甜菜堿調控RhoA/ROCK抑制野百合堿致大鼠肺動脈高壓

張波濤 王雅蓉 張婷 李璐

1寧夏醫科大學總醫院（銀川 750004）；2寧夏武警醫院（銀川 750004）

肺動脈高壓（PAH）是以肺動脈重構為特征的難治性心肺血管惡性疾病，引起肺部血管阻力和肺動脈的壓升高，最終導致右心室肥大、右心室功能衰竭和死亡［1-3］。PAH 病理生理學特征主要是急性肺血管收縮和慢性肺血管器質性重構。目前，治療PAH 藥物最常用的是前列腺醇、西地那非及波生坦［4］。尋找新的阻斷或逆轉心肺血管重構的藥物新靶點是目前臨床研究的熱點。野百合堿（MCT）是從野百合種子中提取，可誘導大鼠患上肺動脈高壓，通過給大鼠皮下注射MCT，3 周后即可產生與臨床PAH 患者相似的血流動力學以及病理學特征［5］。采用MCT 制造大鼠PAH 已成為研究PAH 的最常用動物模型，其有利于開展相關藥物對PAH 的藥效評價和作用機制研究。甜菜堿是一種季銨型生物堿，由寧夏中藥材枸杞中提取分離制得，其具有保護肝功能、緩解應激反應、抑制急性心臟損傷等諸多作用。SONG 等［5］在PAH動物模型體內發現，RhoA 蛋白在細胞遷移、黏附、凋亡和基因表達中具有重要作用，RhoA 通過與其下游的效應物ROCK 相互作用，調控細胞內Ca2+、肺部血管重構、肺血管收縮和炎癥反應等病理生理過程。甜菜堿可有效改善肺動脈高壓患者預后，可能與降低NF-κB、TNF-α 以及IL-1β 的蛋白表達水平有關［6］。本研究旨在探討甜菜堿對MCT 誘導的大鼠PAH 與RhoA/ROCK 通路蛋白表達的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物選取清潔級成年雄性SD 大鼠（8～10 周齡），由寧夏醫科大學實驗動物中心提供。實驗動物編號：SCXK（寧）2020-0001，倫理學批件（編號：2019-436）

1.1.2 主要實驗材料甜菜堿（分析純度> 98.0%）采購于Singm-Aldrich 公司，分別稱取400、800 和1 600 mg 甜菜堿，溶解在40 mL 0.9%氯化鈉注射液中，放置于4 ℃儲存備用；MCT（純度> 99.0%）采購于Singm-Aldrich 公司，稱取MCT 0.2 g，放置在燒瓶中。加入1 mol/L HCl 溶液中，直到MCT 在溶液中溶解，然后逐滴添加在NaOH 溶液中，pH調節至約7.4，最終使用雙蒸餾水稀釋成10.0 mL備用。

RhoA、ROCK1、ROCK2 的一抗體采購于Abcam生物技術公司（美國加利福尼亞州）；β-actin 采購于Proteintech 公司（美國芝加哥）；全蛋白提取和蛋白定量試劑盒均采購于凱基生物科技有限公司；山羊抗兔二抗和β-actin 二抗采購于北京中杉金橋生物技術公司。細胞超聲粉碎機（TY96-ⅡN 型）（寧波新芝生物科技有限公司）；PowerPac Basic電泳儀（BIO-RAD 公司）；Mutiskan Go 酶標儀（Thermo Fisher 公司）；凝膠成像分析儀（培清JS-860B，上海培清科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及處理將72 只清潔級成年雄性SD 大鼠隨機分成為6 組（每組12 只）：空白對照組、MCT組、甜菜堿組（100、200和400 mg/kg）、西地那非（30 mg/kg）組。處理：在SD 大鼠腹部皮下注射MCT（50 mg/kg）連續21 d，待構建大鼠PAH模型成功后，正常對照組和MCT 組給予相應體積的生理鹽水灌胃，其他各實驗組分別繼續灌胃甜菜堿（100、200、400 mg/kg）或西地那非（30 mg/kg）20 d。實驗終點是第41 天，各組大鼠采用烏拉坦（100 mg/kg）麻醉后固定，進行有創血流動力學、臟器指數檢測。

