基于SRAP分子標記的春大豆雜交種核心親本雜種優勢群劃分

韓博文 姜 楠 楊緒磊 林春晶 彭 寶 趙麗梅 吳松權 張春寶*

(1.延邊大學 農學院,吉林 延吉 133002;2.吉林省農業科學院 大豆研究所/農業農村部雜交大豆育種重點實驗室,長春 130033)

大豆(Glycinemax(L.) merr.)是我國重要的油料、糧食及飼料作物,營養價值豐富,應用領域廣闊[1]。隨著近年來社會經濟的高速發展,我國對大豆的需求日益增高,然而國內大豆種植面積和產量均有所下降,嚴重依賴國外進口。根據海關總署公開數據,2020年,我國大豆進口量首次突破1億t;2022年中央一號文件提出加力擴種大豆油料,這使得大豆種植面積創下了1958年以來新高,進口量降至9 108萬t,但我國大豆對外依存度仍然在80%以上的高位。由于我國耕地資源有限,提高單位面積產量是提升大豆產能的有效出路。雜種優勢利用是快速提高作物單產的有效途徑,已在水稻、玉米、高粱和棉花等多種作物的品種選育中獲得成功[2-4]。大豆同樣具有較強的雜種優勢,開展雜交大豆方面的研究對于提升大豆單產具有重要意義。我國從20世紀八十年代就開始大豆雜種優勢利用研究,于2002年審定了世界上第一個大豆雜交種‘雜交豆1號’,在區域試驗中較對照平均增產21.9%[5],目前已審定的雜交大豆品種近40個,區試增產幅度達5.3%～22.7%,大豆雜種優勢的利用對增產效果明顯[6]。

親本資源是雜交種選育的基礎,然而在眾多材料中選擇適合的親本并配制強優勢雜交組合,是雜交種選育考慮的首要問題,關系到其產出效率[7]。雜種優勢群理論由Melchinger等[8]提出,指來自相同或不同群體的一組相關或不相關基因型,當與其他遺傳背景不同的種質群的基因型雜交時,能表現出相似的配合力和雜種優勢。雜種優勢群理論已在玉米、油菜和小麥等作物中被廣泛應用[9-11],其主要劃分方法有表型聚類分群法、配合力分群法、分子標記聚類分群法等[12]。白志元等[13]利用64對SSR分子標記將68份雜交大豆親本中的恢復系和保持系分別聚為兩大類5個亞類,并發現聚類結果與地理來源具有一定相關性。雷蕾等[14]利用14個產量性狀相關SSR分子標記將30個已審定雜交大豆品種的43份親本分為2個類群,其中25個雜交種的親本分屬于2個類群。

SRAP分子標記技術能準確地分析大豆材料的遺傳多樣性和親緣關系,但利用其對雜交大豆親本進行優勢群的劃分鮮見報道。本研究利用條帶清晰、多態性好的12對SRAP分子標記組合,對東北三省春大豆區育成的100份核心親本進行遺傳多樣性評價和親緣關系劃分,并利用已審定的10個強優勢雜交種的親本進行雜種優勢群驗證,旨在明確雜交大豆核心親本的遺傳多樣性特點及群體結構,以期為春大豆雜交種親本的遺傳改良及雜交組合配制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1植物材料

所用材料包括來源于中國(東北三省)、美國和意大利的49份不育系的同型保持系與51份恢復系,共100份雜交大豆親本材料(表1),均為吉林省農業科學院雜交大豆研究團隊選育及保存。所有試驗材料種植于吉林省長春市范家屯鎮雜交大豆核心育種基地(124°83′ E, 43°43′ N)。

1.1.2SRAP引物

使用8個正向引物和6個反向引物(表2),共計48種組合,通過前期篩選獲得條帶清晰,多態性好的12種組合。本研究利用上述引物組合進行100份親本材料的多態性分析。

1.2 試驗方法

1.2.1DNA提取和PCR

從田間剪取親本材料的二節期(V2)葉片,共100份,液氮研磨后,使用CTAB法[21]提取DNA。經0.8%瓊脂糖凝膠檢驗,條帶清晰無拖尾,符合SRAP試驗要求,置于-20 ℃冰箱保存備用。利用12種SRAP引物(表3)組合對親本DNA進行PCR擴增,PCR反應體系為25 μL,其中DNA 模板2.0 μL,正向反向引物各0.5 μL(10 μmol/L),dNTPs 0.5 μL(10 mmol/L,北京鼎國),10×PCR buffer 2.5 μL(北京鼎國),Taq酶0.5 μL(2 U/μL,北京鼎國),ddH2O 18.5 μL。DNA擴增程序:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min,35 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,5個循環;94 ℃變性1 min,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,35個循環;72 ℃延伸10 min。利用4%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測后,使用ABI PRISM 377 sequencer測序儀檢測SPAP多態性結果,通過GENESCAN軟件進行分析,在70～500 bp片段的DNA Marker范圍內,每2個堿基讀數1次,并記錄最終條帶數據。

