丙泊酚通過miR-182-5p介導HIF-1α通路對缺氧誘導胎盤滋養(yǎng)細胞生物學活性的影響

孫藝娟 賈杰 鄧戀 漆冬梅 陳祥楠 黎昆偉 王培宗

1廣東省婦幼保健院麻醉科（廣州 511400）；2中山大學腫瘤防治中心麻醉科（廣州 510060）

先兆子癇（PE）是一種妊娠期高血壓疾病。它影響全世界2%～8%的妊娠，并導致孕產(chǎn)婦在圍產(chǎn)期發(fā)病率和病死率的增加［1］。研究表明，缺氧會促使胎盤釋放各種炎癥因子進入母體循環(huán)，導致滋養(yǎng)細胞遷移和侵襲減少，引起PE 的發(fā)生［2-3］。丙泊酚具有麻醉作用外，還有一定的抗炎和抗氧化作用［4-5］，并抑制惡性腫瘤細胞的生物活性［6］。而丙泊酚是否對缺氧條件下滋養(yǎng)層細胞的生物學活性產(chǎn)生影響，其調(diào)節(jié)機制如何，值得我們進一步研究。

Targetscan 預測軟件分析表明，miR-182-5p 和HIF-1α 具有潛在的結合位點，但是丙泊酚是否可以通過miR-182-5p 調(diào)節(jié)HIF-1α 參與PE 的調(diào)控，目前尚未有報道。本研究通過缺氧刺激HTR-8/SVneo細胞構建缺氧細胞模型，并通過丙泊酚干預，從miR-182 分子入手，對下游信號調(diào)節(jié)的效應做進一步研究，并著重對滋養(yǎng)層細胞的分化、侵襲進行觀察，以期能為PE 圍術期治療和預后提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人HTR8/SVneo 細胞購自廣州賽庫生物；總RNA 提取試劑購自北京Solarbio 生物；胎牛血清購自美國Hyclone 公司，DMEM 培養(yǎng)基和Matrigel 購自美國Sigma 公司；SYBR qPCR Master Mix 購自南京諾唯贊；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen 公司；mimics NC 和miR?182?5p inhibitor 引物由廣州國自科技設計；ECL 化學發(fā)光底物和BCA 試劑盒購自北京白鯊易生物；CCK-8試劑購自武漢塞維爾；HIF-1α、VEGF、MMP9 、GAPDH 一抗、二抗購自武漢proteintech；丙泊酚購自MCE 生物。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組將細胞培養(yǎng)在10%胎牛血清、100 單位/mL 青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，并在37 ℃、5% CO2、加濕條件下孵育。利用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑將mimics NC、miR?182?5p inhibitor 轉(zhuǎn)染至細胞，24 h 后進行分組：（1）對照組（Normoxia）：采用常氧21% O2培養(yǎng)細胞；（2）缺氧組（Hypoxia）；（3）丙泊酚組（propofol）：處理細胞時加入1 μmol/L 的丙泊酚；（4）缺氧陰性轉(zhuǎn)染組（Hypoxia+mimics NC）：細胞轉(zhuǎn)染 mimics NC；（5）丙泊酚陰性轉(zhuǎn)染組（Hy?poxia+Propofol+mimics NC）：細胞轉(zhuǎn)染mimics NC 后加入1μmol/L 的丙泊酚；（6）丙泊酚+轉(zhuǎn)染miR-182-inhibitor組（Hypoxia+propofol+miR-182-inhibitor）：細胞轉(zhuǎn)染 miR-182-inhibitor 后，加入1 μmol/L 的丙泊酚。除對照組外，其余組全部在3%缺氧條件下培養(yǎng)細胞。

1.2.2 CCK8 檢測細胞活力的變化取處于對數(shù)生長期細胞，使用細胞計數(shù)試劑盒8 （CCK8）測定以檢查細胞活力。按照試劑盒說明操作，酶標儀檢測450 nm 吸光值。

1.2.3 定時qPCR 檢測miR-182 及HIF-1α 的表達水平采用TriQuick Reagent 提取細胞總RNA，然后采用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 進行qPCR 檢測，使用 2?ΔΔCt測量所有樣品的循環(huán)閾值（Ct）。使用U6 作為內(nèi)參計算miR-182a-5p 的相對轉(zhuǎn)錄水平，同時選擇GAPDH 作為內(nèi)參計算HIF-1α 的mRNA 表達水平。

