免疫增強劑CVC1302誘導高親和力抗體機制分析

杜露平 魯海燕 侯立婷 于曉明 程海衛 張元鵬 陳 瑾 鄭其升 甘 芳

(1.南京農業大學 動物醫學院,南京 210095;2.江蘇省農業科學院 動物免疫工程研究所/國家獸用生物制品工程中心/江蘇省食品質量安全重點實驗室,南京 210014;3.獸用生物制品(泰州)國泰技術創新中心,江蘇 泰州 225300)

機體在感染或者免疫后,生發中心(GC) B細胞在濾泡輔助性T細胞(Tfh)的陽性選擇下,僅有高親和力的GC B細胞可轉化為漿母細胞,中親和力GC B細胞進入下一輪增殖循環以提高親和力,低親和力GC B細胞則面臨凋亡被巨噬細胞捕獲[1]。生發中心在生理結構上分為明區和暗區2個區域。在暗區,GC B細胞密集并可迅速分裂增殖,且依賴于表達的誘導活化的胞苷脫氨酶(AID)進行體細胞高頻突變(SHM),親和力成熟[2-3]。在明區,GC B細胞識別結合濾泡樹突狀細胞(FDC)攜帶的抗原抗體復合物,處理后經由主要組織相容性復合物Ⅱ(MHCⅡ)遞呈至Tfh,Tfh通過結合的抗原量區分表達高/低親和力BCR的GC B細胞,由此篩選出高親和力GC B細胞,分化為漿母細胞[4-6],漿細胞隨著血液循環轉移至骨髓,持續性分泌高親和力抗體。AID特異性表達在外周淋巴器官GC B細胞中[7],在胞漿中表達后,轉運至細胞核,使免疫球蛋白基因發生類別轉換(CSR)和體細胞高頻突變(SHM)[8]。其中SHM主要發生于生發中心暗區,AID使抗體可變區V(D)J發生點突變,使得BCR對抗原具有高的親和力[9-10]。AID基因(Aicda)包含4個不同區域(Ⅰ到Ⅳ),其中區域Ⅰ為啟動子區[11],研究發現TLR激動劑作用于GC B細胞,激活NF-κB通路,進而誘導HoxC4表達,通過增強AID啟動子活性促進AID表達[12-13]。

免疫增強劑CVC1302由Toll樣受體與NOD樣受體激動劑復配組成。研究發現,免疫增強劑CVC1302配伍NP-OVA模式抗原免疫小鼠,利用BSA上載有不同比例的NP(4-羥基-3-硝基苯乙?；?可檢測機體誘導產生的高親和力/總親和力NP抗體水平,檢測發現CVC1302可誘導小鼠產生顯著提升的高親和力NP特異性抗體水平[14-16]。

因此,本研究旨在驗證CVC1302促進 AID表達提高GC B細胞的親和力進而使得大部分GC B細胞轉化為漿母細胞,從而誘導持續久、親和力高的抗體以為機體提供體液免疫保護,為后續新型免疫增強劑的研制提供理論基礎和研究思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

6周齡BALB/c雌性小鼠購自揚州大學比較醫學中心;NP-OVA、NP1-BSA和NP15-BSA購自美國Bioscience Technologies公司;免疫增強劑CVC1302組分(單磷酰脂質A(MPLA)購自北京邦定生物醫學公司;胞壁酰二肽(MDP)購自上海瀚泓科技有限公司;β-葡聚糖購自河北克隆多生物科技有限公司);MontanideTM-ISA206購自上海Seppic賽彼科特殊化學品有限公司;Trizol試劑和qPCR mix購自上海皓嘉科技發展有限公司;熒光抗體anti-B220 FITC、anti-GL-7 PE-vio770、anti-AID和rabbit anti rat IgG-APC均購自上海優寧維生物科技股份有限公司;rabbit anti rat IgG-HRP購自武漢博士德生物科技有限公司;ECL發光試劑盒購自諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1免疫抗原制備

按照參照文獻[14]制備方法分別制備疫苗,首先將MPLA、MDP和β-葡聚糖按照一定比例溶于蒸餾水中,制備免疫增強劑CVC1302,再與NP-OVA(4-羥基-3-硝基苯乙?；盥撾u卵白蛋白)按照體積比1∶50混合后得到水相,最后與ISA206按照體積比1∶1進行乳化,制備獲得疫苗NP-CVC1302-ISA206,最終每100 μL免疫抗原中含有50 μg NP-OVA和1 μL CVC1302。

