.8±0.7 6.8±1.3 47.6±3.4 44.1±3.6 42.3±1.6*40.2±2.3*17.0±2.6 17.7±2.8*40.1±2.3*2.3±1.3*45.7±2.5 43.2±3.8 38.0±1.8#31.8±1.5##17.6±2.4 29.5±5.8##31.8±1.5#4.4±1.7##1.84 2.73 99.13 169.63 1.79 50.36 161.84 23.28

2.2 黃芩苷對CIRI小鼠海馬炎癥水平的影響ELISA結果顯示：與Con 組相比較，CIRI 組小鼠海馬組織促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α 及PGE2 水平顯著升高（P< 0.05）；與CIRI 組相比較，Bai+CIRI 組小鼠海馬組織PGE2、IL-6、IL-1β、TNF-α 水平顯著下降（P< 0.05）。見表2。

表2 海馬炎癥因子水平Tab.2 Hippocampal cytokines level±s，pg/mg

表2 海馬炎癥因子水平Tab.2 Hippocampal cytokines level±s，pg/mg

注：與Con組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與CIRI 組比較，#P < 0.05，##P < 0.01

炎癥因子IL-6 IL-1β TNF-α PGE2 P值< 0.01< 0.01 0.01< 0.01 Con組75.6±3.4 61.1±1.6 355.4±12.0 274.1±17.7 Bai組72.1±2.5 59.6±3.8 352.9±38.7 294.9±20.7 CIRI組90.2±4.3**77.8±4.3**440.0±25.5*358.7±14.4**Bai+CIRI組75.4±5.0##64.6±5.2#356.3±24.0#304.0±13.2##F值17.03 17.56 7.59 13.90

2.3 黃芩苷在CIRI 引起海馬脂質過氧化及鐵死亡相關蛋白異常表達中的作用各實驗組鐵死亡相關蛋白指標：與Con 組相比較，CIRI 組小鼠海馬組織GPX4、PTGS2 蛋白水平顯著升高，DMT1 蛋白水平顯著降低。脂質過氧化MDA 水平顯著升高，差異有統計學意義（P< 0.01）。與CIRI 組相比較，Bai+CIRI 組小鼠海馬組織DMT1 水平升高，GPX4、PTGS2、MDA 水平顯著下降，差異有統計學意義（P< 0.05）。見圖2、表3。

圖2 CIRI 后海馬鐵死亡指標變化Fig.2 Changes of ferroptosis in hippocampus after CIRI

表3 小鼠海馬鐵死亡相關蛋白相對定量及脂質過氧化水平Tab.3 Relative expression of ferroptosis associated proteins and lipid peroxidation of hippocampus ±s

表3 小鼠海馬鐵死亡相關蛋白相對定量及脂質過氧化水平Tab.3 Relative expression of ferroptosis associated proteins and lipid peroxidation of hippocampus ±s

注：與Con組比較，*P < 0.01；與CIRI 組比較，#P < 0.05，##P < 0.01

項目PTGS2 DMT1 GPX4 MDA(mmol/mg蛋白)P值< 0.01< 0.01< 0.01< 0.01 Con組1.0±0.00 1.0±0.00 1.0±0.00 21.25±0.78 Bai組1.08±0.13 0.93±0.16 1.16±0.11 19.39±0.89 CIRI組1.47±0.10*0.69±0.10*1.86±0.10*27.59±0.87*Bai+CIRI組1.22±0.09##1.01±0.03##1.64±0.10#24.94±0.85#F值19.43 9.77 80.73 75.16

2.4 黃芩苷對CIRI 小鼠海馬神經元的影響各組小鼠海馬HE 染色：400 倍下Con 組、Bai 組、CIRI組、Bai+CIRI 組CA1 區正常神經元計數依次為：（259.0±19.5）/mm2、（266.0±13.8）/mm2、（144.1±13.7）/mm2、（215.3±13.0）/mm2。可見Con 組及Bai組海馬組織形態結構完整，細胞結構、形態未見異常。與Con 相比較，CIRI 組海馬CA1區可見大量炎癥細胞聚集，神經元細胞水腫、變性，細胞核呈現固縮、溶解、壞死狀態，正常神經元數量明顯減少（P< 0.01）。與CIRI 組相比較，Bai+CIRI 組小鼠海馬組織炎性細胞浸潤、細胞水腫、神經細胞變性壞死純度均明顯減輕，正常神經元數量明顯增多（P< 0.01）。見圖3。

圖3 各組小鼠海馬組織H&E 染色變化（× 400）Fig.3 H&E staining images of mice hippocampus of each group（× 400）