表3 SRAP分子標記多態性分析結果Table 3 SRAP molecular marker polymorphism analysis results

1.2.2數據處理

雙邊匹配是研究由不可分對象構成的兩不相交集合中主體的相互匹配過程，起源于Gale等[1]對學生入學和婚姻匹配問題的研究，該文開啟了雙邊匹配研究的先河，奠定了雙邊匹配的理論基石。現實社會中存在著大量的雙邊匹配問題，如勞動力市場中的員工與崗位匹配[2]、金融市場中的風險投資匹配[3]、電子商務中的買賣交易匹配[4]、供應鏈管理[5]及知識服務[6]中的供需匹配等。由此可見，深入研究雙邊匹配問題具有十分重要的理論意義和實際應用價值。

對原始數據進行處理,將有條帶的位點標記為1,無條帶的位點標記為0,轉化為0、1矩陣。使用NTsys2.10e軟件,計算遺傳相似系數(genetic similarity,GS),利用算術平均非加權方法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)對親本材料進行聚類分析,獲得聚類樹狀圖。利用Popgene 32軟件計算每個標記的多態性信息含量(polymorphism information content,PIC),公式如下:

式中:Pi為群體中含有第i個等位變異的比例。主效基因頻率(major alle frequency,MAF)、有效等位基因數(Effective number of alleles,Ne)、基因多樣性指數(gene diversity,h)、Shannon信息指數(Shannon’s Information index,I)。根據SRAP標記對100份親本材料分析得到的遺傳相似系數及分群結果,利用R語言ggplot 2作主坐標分析(principal co-ordinates analysis,PCoA),最終將各點PCoA結果坐標繪制在二維平面上,制成散點圖。

2 結果與分析

2.1 SRAP分子標記多態性分析

利用12對多態性較好的引物組合,包括Me 1×Em 3、Me 1×Em 5、Me 2×Em 3、Me 2×Em 7、Me 3×Em 3、Me 4×Em 4、Me 5×Em 1、Me 5×Em 8、Me 6×Em 4、Me 6×Em 8、Me 7×Em 5和Me 8×Em 1,對49份保持系和51份恢復系進行多態性分析(表3)。通過檢測,共擴增出2 135條條帶,其中多態性條帶2 130條,每對引物組合擴增出的多態性譜帶數為137～204條,平均為178條,多態性位點百分率平均值高達99.76%,PIC含量范圍在0.074 0～0.153 7,平均值為0.125 7,按照Botstein等[22]的標準,PIC<0.25表明SRAP分子標記攜帶信息量較少,100份親本材料間遺傳差異較大。

2.2 100份親本的聚類分析

由表4可知,100份雜交大豆親本材料間的GS在0.329 2～0.637 6,平均GS為0.473 3。GS最小的是來自黑龍江的JLCMS112B和美國材料JLCMS164B,GS最大的是來自美國的JLR60和JLR1。

由圖1可知,在GS為0.450 0處可劃分為I和II兩大類群,在GS為0.460 0處,類群I可劃分為2個亞群I-1和I-2,在GS為0.480 0處,類群II可劃分為II-1和II-2亞群。第I類群全部為保持系,共49份材料,其亞群I-1中有20個保持系,群體樣本數最少,主要以中國東北背景為主,包括有JLCMS103B、JLCMS91B、JLCMS188B、JLCMS9B等17個保持系,僅含JLCMS42B、JLCMS101B、JLCMS171B這3個美國背景的保持系;亞群I-2中有29份保持系,包括中國東北的JLCMS185B、JLCMS48B、JLCMS84B等20份保持系以及美國來源的JLCMS199B、JLCMS181B、JLCMS176B等10份保持系。51份恢復系全部被劃入第II類群,其中亞群II-1有26份恢復系,包括JLR522、JLR531、JLR12等20個來源美國的恢復系,JLR194、JLR192、JLR22等6份來源中國東北的恢復系;亞群II-2有25份恢復系,包括JLR46、JLR119、JLR107等來源美國的恢復系12份,來源意大利的1份為JLR8,來源中國東北的有10份,包括JLR210、JLR547、JLR209等。