1.2.2小鼠免疫試驗

將6周齡BALB/c雌性小鼠15只隨機均分為3組,分別于后腿肌肉接種NP、NP-ISA206和NP-CVC1302-ISA206,每只100 μL。利用NP1-BSA或NP15-BSA(NP載量不同)包被的ELISA板分別檢測小鼠免疫后28 d血清中高親和力NP(NP1)及總NP(NP15)特異性抗體水平。

將6周齡BALB/c雌性小鼠21只隨機分為3組,分別于后腿肌肉接種NP、NP-ISA206和NP-CVC1302-ISA206,每只100 μL。免疫后14 d,分離小鼠腹股溝淋巴結制備單個淋巴細胞,流式分選儀分選獲得GC B細胞,使用Trizol試劑提取RNA,利用real-time PCR分析GC B細胞中AID和HoxC4基因轉錄水平。

將6周齡BALB/c雌性小鼠9只隨機分為3組,分別于后腿肌肉接種NP、NP-ISA206和NP-CVC1302-ISA206,每只100 μL。免疫后14 d,分離小鼠腹股溝淋巴結制備單個淋巴細胞,流式檢測NP特異性GC B細胞占B細胞比例和GC B細胞AID表達水平。

1.2.3ELISA檢測小鼠NP特異性抗體水平

利用NP1-BSA或NP15-BSA包被的ELISA板分別檢測小鼠免疫后28 d血清中高親和力NP(NP1)及總NP(NP15)特異性抗體水平。檢測方法參照文獻[17-18]:NP1-BSA或NP15-BSA(每孔0.5 μg)包被96孔酶標板,4 ℃孵育過夜,PBST洗滌后每孔加入100 μL待檢小鼠血清(1∶200稀釋),37 ℃孵育60 min;PBST洗滌后每孔加入100 μL羊抗鼠HRP-IgG (1∶10 000稀釋),37 ℃孵育60 min;PBST洗滌后每孔加入100 μL TMB底物顯色液,37 ℃避光孵育10 min;最后每孔加入100 μL 1 mol/L H2SO4終止液終止反應,用酶標儀測定OD450值。

1.3 流式檢測NP特異性GC B細胞水平

1.3.1小鼠腹股溝淋巴結單個淋巴細胞制備

免疫后14 d分別收集小鼠腹股溝淋巴結,參照文獻[19],含100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的預冷PBS緩沖液沖洗4～6次,用眼科剪將其剪成約1 mm3的碎塊,隨后利用Medimachine系統(美國BD公司)制備單個淋巴細胞。

1.3.2流式檢測NP特異性GC B細胞數目

取1×106制備的小鼠腹股溝淋巴結單個淋巴細胞于1.5 mL離心管中,利用核內細胞因子染色試劑盒對細胞進行破膜固定,然后用anti-B220 APC、anti-GL-7 PE-vio770、NP-Biotion 和Streptavidin-FITC進行染色,再用BD Accuri C6流式細胞儀檢測NP特異性GC B細胞,比較各組間NP特異性GC B 細胞比例,分析GC B細胞增殖水平。

1.3.3流式檢測GC B細胞AID表達

取1×106制備的小鼠腹股溝淋巴結單個淋巴細胞于1.5 mL離心管中,利用核內細胞因子染色試劑盒對細胞進行破膜固定,然后用anti-B220 FITC、anti-GL-7 PE-vio770、anti-AID和rabbit anti rat IgG-APC進行染色,再用BD Accuri C6流式細胞儀檢測GC B細胞AID表達水平,比較GC B細胞中AID平均熒光強度(MFI)。

1.4 Real-time PCR檢測GC B細胞AID和HoxC4轉錄水平

取相同數目分選的GC B細胞用Trizol提取RNA,real-time PCR檢測AID和HoxC4轉錄水平,以β-actin作為內參基因,其中β-actin、AID和HoxC4相對應引物見表1。

