煙霧誘導慢性阻塞性肺疾病小鼠模型合并抑郁的評估

王思懿 盧佳寧 黃慶暉

1廣州醫科大學附屬第一醫院（廣州 510140）；2呼吸疾病國家重點實驗室（廣州 510180）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmo?nary disease，COPD）是由于氣道慢性炎癥和（或）肺泡（肺氣腫）引起的慢性呼吸道癥狀，導致持續的、反復惡化的氣流阻塞［1］。COPD 發病機制復雜，主要的致病因素是接觸吸入性有害顆粒物，特別是煙草煙霧和污染物，影響各器官系統，常合并其他多種疾?。??4］，其中抑郁癥是最常見的合并癥之一。薈萃分析研究報告也顯示抑郁癥與COPD 高度相關［5?7］。有群體研究發現，煙草煙霧可能導致抑郁加重［8?9］，吸煙的抑郁癥患者比無吸煙史的患者的癥狀及認知功能受損程度更嚴重［5］。

臨床上，合并抑郁會導致COPD 患者出現體力耐受性下降，精神異常，社交情感障礙，氣促加重、呼吸困難等臨床表現，患者治療依從性更低，治療效果以及生活質量也嚴重受到影響，住院率和病死率因此上升［5，7，10］。因此，在COPD 發生發展的過程中可能伴隨著抑郁，或者COPD 的發病誘導了抑郁的發生，而抑郁又可加重COPD。兩者相互影響，相互促進，使病情不斷惡化。目前，COPD 合并抑郁的臨床意義逐漸引起重視，但其相關基礎研究較少，COPD 合并抑郁的病理生物學機制也尚不清楚。為了繼續深入開展相關研究，尋找合適的動物模型對于探究COPD 合并抑郁的復雜的發病機制至關重要。本研究在構建COPD 小鼠模型的基礎上，以行為學結果為判斷依據，探究單純的煙草煙霧慢性暴露誘導的COPD 小鼠模型是否合并發生了抑郁，為將來COPD 合并抑郁的基礎研究提供一個新的模型選擇思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性8～10 周齡的SPF 級C57 BL/6J 小鼠，浙江維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（浙）2019?0001。小鼠適應性飼養1 周，按體質量隨機分為對照組（CTL 組）、熏煙組（CS 組），每組10 只，每天定時添加糧食和水。觀察各組小鼠呼吸、毛發、活動量、食量、體質量等情況。動物飼養室為清潔級，溫度（22～24 ℃）和12/12 h 光/暗循環。該研究中動物使用及動物實驗方案均經本校實驗動物倫理委員會審核批準（編號：GY2018?010），嚴格按照國家衛生研究院《實驗動物護理與使用指南》執行。

1.2 實驗材料紅梅牌香煙，焦油量11 mg，煙氣煙堿量0.9 mg；5?HT 試劑盒，Elabscience，E?EL?0033c；IL?6 試劑盒，ThermoFisher，88?7064?88；Mouse CXCL1/KC ELISA試劑盒，Catalog NO.DY452；熏煙箱、行為學所用設備，廣州醫科大學自制；曠場實驗分析系統，EthoVision XT 14；小動物肺功能儀，美國Buxco 公司。

1.3 建立模型將CS 組小鼠置于熏煙箱內，連續暴露于煙草煙霧中建立COPD模型：香煙9支/次，上午、下午各2 次，2 h/次，每1 小時至少換氣20 min，上下午至少間隔休息3 h，6 d/周。每天煙霧暴露結束后，CS 組和CTL 組小鼠置于同一飼養室飼養。每周稱重1 次。24 周后造模結束。

1.4 肺功能檢測和行為學測試行為測試在最后一次煙草煙霧暴露24 h 后進行。行為學測試后，分別檢測CTL 組和CS 組小鼠的肺功能，驗證COPD 模型的建立；心尖采集血液樣本，收集支氣管肺泡灌洗液（BALF）和肺組織、腦組織供進一步研究。