2.5 黃芩苷在PGE2上調引起海馬炎癥、脂質過氧化及鐵死亡相關蛋白異常表達中的作用與Con組相比較，PGE2 組海馬PGE2 及促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著上調，鐵死亡相關指標GPX4、PTGS2、MDA 水平顯著上升，DMT1 水平下調，差異有統計學意義（P< 0.01）。與PGE2組相比較，Bai+PGE2 組海馬促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平顯著下降，鐵死亡相關指標GPX4、PTGS2、MDA 水平顯著下降，DMT1 水平升高，差異有統計學意義（P< 0.05）。見圖4 和表4、5。

圖4 側腦室注射PGE2 后海馬鐵死亡相關指標變化Fig.4 Changes of ferroptosis in hippocampus after lateral ventricle injecting PGE2

表4 側腦室注射PGE2 后海馬鐵死亡相關蛋白相對定量及脂質過氧化水平Tab.4 Relative expression of ferroptosis associated proteins and lipid peroxidation of hippocampus after lateral ventricle injecting PGE2 ±s

表4 側腦室注射PGE2 后海馬鐵死亡相關蛋白相對定量及脂質過氧化水平Tab.4 Relative expression of ferroptosis associated proteins and lipid peroxidation of hippocampus after lateral ventricle injecting PGE2 ±s

注：與Con組比較，*P < 0.01；與CIRI 組比較，#P < 0.05，##P < 0.01

項目PTGS2 DMT1 GPX4 MDA(mmol/mg蛋白)P值< 0.01< 0.01< 0.01< 0.01 Con組1.0±0.00 1.0±0.00 1.0±0.00 20.83±1.40 Bai組1.06±0.11 1.07±0.08 1.17±0.09 20.66±0.90 CIRI組1.72±0.13*0.62±0.06*1.88±0.17*25.45±1.05*Bai+CIRI組1.27±0.07△△1.02±0.09△△1.54±0.11△22.61±1.10△△F值37.67 28.44 37.71 11.68

表5 側腦室注射PGE2 后海馬炎癥因子水平變化Tab.5 Hippocampal cytokines level after lateral ventricle injecting PGE2 ±s，pg/mg

表5 側腦室注射PGE2 后海馬炎癥因子水平變化Tab.5 Hippocampal cytokines level after lateral ventricle injecting PGE2 ±s，pg/mg

注：與Con組比較，*P < 0.01 ；與PGE2組比較，△P < 0.05，△△P < 0.05

項目IL-6 IL-1β TNF-α PGE2 P值< 0.01< 0.01< 0.01< 0.01 Con組78.3±4.1 63.1±2.2 343.1±11.5 269.1±14.6 Bai組74.4±3.1 60.5±2.9 331.4±31.7 254.9±21.7 PGE2組99.3±5.1*91.3±4.5*497.8±18.6*445.6±19.8*Bai+PGE2組76.4±4.9△△70.1±6.1△△382.3±21.2△△287.0±11.6△△F值21.04 33.01 35.82 77.83

2.6 PGE2 在黃芩苷改善認知功能損害中的作用與CIRI 組相比較，Bai+CIRI 組小鼠逃避潛伏期在測試第3 天開始明顯縮短，差異有統計學意義（P< 0.01）。與Bai+CIRI 組相比較，Bai+CIRI+PGE2 組小鼠逃避潛伏期明顯延長，差異有統計學意義（P< 0.05）。Bai+CIRI 組小鼠跨平臺次數較CIRI 組顯著增加，差異有統計學意義（P< 0.01）。Bai+PGE2+CIRI 組較Bai+CIRI 組顯著減少，差異有統計學意義（P< 0.05）。見圖5、表6。

圖5 PGE2 在黃芩苷改善認知功能損害中的作用—探針實驗軌跡圖Fig.5 Effects of PGE2 on baicalin in improving cognitive impairment-Track plotting of probe test

表6 PGE2 在黃芩苷改善認知功能損害中的作用——定位航行實驗及探針實驗結果Tab.6 Effects of PGE2 on baicalin in improving cognitive impairment-Place navigation and probe test ±s

表6 PGE2 在黃芩苷改善認知功能損害中的作用——定位航行實驗及探針實驗結果Tab.6 Effects of PGE2 on baicalin in improving cognitive impairment-Place navigation and probe test ±s

注：與Con組比較，*P < 0.01；與CIRI 組比較，#P < 0.05，##P < 0.01；與Bai+CIRI組比較，▲P < 0.05，▲▲P < 0.01