表1 本研究用引物對序列Table 1 Sequences of primers used in the study

1.5 統計分析

本研究中所用數據均用平均值±標準差表示。利用Graph Prism軟件對數據進行處理分析,各組之間的差異性通過ANOVA分析,兩組之間的差異利用t檢測評估。其中P>0.05表示差異不顯著,P<0.05表示差異顯著,P<0.01、P<0.001和P<0.000 1表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 CVC1302對小鼠抗體親和力的影響

免疫后28 d采集分離制備小鼠血清,利用NP1-BSA 或NP15-BSA包被的ELISA板分別檢測小鼠高NP特異性抗體水平和總親和力NP特異性抗體水平。由圖1可知,NP-ISA206和NP-CVC1302-ISA206組小鼠血清總NP(NP15)及高親和力NP(NP1)特異性抗體水平差異均極顯著(P<0.0001,圖1(a)),通過比較NP-CVC1302-ISA206和NP-ISA206兩組間NP1/NP15比值,發現血清在同一稀釋度下,NP-CVC1302-ISA206組中高親和力NP(NP1)特異性抗體所占比例顯著高于NP-ISA206組(P<0.01,圖1(b))。結果表明,CVC1302可以誘導機體產生高親和力的抗體,且高親和力抗體比例顯著升高。

(a)NP特異性抗體水平;(b)NP1OD450/NP15OD450。(a) Levels of NP-specific antibodies; (b) Ratio of OD450 between NP1 and NP15. *代表組間差異顯著(P<0.05);**、***、****,代表組間差異極顯著(P<0.01、P<0.001、P<0.000 1)。下同。* represent significant differences between groups (P<0.05), and **, ***, **** represent extremely significant differences between groups (P<0.01, P<0.001, P<0.000 1). The same as below.圖1 CVC1302誘導高親和力NP特異性抗體Fig.1 Induction of induced high-affinity NP-specific antibodies for CVC1302

2.2 CVC1302對GC B細胞增殖的影響

免疫后14 d,取腹股溝淋巴結,制備單個淋巴細胞,利用流式檢測分析NP特異性GC B 細胞占B細胞比例。由圖2可見,NP-CVC1302-ISA206組小鼠NP特異性GC B細胞占B細胞比例高達17.77%,與NP-ISA206組小鼠(14.2%)相比,差異顯著(P<0.01)。結果表明,CVC1302可顯著促進GC B細胞的增殖。

圖2 CVC1302增加抗原特異性GC B細胞比例Fig.2 The enhancement of the percentage of antigen-specific GC B cells for CVC1302

2.3 CVC1302對GC B細胞中AID基因轉錄的影響

免疫后14 d,取腹股溝淋巴結,制備單個淋巴細胞,流式分選獲得GC B細胞,取1×106個細胞利用Trizol提取RNA,real-time PCR檢測各組GC B細胞AIDmRNA轉錄水平。由圖3可見, NP-CVC1302-ISA206組GC B細胞AID基因相對轉錄水平為7.02,NP-ISA206組AID基因相對轉錄水平為3.23,2組之間差異均顯著(P<0.01)。結果表明,CVC1302可顯著提高GC B細胞中AID基因的轉錄水平。

圖3 CVC1302促進GC B細胞AID基因轉錄Fig.3 The enhancement of the transcriptional levels of AID in GC B cells for CVC1302

2.4 CVC1302對GC B細胞中AID表達的影響

免疫后14 d,取腹股溝淋巴結,制備單個淋巴細胞,流式細胞術分析GC B細胞AID表達水平。由圖4可知,NP-CVC1302-ISA206組GC B細胞AID平均熒光強度顯著高于NP-ISA206組(P<0.05),CVC1302可顯著提高GC B細胞中AID的表達水平。

(a) GC B細胞AID MFI流式圖;(b)GC B細胞AID MFI柱式圖。(a) The flow diagram of MFI of AID in GC B cells; (b) The bar chart of MFI of AID in GCB cells.圖4 CVC1302促進GC B細胞中AID的表達Fig.4 The enhancement of the mean fluorescence intensity of AID in GC B cells for CVC1302