1.4.1 曠場測試在行為學研究中往往用來做對照，以反映實驗動物的自發活動行為?？梢詫游锏淖园l活動、探索行為及焦慮、抑郁狀態進行定量評價。測試在上午安靜房間內進行。儀器敞口且四周與底部封閉，40 cm × 40 cm × 40 cm，中心區域劃分為中間20 cm × 20 cm 區域。每只小鼠單獨測試，統計5 min 內小鼠的各類活動行為。

1.4.2 懸尾測試將膠帶粘在老鼠尾巴末端1 cm處進行固定，使其頭部向下懸掛，距離地面40 cm。攝像設備記錄6 min，統計小鼠最后4 min 的累計不動時間。小鼠間斷性不動、四肢細微抖動也判定為相對靜止不動的狀態，并將其時間段納入統計。

1.4.3 肺功能檢測測試結束后的第2 天進行肺功能測試。小鼠腹腔注射1.2%阿佛丁，按體質量計算用量，0.2 mL/10 g，進行麻醉。暴露小鼠頸部中心氣管，對其鈍性分離并切開一個小口后插入連接三通開關的氣管插管，小鼠處于仰臥位狀態置于肺功能儀中，記錄各項參數值。

1.5 處理血清和BALF肺功能檢測完成后，立馬心臟采血0.7 mL 左右，室溫下靜置2 h，4 ℃3 000 r/min 離心15 min，取上清液，?80 ℃保存待測。嚴格按照5?HT 試劑盒說明書檢測小鼠血清中5?羥色胺（5?hydroxytryptamine，5?HT）的含量表達水平。暴露小鼠氣管后，插管連接1 mL 針筒勻速注入0.6 mL 生理鹽水，沖洗BALF 并盡可能多地抽回收集，反復6 次，前后3 次各自合并收集在一個EP 管里。4 ℃ 1 000 r/min 離心10 min，取上清液于?80 ℃保存，待檢測BALF 中炎癥細胞因子水平變化。

1.6 組織病理學分析取出完整的腦組織和右肺，生理鹽水清洗后置于組織固定液中固定24 h后進行脫水、包埋、切片制作石蠟切片。石蠟切片脫蠟后，肺組織石蠟切片進行蘇木精?伊紅（H&E）染色，腦組織石蠟切片進行尼氏染色。

1.6.1 鏡下觀察通過鏡下觀察與拍照小鼠肺部結構變化和炎癥浸潤程度，并隨機選取5 個視野計算肺泡平均截距。

1.6.2 尼氏染色是用堿性染料染神經組織的一種方法，尼氏體是胞質內的一種嗜堿性物質，廣泛分布于各種神經元中，用來觀察神經元內的細胞結構，了解神經元的損傷情況。鏡下觀察神經元數量及形態，采集后用Image?ProPlus 8.0 分析軟件進行分析。

1.7 統計學方法使用GraphPad Prism 8.0 軟件統計與分析實驗結果并作圖。所有數據均進行正態性檢驗，數據以±s表示，兩組間比較時采用獨立樣本t檢驗。以P< 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 煙草煙霧暴露誘導小鼠體重長勢緩慢與CTL 組相比，CS 組體質量增長更緩慢（P< 0.001），見圖1A；整個造模過程，CTL 組小鼠體重增加量大于CS 組（P< 0.001），見圖1B。

圖1 小鼠體質量變化Fig.1 Changes in body weight in mice

2.2 煙草煙霧暴露誘導小鼠肺功能下降通過肺功能測試來評估COPD 小鼠模型是否構建成功。CS組的功能殘氣量（FRC）、用力肺活量（FVC）均大于CTL 組（P< 0.001），見圖2A?B；CTL 組的20 毫秒率（FEV20/FVC）和50 毫秒率（FEV50/FVC）均大于CS 組（P< 0.05），見圖2C?D。肺功能結果符合COPD 小鼠典型表現。