1.2.2 血流動力學指標的測定各組大鼠末次用藥后均禁食不禁水24 h，稱體重后使用20%烏拉坦（6 mL/kg，ip）麻醉固定，暴露大鼠右側頸部，局部備皮后切開皮膚，分離其右側頸外靜脈周圍的肌肉、神經，剝離出血管，埋線結扎血管的遠心端，用顯微剪剪一“v”字型切口。使用聚乙烯導管（北京協和醫學院病理生理學系，中國北京）插入SD大鼠右頸外靜脈中，依次通過右心房和右心室，導管遠端與壓力傳感器（Alcott Biotech，中國上海）相連接，用于測量右心室收縮壓（RVSP），測量時間為2 min。最終將導管置于肺動脈中，監測記錄平均肺動脈壓（mPAP）。血流動力學評估結束，使用頸椎脫位法處死大鼠。然后將其腹腔剖開，切開膈肌暴露其胸腔，切斷肋骨后可見肺和心臟，切除其整個肺和心臟組織。摘取SD 大鼠心臟、肺和肝臟，首先使用生理鹽水清洗余血，再用濾紙吸干多余的液體吸，遂即進行稱重后與大鼠的體重進行對比得到臟器指數。為進一步觀察右心室肥厚情況，首先需沿心耳下緣將整個心室從心臟上剪下，然后再沿心室間隔的邊緣剪下右心室，依次稱取右心室（right ventricle，RV）重量和左心室加室間隔［LV （left ventricle） + S （septum）］重量，計算得出右室肥厚指數RVHI=RV/（LV+S）。最后將右心室和肺組織冷凍在液氮中保存進行Western blot 分析。

1.2.3 Western blot 檢測取約50 mg 經液氮研磨的右心室或肺組織，將其加入至冷裂解緩沖液0.3 mL 中，在冰浴下使用超聲破碎細胞。然后在4 ℃，10 000 r/min 離心20 min，分別取右心室、肺組織上清液用BCA 蛋白質分析試劑盒進行蛋白定量，剩余的上清液加入上樣緩沖液后在100 ℃水浴10 min，置于-20 ℃保存。取蛋白樣本60 μg 上樣，12% SDS-PAGE 凝膠電泳（80 V/120 V 電壓），200 mA 恒定電流轉膜至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），在室溫下用封閉PBST（PBS含有0.1%吐溫-20）緩沖液封閉膜2 h，然后需在4 ℃下培養過夜。首先分別使用抗Rho A（1 μg/mL）、抗ROCK1（1∶2 000）、抗ROCK2（1 μg/mL）及抗β-actin抗體（內參，1∶1 000）在4 ℃孵育過夜。然后分別加入山羊抗兔IgG二抗（偶聯有HRP，1∶3 000）常溫孵育2 h，加入超級化學發光底物反應液后曝光膠片。采用Quantity-one軟件分析膠片掃描結果，將得到的目的條帶的光密度值與其相對應的內參β-actin 的光密度值相對比以校正誤差，所得出的比值則代表該目的蛋白的相對含量。

1.3 統計學方法實驗結果以SPSS 19.0 統計分析軟件包進行分析，以（±s）表示計量數據，多組間均數比較采用單因素方差分析，P< 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 甜菜堿抑制MCT 誘導大鼠PAH 和右心室肥大通過檢測大鼠mPAP、RVSP 和RVHI 評估甜菜堿對MCT 誘導大鼠的肺和心臟損傷。與對照組相比，MCT 組大鼠在21 d 內持續出現顯著PAH（P<0.01）。甜菜堿（400 mg/kg）組大鼠的mPAP 顯著低于MCT 組（P< 0.05）。MCT 組大鼠由于肺動脈壓升高，故RVSP 明顯升高。甜菜堿（400 mg/kg）組與西地那非組均可降低PAH 大鼠RVSP（P< 0.05和P< 0.01）。甜菜堿（400 mg/kg）組降低了PAH 大鼠RVHI（P< 0.05），與西地那非降低了PAH 大鼠RVHI 相仿（P< 0.01）。上述結果表明甜菜堿可以保護MCT 誘導的PAH 大鼠的肺和心臟，見表1。