項目逃避潛伏期（s）第1天第2天第3天第4天游泳速度（cm/s）目標象限停留時間（s）逃避潛伏期（s）跨平臺次數（次）Con組CIRI組Bai+CIRI組Bai+CIRI+PGE2組F值P值0.34 0.08< 0.01< 0.01 0.09< 0.01< 0.01< 0.01 42.7±2.3 37.4±0.9 29.7±0.8 24.8±1.3 17.5±0.6 36.5±3.8 28.6±0.7 7.1±0.9 42.5±2.0 39.0±1.2 35.0±1.3*32.6±1.4*18.1±0.3 25.3±1.8*39.7±0.6*3.8±1.2*43.9±1.7 37.6±0.8 31.8±1.4#26.3±1.1##18.0±0.4 33.4±1.6##29.3±1.2##6.5±1.0##44.9±2.0 38.9±1.0 34.1±1.5▲31.2±1.0▲▲17.3±0.5 30.6±3.2▲31.7±1.9▲5.4±1.1▲1.24 2.917 13.90 38.62 2.78 11.87 70.33 7.534

3 討論

本研究表明黃芩苷預處理可改善CIRI 引起的認知功能損害，并伴隨神經炎癥、脂質過氧化及鐵死亡相關蛋白的異常表達減少，其機制與黃芩苷抑制PGE2 的上調有關。

神經炎癥在認知功能損害病理過程中發揮重要作用，而不同程度和部位的CIRI 差異，對腦產生不同的神經炎癥效應，栓塞大腦中動脈（MCAO模型）將導致大腦額葉、頂葉及顳葉局部缺血，誘發神經元凋亡，再灌注激活NLRP3 炎癥小體加劇神經元凋亡、肢體運動障礙［15］。雙側頸動脈閉塞后恢復血流（tBCCAO 模型）的小鼠，海馬CA1 區大量促炎因子釋放，小鼠記憶能力下降、認知功能損害［16］。本研究采用tBCCAO 模型證實，CIRI 引起小鼠認知功能障礙，運動功能未受影響。在此基礎上，我們運用黃芩苷預處理再對小鼠進行tBC?CAO，證明黃芩苷可改善CIRI 引起的認知功能損害。既往研究［17］表明，黃芩苷可通過抑制NLRP3炎性小體的激活和TLR4/NF-κB 信號通路抑制小膠質細胞誘導的神經炎癥，改善阿爾茲海默癥模型小鼠的記憶力和認知缺陷。LIU 等［18］發現黃芩苷可顯著抑制反復腦缺血再灌注造成的IL-6、IL-1β、TNF-α 水平上調。上述研究說明黃芩苷改善認知功能的原因與其抑制神經炎癥有關。我們研究發現，小鼠CIRI 后海馬炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α 水平顯著上升，而黃芩苷預處理可改善這些CIRI 小鼠的認知功能，并伴有炎癥因子釋放減少。CIRI 誘導海馬小膠質細胞激活和神經炎癥增加，IL-6、IL-1β、TNF-α 水平顯著上調［19］。我們已有研究結果證實PTGS2 上調與TNF-α 表達成正相關，參與小鼠術后認知功能障礙［20］。PTGS2 催化花生四烯酸生成PGE2，是大腦中最豐富的前列腺素之一。PGE2 通過與PGE2 受體（EP）結合介導炎癥反應，參與生理和病理生理神經過程［21-22］。相關研究提示，黃芩苷可抑制額葉皮層、海馬、以及下丘腦PGE2 的產生［23］，抑制PGE2 表達可減輕巨噬細胞相關炎癥反應［11］。我們發現CIRI 后海馬PGE2 上調，黃芩苷預處理可顯著降低海馬PGE2水平，下調IL-6、IL-1β、TNF-α 等炎癥因子表達。因此，黃芩苷可通過抑制PGE2 水平抑制神經炎癥，減輕CIRI 引起的認知功能損害。

CIRI 通過激活小膠質細胞合成多種炎癥因子，導致脂質過氧化和神經元鐵死亡發生。YAN等［24］發現慢性腦灌注不足的大鼠海馬促炎細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α 上調，海馬神經元鐵死亡加重。QU 等［25］發現，抑制iNOS 可特異性地促進M1小膠質細胞鐵死亡從而減輕神經炎癥，改善蛛網膜下腔出血后腦損傷。我們通過海馬定向注射PGE2 上調海馬PGE2，發現海馬神經炎癥加重，IL-6、IL-1β、TNF-α水平上調，脂質過氧化水平升高，鐵死亡相關蛋白GPX4、DMT1、PTGS2 異常表達，而黃芩苷預處理小鼠再進行PGE2 上調，這些小鼠對海馬神經炎癥、脂質過氧化及鐵死亡相關蛋白的表達影響不明顯。黃芩苷抑制神經炎癥，從而改善CIRI 引起的認知功能損害，PGE2 在其中發揮關鍵作用。

綜上所述，黃芩苷通過抑制PGE2 相關的神經炎癥、脂質過氧化、鐵死亡相關蛋白異常表達，從而改善CIRI 引起的認知功能損害。該研究具有一定的理論基礎研究價值，為治療CIRI 提供了新思路，我們擬進一步探討PGE2 在CIRI 引起認知功能損害中的作用，并開展功能驗證。