圖2 CS 暴露對肺功能的影響Fig.2 Effects of tobacco smoke exposure on lung function

2.3 煙草煙霧暴露誘導小鼠出現肺氣腫及氣道炎癥CTL 組小鼠肺泡結構完整，肺泡壁正常，肺泡間隔未見明顯炎癥細胞浸潤，無明顯病理性損傷改變。CS 組小鼠肺泡結構破壞，肺泡大小不一，肺泡間隔斷裂，肺泡融合，肺泡腔擴大，肺泡間隔及肺泡腔內有較多的炎性細胞，為典型COPD病理學損傷性改變，見圖3A。與CTL 組相比，CS組小鼠支氣管管壁增厚，管腔變窄，氣道上皮細胞受損脫落，黏膜下及管壁均可見較多炎性細胞浸潤，見圖3B。平均肺泡截距統計顯示，CS 組小鼠平均肺泡截距較CTL 組小鼠明顯增大（P< 0.001），見圖3C。

圖3 CS 暴露對小鼠肺泡及氣道的影響（HE，200 ×）Fig.3 Effects of tobacco smoke exposure on alveoli and airway in mice（HE，200 ×）

2.4 煙草煙霧暴露誘導小鼠BALF 中炎癥因子增加CS 組BALF 中IL?6（P< 0.01）和KC（P< 0.001）含量均高于CTL 組，見圖4。

圖4 CS 暴露對小鼠BALF 中炎癥因子表達的影響Fig.4 Effect of tobacco smoke exposure on expression of inflammatory cytokines in BALF in mice

2.5 煙草煙霧暴露誘導小鼠出現抑郁樣表現曠場測試中，CS組運動總路程、進入中央區次數、中央區滯留時間均小于CTL 組（P< 0.05），見圖5A?C；懸尾測試中，CS組不動時間大于CTL組（P< 0.05），見圖5D。CS 組血清中5?HT 水平低于CTL 組（P<0.001），見圖5E。

圖5 CS 暴露對行為學及血清中5?HT 水平的影響Fig.5 Effects of tobacco smoke exposure on behavioral and 5?HT levels in serum

2.6 煙草煙霧暴露誘導小鼠腦組織出現病理改變腦組織尼氏染色結果顯示，CTL 組神經細胞保留原有形態，細胞核充實飽滿，核仁清晰可見，呈圓形或橢圓形，CS 組神經細胞空泡化，細胞核消失，神經元固縮，著色變深，見圖6A?B；與CTL 組相比，CS 組大腦皮質神經元損傷增加，見圖6A?B；CS 組大腦皮質受損神經元數/神經元總數大于CTL 組（P< 0.001），見圖6C；CS 組海馬CA3 區受損神經元數/神經元總數大于CTL 組（P< 0.01），見圖6D。

圖6 CS 暴露對腦組織及細胞的影響（尼氏染色，400 ×）Fig.6 Effects of tobacco smoke exposure on brain tissue and cells（Nissl staining，400 ×）

3 討論

抑郁癥作為一種常見的危及生命的精神疾病，是社會的巨大負擔［6］。近年來各方面的壓力及其他因素導致抑郁癥發病率逐年上升，預計到2030 年抑郁癥將成為世界第一負擔疾病［11］。抑郁癥是COPD 患者普遍存在的心理健康問題，也是COPD 病情進展甚至惡化的危險因素之一，嚴重影響患者的生活質量，導致COPD 病死率不斷上升［12］。煙草煙霧在COPD 和抑郁的發生發展中占主導地位［13］。多項研究表明，伴有抑郁病史的COPD 患者身體機能較差，健康狀況受損嚴重，急性加重的情況更為多見［10］。2022 年一項基于英國人群的調查發現，與無COPD 的受試者相比（5.7；95%CI：5.5～5.8），每年COPD 患者每1 000 人的抑郁癥發病率更高（11.4；95%CI：10.9～11.8）（P<0.001）［14］。建立合格的COPD 合并抑郁小鼠模型是研究成功的第一步。