1.2.4 免疫印跡檢測蛋白使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解緩沖液分離總蛋白。蛋白濃度測定采用BCA 蛋白定量試劑盒；分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上。膜在室溫下用與以下一抗孵育過夜：抗HIF-1α（1∶800）、抗VEGF（1∶800）和抗MMP-9（1∶800）、GAPDH（1∶2 000）。將膜與二抗（1∶4 000）孵育，最后采用ECL 化學發(fā)光底物進行曝光，通過image-J 軟件對條帶進行分析。

1.2.5 Transwell 細胞遷移實驗和侵襲實驗細胞遷移實驗：將1 × 106/mL 細胞，取100 μL 接種到Transwell 小室的上孔中。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 h 后，取出小室，用棉簽擦去上室的細胞，甲醛固定、PBS 洗滌、結晶紫染色。顯微鏡拍照并統(tǒng)計穿過的細胞數(shù)。細胞侵襲實驗：按Matrigel：培養(yǎng)基=1∶3 的比例稀釋，取40 μL 加入Transwell 小室中。37 ℃孵育2 h 使Matrigel 凝固。將1 × 106/mL細胞，取100 μL 接種至Transwell 小室上孔，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 h 后，取出小室，用棉簽擦去上室的細胞，甲醛固定、PBS 洗滌、結晶紫染色。顯微鏡拍照并統(tǒng)計穿過的細胞數(shù)。

1.2.6 TUNEL 法檢測細胞凋亡將玻片放入24孔板，細胞懸液加入孔中過夜。棄上清液，PBS 清洗細胞，用4%PFA 室溫固定，PBS 清洗。細胞用0.3%TrtonX-100 處理。棄透化液，PBS 清洗，加入TUNEL 反應液37 ℃避光孵育，PBS 清洗封片后熒光顯微鏡觀察和拍照。

1.2.7 雙熒光素酶實驗用HIF-1α 的3'-UTR 轉(zhuǎn)染至細胞。構建HIF-1α 突變型和野生型載體，并將載體與NC-mimics 和miR-182 mimics 轉(zhuǎn)入HTR-8/SVneo 細胞中。將突變引入miR-182 的2 個預測結合位點（UUGCCAA），48 h 后測定熒光酶活性。

1.3 統(tǒng)計學方法使用SPSS 25.0 進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差。所有上述測定的結果都是通過3 個獨立的重復實驗獲得的。兩組數(shù)據(jù)的比較采用獨立樣本t檢驗，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（ANVOA），Bonferroni法進行事后比較，以P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 確定合適氧濃度和丙泊酚預處理濃度將細胞暴露不同氧濃度處理（常氧21% O2、10% O2、3% O2、1% O2），并通過CCK8 法測定細胞活力。發(fā)現(xiàn)缺氧以時間相關的方式降低細胞活力，與常氧比較，缺氧抑制作用在 24 h 后出現(xiàn)，并在72 h 治療后達到峰值（圖1，P< 0.05）。為了研究丙泊酚對細胞活力的影響，分別采用不同濃度（0、0.1、0.3、1、3 μmol/L）的丙泊酚預處理細胞，與0、0.1、0.3 μmol/L 相比1、3 μmol/L 異丙酚預處理細胞活力最好（圖2，P< 0.05）。本次實驗選取3%氧濃度和1 μmol/L 丙泊酚濃度對細胞進行干預處理。

圖1 不同氧濃度下細胞活力Fig.1 Cell viability at different oxygen

圖2 不同濃度丙泊酚預處理細胞活力Fig.2 Cell viability of pretreated cells with different concen?trations of propofol concentrations

2.2 qRT-PCR 檢測miR-182-5p mRNA 和HIF-1α mRNA 的表達qRT-PCR 顯示，與對照組相比，缺氧組miR-182-5p mRNA 的表達下調(diào)（P< 0.05），而HIF-1α mRNA 的表達顯著升高（P< 0.05）。與缺氧組比較，丙泊酚處理組miR-182-5p mRNA 表達的升高（P< 0.05），而HIF-1α mRNA 的表達降低（P< 0.05，圖3）。

圖3 miR-182 mRNA 和HIF-1α mRNA 的表達Fig.3 The relative expression of miR-182 mRNA and HIF-1α mRNA

2.3 通過蛋白質(zhì)印跡法檢測相關蛋白的表達變化水平通過Wetern blot 檢測各組蛋白表達結果顯示：與對照組相比，缺氧組HIF-1α、VEGF 蛋白表達水平升高（P< 0.05），MMP-9 蛋白表達水平降低（P< 0.05）；與缺氧組相比，丙泊酚組HIF-1α、VEGF 蛋白表達水平降低（P< 0.05），MMP-9 蛋白表達水平升高（P< 0.05，圖4）。