2.5 CVC1302對GC B細胞中HoxC4轉錄的影響

免疫后14 d,取腹股溝淋巴結,制備單個淋巴細胞,流式分選獲得GC B細胞,取1×106個細胞利用Trizol提取RNA,real-time PCR檢測各組GC B細胞HoxC4mRNA轉錄水平。由圖5可見,NP-CVC1302-ISA206組GC B細胞HoxC4基因相對轉錄水平為4.03,NP-ISA206組HoxC4基因相對轉錄水平為1.53,2組之間差異極顯著(P<0.001)。結果表明,CVC1302可顯著提高GC B細胞中HoxC4基因的轉錄水平。

圖5 CVC1302促進GC B細胞HoxC4基因轉錄Fig.5 The enhancement of the transcriptional levels of HoxC4 in GC B cells for CVC1302

3 討論與結論

抗體作為體液免疫應答的重要組成,特異性識別進而中和病原體[20]。研究發現,抗體親和力即抗原與抗體結合能力,與其抑制病原體感染的能力顯著相關[21]。抗體親和力成熟依賴于AID介導的SHM。生發中心暗區,活化的抗原特異性B細胞在增殖過程中,SHM介導B細胞抗體基因的V區發生點突變,誘導B細胞抗體親和力成熟,隨后遷移至明區,高親和力B細胞在Tfh的陽性選擇下,分化為漿細胞,轉運至骨髓分化為LLPC分泌高親和力抗體。AID表達依賴于其基因轉錄過程。AID由4個順式調控區介導其于活化B細胞中的表達,其中區域1含有可與NF-κB和 STAT6的結合位點,其被TLR激動劑激活后,增強HoxC4的表達,促進AID增強子活性,正向調控AID表達[12-13]。

研究發現,CVC1302可提高抗體親和力[16]。鑒于此,本研究利用流式細胞術檢測發現,NP-CVC1302-ISA206組小鼠顯著促進NP特異性GC B細胞占B細胞的比例,比值為17.77%,顯著高于NP-ISA206組小鼠,表明CVC1302可促進GC B細胞的增殖;與此同時,real-time PCR檢測發現,CVC1302可促進GC B細胞中AID基因的轉錄水平,流式細胞術同時分析得出AID的表達水平也顯著提升,NP-CVC1302-ISA206組小鼠其GC B細胞AID的MFI為147 539,而NP-ISA206組小鼠GC B細胞AID的MFI為126 005,兩者差異顯著。鑒于HoxC4基因于AID轉錄水平起到正向調控的作用,本研究利用real-time PCR對HoxC4基因的轉錄水平進行了檢測,結果顯示,以β-actin基因作為內參,NP-CVC1302-ISA206組小鼠其HoxC4基因相對轉錄水平為4.03,而NP-ISA206組小鼠HoxC4基因相對轉錄水平僅為1.53,兩者差異極顯著。綜上, CVC1302依賴于促進HoxC正向調控AID表達,進而誘導機體產生高親和力抗體。

獸醫領域中,免疫增強劑的研制多依賴于經驗,對其作用機制的研究甚少,人醫領域中,研究發現TLR4激動劑協同CD40信號可依賴于NF-κB信號通路上調AID基因轉錄,促進AID表達,誘導高親和力抗體[22]。TLR1/2激動劑協同BCR依賴于AKT信號通路促進USP10核移位,進而抑制AID降解,誘導高親和力抗體[23]。本研究發現免疫增強劑CVC1302依賴于HoxC4的上調表達促進AID的表達,然而其相關信號通路仍需進一步研究分析;且多項研究檢測抗體親和力多為使用NP-OVA作為模式抗原,利用包被NP1-BSA或NP15-BSA(NP載量不同)的ELISA板,檢測小鼠的總NP(NP15)或高親和力(NP1)抗體水平,因此本研究僅使用模擬抗原檢測總親和力和高親和力抗體水平,后續應對GC B細胞免疫球蛋白可變區VH186.2和JH等基因片段進行測序,分析其基因突變頻率。本研究僅利用模式抗原NP-OVA探究CVC1302可誘導產生高親和力抗體,后續將推廣至不同病原體,檢測其誘導高親和力抗體這一效力的普遍性,擴大CVC1302應用前景。

本研究利用NP-OVA作為模式抗原,闡明CVC1302依賴于HoxC4正向調控AID誘導機體產生高親和力抗體,為后續新型免疫增強劑的研制提供研究思路和方向。