GS為0.460 0處的綠色虛線將類群Ⅰ劃分為Ⅰ-1和Ⅰ-2兩個亞群; GS為0.480 0處的紅色虛線將類群Ⅱ劃分為Ⅱ-1和Ⅱ-2兩個亞群。The green dotted line at GS 0.460 0 divides group I into two subgroups, I-1 and I-2; The red dotted line at GS 0.4800 divides Group II into two subgroups, II-1 and II-2.圖1 SRAP標記對親本材料的UPGMA聚類分析Fig.1 UPGMA cluster analysis of SRAP markers on parent materials

2.3 強優勢雜交種親本的群內驗證

由表5可知,所有母本保持系均來自于類群I,其中3份母本劃入亞群I-1,4份母本劃入亞群I-2;所有父本恢復系都被劃入類群II,其中3份父本劃入亞群II-1,3份父本劃入亞群II-2,表明10個強優勢雜交種的13份親本均來自本研究劃分的兩大類群。進一步對親本來源地信息進行分析發現,所有母本均來源于中國東北的黑龍江和吉林;而所有父本的來源地均為國外,分別是美國和意大利。上述結果表明,10個強優勢雜交種親本均來自于本研究所劃分的2個類群,且為中國(♀)×外國(♂)組合,說明通過SRAP分子標記劃分的雜種優勢類群結果與地理來源分布基本一致,且不同來源地之間選配有助于充分發揮大豆雜種優勢。從親本間遺傳相似程度分析發現,13份雜交種親本的遺傳相似性差異較大,GS在0.387 9～0.507 5,說明強優勢雜交種親本間遺傳多樣性較為豐富。

表5 已審定的10個強優勢雜交種的分群結果Table 5 Group division results of 10 released strong heterosis hybrids

2.4 100份親本的遺傳多樣性分析

由表6可知,總群的主效基因頻率(MAF)均值為0.927 0,類群I的MAF為0.927 5,其中亞群I-1的MAF為0.926 1,亞群I-2的MAF為0.928 4;類群II的MAF為0.926 6,其中亞群II-1的MAF為0.931 0,亞群II-2的MAF為0.921 7。相較于類群和亞群間的MAF差異不大?？側旱挠行У任换驍?Ne)為1.156 9,類群I的Ne為1.115 7,其中亞群I-1的Ne為1.159 1,亞群I-2的Ne為1.153 8;類群II的Ne為1.158 2,其中亞群II-1的Ne為1.158 2,亞群II-2的Ne為1.169 3。類群Ⅱ的Ne高于類群Ⅰ,亞群I-1和亞群II-2的等位變異數更高?？側旱幕蚨鄻有灾笖?h)為0.135 1,其中類群I的h為0.134 1,其亞群I-1和I-2的h分別為0.136 4和0.132 3;類群II的h為0.135 0,其亞群II-1和II-2的h為分別為0.126 7和0.143 8。類群Ⅰ和Ⅱ的總體基因多樣性相似,其中亞群II-2的基因多樣性豐度高于II-1?？側篒的h為0.260 2,其中類群I的h為0.258 6,其亞群I-1和I-2的h分別為0.261 6和0.255 5;類群II的I為0.260 0,其亞群II-1和II-2的I分別為0.244 3和0.272 6。類群間的I無顯著差異,亞群I-1和II-2的物種多樣性豐度大于亞群I-2和II-1?？側憾鄳B信息量(PIC)為0.126 2,其中類群I的PIC為0.125 4,其亞群I-1和I-2的PIC分別為0.127 5和0.124 1;類群II的PIC為0.126 8,其亞群II-1和II-2的PIC分別為0.120 2和0.133 9。表明類群I與類群II存在較豐富的遺傳多樣性,4個亞群中,亞群I-1的遺傳多樣性豐度大于亞群I-2;亞群II-2的遺傳多樣性豐度則大于亞群II-1。

表6 不同群內親本材料的遺傳多樣性分析Table 6 Genetic diversity analysis in different populations of parent material

由圖2可知,主坐標1(Pco1)和主坐標2(PCo2)分別解釋了38.29%和19.96%的群體遺傳變異。通過Pco1坐標結果對100份親本劃分的4個亞群進行分析,其中亞群I-1和I-2重疊位于PCo1為-0.06～0.01,表明2個亞群間可能存在遺傳親緣的交叉。亞群II-1和II-2重疊位于Pco1在0.00～0.04,2個亞群間遺傳親緣的交叉更為顯著。這表明雜交大豆親本在改良過程中,存在同一類群內的不同亞群間親緣混合的情況。類群Ⅰ與類群Ⅱ的遺傳分布之間幾乎沒有重合,說明2個類群間遺傳親緣存在差距,并且類群Ⅰ的2個亞群的遺傳距離分布范圍更廣,散點密集度較小,證明類群Ⅰ的遺傳資源更為豐富。