表1 MCT 對PAH 大鼠mPAP、RVSP 和RVHI 的影響Tab.1 Effects of MCT on mPAP，RVSP and RVHI in PAH rats ±s

表1 MCT 對PAH 大鼠mPAP、RVSP 和RVHI 的影響Tab.1 Effects of MCT on mPAP，RVSP and RVHI in PAH rats ±s

注：與空白組比較，##P < 0.01；與MCT組比較，*P<0.05，**P < 0.01

組別空白組MCT組西地那非組甜菜堿組（100 mg/kg）甜菜堿組（200 mg/kg）甜菜堿組（400 mg/kg）HR（次/min）353.67±14.32 404.5±14.56 357.75±13.57 399.67±12.57 396.42±13.58 369.58±18.99 mPAP(mmHg)20.53±0.79 52.72±2.06##31.82±1.72**50.96±4.15 50.42±1.56 41.25±2.43*RVSP(mmHg)32.43±2.35 96.79±2.15##71.54±2.67**97.90±1.73 95.25±1.61 71.78±1.68**RVHI 0.31±0.02 0.72±0.03##0.50±0.03**0.71±0.03 0.70±0.04 0.53±0.03**

2.2 甜菜堿抑制MCT 誘導PAH 大鼠肺和右心室組織RhoA/ROCK的表達通過Western blot分析，進一步檢測了甜菜堿對MCT 誘導PAH 大鼠的肺組織和右心室組織RhoA、ROCK1 和ROCK2 蛋白的表達。結果顯示，與對照組相比，MCT 組中肺組織和右心室組織RhoA、ROCK1 和ROCK2 蛋白表達上調，但西地那非（50 mg/kg）組和甜菜堿（400 mg/kg）組顯著降低了RhoA、ROCK1 和ROCK2 蛋白表達（P< 0.05）。見表2、圖1 和表3、圖2。

圖1 MCT 誘導PAH 大鼠的肺組織RhoA/ROCK 表達（n=8）Fig.1 MCT-induced RhoA/ROCK expression in lung tissue of PAH rats（n=8）

圖2 MCT 誘導PAH 大鼠心臟組織RhoA/ROCK 表達（n=8）Fig.2 Effect of RhoA/ROCK in MCT-induced PAH rat heart tissue（n=8）

表2 MCT 誘導PAH 大鼠肺組織RhoA/ROCK 的影響Tab.2 Effect of RhoA/ROCK in lung tissue of MCT-induced PAH rats ±s

表2 MCT 誘導PAH 大鼠肺組織RhoA/ROCK 的影響Tab.2 Effect of RhoA/ROCK in lung tissue of MCT-induced PAH rats ±s

注：與空白組比較，##P<0.01；與MCT組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別空白組MCT組西地那非組甜菜堿組（400 mg/kg）RoCK2 0.79±0.05 1.29±0.05##0.80±0.02**0.82±0.03*RhoA 0.61±0.06 1.42±0.05##0.76±0.05**0.88±0.06**RoCK1 0.72±0.05 1.05±0.07##0.8±0.02*0.81±0.05*

表3 MCT 誘導PAH 大鼠心臟組織RhoA/ROCK 的影響Tab.3 Effect of RhoA/ROCK in MCT-induced PAH rat heart tissue ±s

表3 MCT 誘導PAH 大鼠心臟組織RhoA/ROCK 的影響Tab.3 Effect of RhoA/ROCK in MCT-induced PAH rat heart tissue ±s

注：與空白組比較，##P < 0.01；與MCT組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

組別空白組MCT組西地那非組甜菜堿組（400 mg/kg）RoCK2 0.71±0.04 1.12±0.03##0.83±0.03**0.87±0.05*RhoA 0.65±0.03 1.16±0.11##0.71±0.02**0.70±0.02**RoCK1 0.67±0.05 0.94±0.07##0.69±0.02**0.79±0.02*