圖4 Western blot 檢測不同組蛋白表達變化水平Fig.4 Western blot detection of the relative protein expres?sion levels in different groups

2.4 Transwell檢測細胞遷移以及侵襲變化Tran?swell 實驗表明與對照組相比，缺氧組的細胞遷移和侵襲數(shù)量均受到顯著抑制（P< 0.05）；與缺氧組比較，丙泊酚組細胞遷移和侵襲數(shù)量顯著升高（P< 0.05，圖5）。

圖5 Transwell 檢測細胞遷移以及侵襲變化Fig.5 Transwell detects changes in migration and invasion of different groups of cells

2.5 qPCR 檢測細胞轉(zhuǎn)染HTR8 /SVneo 細胞后miR-182-5p 和HIF-1α mRNA 的表達通過qRTPCR 檢測結果顯示，與對照組比較，缺氧組和缺氧陰性轉(zhuǎn)染組中miR-182-5p 的mRNA 表達水平顯著下降（P< 0.05），HIF-1α 的mRNA 表達水平顯著上升（P< 0.05）。與缺氧陰性轉(zhuǎn)染組比較，丙泊酚陰性轉(zhuǎn)染組miR-182-5p 的mRNA 表達水平升高（P<0.05），HIF-1α 的mRNA 表達水平降低（P< 0.05）。與丙泊酚陰性轉(zhuǎn)染組比較，丙泊酚+ miR-182-in?hibitor 組的miR-182-5p 的mRNA 表達水平顯著降低（P<0.05），而HIF-1α 的mRNA 表達水平顯著升高（P<0.05，圖6）。

圖6 qPCR 檢測各組miR-182-5p 和HIF-1α mRNA 的表達Fig.6 The relative expression of mRNA in different groups

2.6 TUNEL 檢測各組細胞凋亡的變化與對照組相比，缺氧組和缺氧陰性轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率顯著升高（P< 0.05）。與缺氧陰性轉(zhuǎn)染組相比，丙泊酚陰性轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率顯著降低（P< 0.05）。與丙泊酚陰性轉(zhuǎn)染組比較，丙泊酚+miR-182-in?hibitor 組細胞凋亡率顯著上升（P< 0.05，圖7）。

圖7 TUNEL 檢測各組細胞凋亡變化Fig.7 Apoptosis rate in different groups

2.7 Transwell檢測細胞遷移以及侵襲變化Tran?swell 實驗顯示，與對照組相比，缺氧組和缺氧陰性轉(zhuǎn)染組的侵襲和遷移細胞計數(shù)均有下降（P< 0.05）；與缺氧陰性轉(zhuǎn)染組相比，丙泊酚陰性轉(zhuǎn)染組的侵襲和遷移細胞數(shù)均有顯著提高（P< 0.05）；與丙泊酚陰性轉(zhuǎn)染組比較，丙泊酚+miR-182-inhibitor 組的侵襲和遷移細胞數(shù)顯著下降（P< 0.05，圖8）。

圖8 Transwell 檢測各組細胞遷移和侵襲變化Fig.8 Transwell detects changes in migration and invasion of different groups of cells

2.8 檢測各組蛋白水平的變化通過Western blot 檢測不同組中蛋白水平變化，結果顯示與對照組相比，低氧組 HIF-1α、VEGF 蛋白表達水平升高（P< 0.05），MMP-9 蛋白表達水平降低（P< 0.05）；與缺氧陰性轉(zhuǎn)染組相比，丙泊酚陰性轉(zhuǎn)染組的HIF-1α、VEGF 蛋白表達水平降低，MMP-9 蛋白表達水平升高；與丙泊酚陰性轉(zhuǎn)染組比較，丙泊酚+轉(zhuǎn)染miR-182-inhibitor組HIF-1α、VEGF蛋白表達水平降低，MMP-9蛋白表達水平升高（P< 0.05，圖9）。

圖9 Western blot 檢測各組蛋白水平的變化Fig.9 Western blot detection of the relative protein expression levels in different groups

2.9 HTR?8/SVneo 細胞中HIF?1α 與miR?182?5p的相關性基于Targetscan 預測軟件的在線生物分析，miR-182-5p和HIF-1α 3'UTR具有潛在的結合位點。為了進一步確定miR-182-5p 和HIF-1α 之間的相關性，進行雙熒光素酶測定。根據(jù)相應結果，miR-182-mimics 能夠降低含有熒光素酶報告質(zhì)粒的HIF-1α 3'UTR 序列所在細胞的熒光素酶活性，但它對細胞的熒光素酶活性沒有影響，其中位于序列中含有HIF-1α 3'UTR突變的熒光素酶報告質(zhì)粒。見圖10。