圖2 100份核心親本材料主坐標分析Fig.2 Principal co-ordinate analysis of one hundred core parent materials

3 討 論

3.1 雜交大豆親本遺傳多樣性

本研究利用SRAP分子標記根據遺傳相似系數對100份雜交大豆親本材料進行了聚類分析,并劃分了兩大類群,即主要由中國東北保持系材料構成的類群I和主要來源于美國恢復系材料的類群II;每個類群還可進一步劃分為2個亞群。從來源地來看,盡管類群I包含的材料主要來自中國東北,但也有部分美國材料;類群II主要來自美國,但同樣也有部分中國東北材料。李瓊等[23]對黃淮海50份大豆資源的SSR分子標記分析發現,大豆類群的形成與其來源地地理環境與生態類型相關。徐澤俊[24]對303份大豆種質進行聚類分析發現,同一來源地的種質不一定全都聚為一個群。造成上述情況的原因可能是由于中國是大豆原產國,早期由于資源外流,國外大豆親本的先祖源于我國,而我國近幾十年來對國外資源的引進及雜交利用,使得部分優異材料混有國外遺傳背景。本研究所用親本基本上符合按不同來源地劃分類群,但在亞群的劃分并沒有按地理來源而細化成諸如黑龍江省亞群或吉林省亞群,表明東北大豆材料遺傳關系較近。這與張振宇[25]對50份東北大豆骨干親本基于聚類分析結果顯示東北大豆材料間遺傳同源性較大,遺傳差異較小的結論相一致。

3.2 大豆雜種優勢群的驗證及利用

在本研究中,100份大豆親本之間的GS在0.329 2～0.637 6,R2為0.473 3,于0.450 0處劃分為2個類群,又在遺傳相似系數0.460 0和0.480 0處分別劃分為2個亞群。這與白志元等[13]基于SSR引物將68個大豆品種根據分析得出的GS聚類分析,將材料劃分為兩大類5個亞類的結果相似。雷蕾等[14]通過SSR標記將已審定強優勢大豆雜交種的親本劃分為來源于中國東北與國外材料的2個大群,且GS在0.400 0～0.600 0時,雜種優勢利用程度較高。本研究所分析的10個強優勢雜交種的13份親本同樣是分別來自于中國×外國組合,其GS在0.387 9～0.507 5,表明利用SSR標記和SRAP標記均可較為明確的劃分大豆雜種優勢群,且能得出相近的試驗結果;同時發現,目前已育成的強優勢雜交種的親本組合并非遺傳相似系數越小越好,與Moll等[26]提出的雜交種親本不應超過最佳遺傳距離的結論相符。然而Boeven等[27]對1 903個小麥雜交組合的分析發現,其雜種優勢隨著親本遺傳距離的增加而穩步增加。因此,后續需要配制更多的雜交組合,獲得更多的產量數據,結合親本間的GS數據,更加全面的評估大豆雜種優勢與親本間遺傳距離的相關性。

4 結 論

1)SRAP標記共擴增出2 135條條帶,其中多態性條帶2 130條,多態性位點占比99.76%,每對引物組合擴增出的多態性譜帶數為137～204條,平均為178條,引物的多態性信息含量(PIC)范圍在0.074 0～0.153 7,平均值為0.125 7。

2)根據遺傳相似系數于0.450 0處劃分為2個類群,在遺傳相似系數0.460 0處將類群Ⅰ劃分2個亞群,又在遺傳相似系數0.480 0處將類群Ⅱ劃分2個亞群,并將保持系且主要來源于中國東北的材料劃分為類群Ⅰ,恢復系且主要來源于美國的材料劃分為類群Ⅱ。

3)通過對10個已審定強優勢雜交種的13個親本進行分析發現,雜交種親本間的遺傳相似性多分布在0.329 2～0.637 6;其中類群Ⅰ的中國東北材料與類群Ⅱ的國外材料之間雜交配制的組合存在較強的雜種優勢。

4)對不同群內親本材料的遺傳多樣性分析發現,類群I與Ⅱ的遺傳多樣性相似度較高,4個亞群中的亞群Ⅰ-1和Ⅱ-2遺傳多樣性高于亞群Ⅰ-2和Ⅱ-1;通過主坐標分析,同樣將親本劃分為2個類群,驗證了聚類分析結果,且類群Ⅰ的2個亞群存在較為豐富的遺傳多樣性。