3 討論

本實驗提示甜菜堿對野百合堿誘導的大鼠肺動脈高壓產生治療效果。結果表明，西地那非組和甜菜堿（400 mg/kg）組治療前后大鼠mPAP、RVSP和RVHI 均明顯減低，提示甜菜堿可減緩PAH 大鼠的肺動脈高壓以及其右心室擴大的進展。同時，Western blot 檢測結果表明給藥甜菜堿抑制了PAH 大鼠心肺組織中RhoA，ROCK1和ROCK2的表達。綜上所述，甜菜堿可能通過下調RhoA、ROCK1和ROCK2 蛋白表達，對MCT 所致PAH 大鼠起到顯著療效。

PAH 作為一種進行性疾病，其病理生理學特征包括肺動脈平滑肌細胞的異常增殖、凋亡抵抗和肺血管重構，最終導致右心衰竭［7-9］。西地那非作為治療PAH 的常用藥物，已被美國食品藥物管理局及臨床廣泛認可，故本研究選擇西地那非為陽性藥物。YADAV 等［10］研究表明，西地那非可有效減緩PAH 大鼠肺動脈高壓，與本研究中結果一致，常用與構建動物PAH 模型主要以下幾種方式：野百合堿誘導模型、肺栓塞型、低氧誘導模型、遺傳修飾模型和手術分流模型等［11］。野百合堿作為一種雙吡咯類生物堿，其在動物肝臟內的氧化代謝產物，可選擇性地損傷肺動脈內皮細胞，使細胞間隙增大，引起血小板源性生長因子等大量釋放，促進平滑肌細胞增殖、遷移，進而引起肺中小動脈重構、狹窄、甚至閉塞，最終導致PAH。給SD大鼠注射野百合堿構建PAH模型最為常見［12-14］。在本實驗中MCT 組的大鼠出現了血流動力學和右心功能的異常：血流動力學參數mPAP 和RVSP顯著升高，RVHI 顯著升高［15-16］，這與HUMBERT等［17-18］的報道一致，表明構建PAH 大鼠模型成功。大量研究示人類PAH 的特征在于肺血流動力學異常，包括mPAP，RVHI 和RVSP 的異常升高。同樣在動物PAH 模型中，mPAP、RVHI 和RVSP 的類似變化通常被認為是PAH 發生發展的證據。因此，本研究通過檢驗用藥前后血流動力學指標和RVHI 的變化得出甜菜堿（400 mg/kg）對PAH 大鼠的治療作用。

MONTAGNOLI 等［19-20］研究RhoA/ROCK 信號傳導通路作為人體細胞常見的信號傳導通路，過度激活對PAH 的形成產生重要作用。RhoA 是一類具有GTP 酶活性的小分子，在心、腦、肺、平滑肌等組織中均廣泛的存在，其作用機制包括炎性因子產生，細胞遷移和凋亡，平滑肌細胞增殖等［21-22］。KIM 等［23］研究表明，RhoA 之所以可以發揮上述生物效應，主要通過調節其下游靶蛋白ROCK。ROCK 屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，分為ROCK1和ROCK2 兩種同種型，兩者具有高度同源性，常通過caspase-3 介導途徑調控細胞凋亡。越來越多的研究［24-25］表明ROCK 抑制劑、西地那非和辛伐他汀都對PAH 有治療作用，可以使ROCK 的表達恢復到正常水平。在本實驗中，與空白組相比，MCT 組RhoA，ROCK1 和ROCK2 的表達水平顯著升高，提示RhoA/ROCK 信號通路的異常激活在PAH 模型中起到了至關重要的作用，與文獻［26］報道一致，因此抑制 RhoA/ROCK 信號通路的活化對于治療PAH 具有重要作用。西地那非組和甜菜堿組均抑制了PAH大鼠RhoA，ROCK1和ROCK2的表達。

因此，本研究推測甜菜堿對MCT 所致PAH 大鼠保護作用可能與RhoA/ROCK 信號通路有關，未來將進一步行相關實驗研究明確其分子機制。