既往研究采用曠場實驗和懸尾實驗來評價動物的運動行為、反映動物活動度情況及對新環境的探索欲，這兩個測試均為抑郁癥研究最常用的行為學測試，作為抑郁證模型是否成模的判斷方法。以小鼠曠場實驗靜止不動時間增加與曠場運動總路程、進入中央區次數、中央區滯留時間降低為判斷造模成功的主要依據［15?16］。本研究結果顯示，煙草煙霧慢性暴露影響了小鼠的行為學特性，小鼠對環境的探索欲和活動能力顯著降低，靜止不動時間增加，反映了行為絕望狀態的增加，與臨床上的抑郁癥表現相似［14，17］。小鼠腦組織的病理切片結果顯示，CS 組小鼠皮質和海馬區受損的神經元數量顯著增加，說明煙草煙霧引起皮質和海馬區損傷［18］。單胺遞質不足是抑郁癥發病的原因之一［19-20］，因此5?HT 常作為抑郁癥評價的研究指標之一。本研究檢測到煙草煙霧暴露后顯著降低了小鼠血清中5?HT 含量水平，輔助證明了COPD小鼠合并抑郁的發生。長期的煙草煙霧暴露可誘發COPD 慢性全身性炎癥，肺功能下降，增加體內炎癥因子水平。本研究結果顯示，相較于CTL 組，CS 組小鼠的FRC、FVC 上升，20 毫秒率、50 毫秒率降低，表現出肺部炎癥加重，支氣管及其周圍炎癥細胞浸潤增多，肺組織肺泡間隙增加，血清中促炎細胞因子IL?6、KC 含量水平升高。以上表征說明，單純的煙草煙霧慢性暴露成功誘導了小鼠慢性阻塞性肺疾病模型，并且在此過程小鼠合并發生了抑郁。

有研究［21］建立COPD 合并抑郁障礙大鼠模型采取多因素造模法：在第1、14 天氣管內滴注脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），其余26 d 每天煙霧暴露1 h，每天熏煙后隨機給予一種應激刺激。LPS在動物實驗中常被廣泛用來構建抑郁模型［22-23］，引起中樞的神經炎癥反應，炎性細胞因子的升高，小鼠抑郁樣行為和認知改變，因此LPS 本身也被視作是抑郁癥的致病因素之一［24-26］，這就造成與臨床COPD 合并抑郁的成因不符。本研究選擇單因素的造模方式，是構建小鼠COPD 模型的經典方法，但通過該法發現，單純煙草煙霧慢性暴露建立COPD小鼠模型，證實了在COPD造模過程中，合并抑郁的發生，排除了LPS 及其他應激刺激的干擾，設計更為合理，較好模擬了臨床上COPD 合并抑郁的主要發病因素和臨床特征［27-31］。雖然單因素造模的干擾項少，但實驗時間跨度較長，造模過程中偶有死亡等意外情況發生，為了減少影響，在保證動物數量達到統計學差異的基礎上，可以考慮增加動物的數量，并探索更科學、更全面的新技術進行方法學改良，為以后COPD 合并抑郁的機制研究提供更好的選擇與依據。

綜上所述，單純的煙草煙霧慢性暴露誘導的COPD 小鼠模型在疾病的發生發展過程中合并發生了抑郁，由此推斷，該模型可以作為COPD 合并抑郁研究合理的動物模型備選方案之一。此外，本研究僅僅討論了煙草煙霧誘導COPD 小鼠合并抑郁模型的建立以及小鼠腦中神經細胞發生改變，煙草煙霧對小鼠腦組織產生影響的具體機制、細胞分子水平的作用靶點等方面尚不清楚，還需進一步研究。