圖10 HTR-8/SVneo 細胞中HIF-1α 與miR-182-5p 的相關性Fig.10 Correlation of HIF-1α with miR-182-5p in HTR-8/SVneo cells

3 討論

絨毛外滋養(yǎng)細胞的正常遷移和侵襲對于子宮螺旋小動脈的成功重塑至關重要。低氧導致絨毛外滋養(yǎng)細胞遷移侵襲能力下降，細胞凋亡增加，抑制子宮螺旋動脈重構［7］。因此，如何改善低氧條件下絨毛外滋養(yǎng)細胞的遷移侵襲能力，對治療PE有重大意義。

miR-182a-5p 是一種與炎癥、腫瘤和免疫調(diào)節(jié)相關的microRNA，位于人類染色體7q32.2。研究發(fā)現(xiàn)miR-182在PE患者胎盤組織中低表達［8］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-182a-5p 在缺氧誘導的HTR-8/SVneo細胞中的表達明顯下調(diào)，而在丙泊酚給藥后，miR-182a-5p 表達水平增加，且HTR/SVneo 細胞的生物活性恢復，轉(zhuǎn)染miR-182a-5p-inhibitor 后，則逆轉(zhuǎn)了丙泊酚對缺氧滋養(yǎng)細胞的治療作用。雙熒光素酶檢測表明，HTR/SVneo細胞系中的miR-182a-5p可以調(diào)節(jié)HIF-1α。在此基礎上可以推斷，丙泊酚對改善缺氧誘導的胎盤絨毛細胞損傷的原因可能與miR-182a-5p對HIF-1α的調(diào)控有關。

HIF-1α 是調(diào)節(jié)細胞對缺氧和低氧張力反應的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，在免疫和炎癥過程中發(fā)揮重要作用。在正常妊娠期間，HIF-1α 會影響氧張力、細胞因子和血管生成因子釋放的變化［9］。在PE 的發(fā)病機制中HIF-1α 起著至關重要的作用［10］。研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在PE患者胎盤組織和缺氧條件下的HTR8/SVneo 細胞中高表達［11］。缺氧可通過上調(diào)HIF-1α調(diào)控子宮內(nèi)膜異位癥巨噬細胞極化異常［12］。實驗發(fā)現(xiàn)，在缺氧刺激下，HTR8/Svneo 細胞的HIF-1α 的表達升高，細胞凋亡增加，這與之前的研究一致，但是在給予丙泊酚處理后，HIF-1α 的表達降低，并抑制了細胞凋亡，增加了細胞的侵襲遷移能力。這說明丙泊酚可能通過抑制HIF-1α 的表達改善缺氧誘導的HTR-8/SVneo 細胞凋亡、侵襲遷移能力下降等功能。

VEGF 基因的啟動子區(qū)域有一個HIF-1α 的結合位點，它在缺血缺氧條件下與HIF-1α 結合，誘導VEGF 的基因表達，從而誘發(fā)內(nèi)皮功能障礙［13］。MMP-9 是一種金屬蛋白酶，與妊娠早期胎盤生長和子宮重塑所需的VEGF 的釋放有關［14］。本研究表明，缺氧刺激下VEGF 表達增高，MMP-9 表達水平降低，這與之前研究一致，但是給予丙泊酚后，VEGF 表達降低，MMP-9 表達水平升高，說明丙泊酚可以調(diào)節(jié)缺氧條件下滋養(yǎng)層細胞相關蛋白的表達，改善缺氧下滋養(yǎng)層細胞的生物學功能。

綜上所述，丙泊酚可能通過上調(diào)miR-182 抑制HIF-1α 和VEGF 表達，并促進MMP-9 表達，進而改善低氧條件下滋養(yǎng)細胞的遷移和侵襲能力。本研究結果探討了丙泊酚在缺氧條件下滋養(yǎng)層細胞生物學功能改變及相關通道蛋白的變化，為子癇前期孕產(chǎn)婦圍術期用藥及預后提供了理論依據(jù)和新的思路。本研究的不足：（1）本文僅進行了體外實驗，本研究通過缺氧刺激滋養(yǎng)層細胞得到的結果不一定和臨床實際相符合，需要進一步進行臨床觀察和研究；（2）本研究沒有用動物實驗進行進一步驗證。關于丙泊酚對缺氧下滋養(yǎng)細胞的影響及其具體是通過哪些機制發(fā)揮作用，未來將在動物實驗和臨床觀察中作進一步的探索和研究。