芪蛭通脈顆粒對冠心病模型大鼠MMP-9/TIMP-1影響的研究*

佟晴晴 趙 淳 李 易 葉 勇 柳 堯 宋欠紅△

（1.云南中醫藥大學，云南 昆明 650500；2.云南中醫藥大學第一附屬醫院，云南 昆明 650021）

芪蛭通脈顆粒是第三、四、五、六批全國名老中醫藥專家學術經驗繼承工作指導老師趙淳教授的經驗方，經優化劑型而成。本研究團隊對芪蛭通脈顆粒進行的前期研究結果顯示：氣虛血瘀證之冠心病患者應用芪蛭通脈顆粒后可以明顯減輕氣短、胸悶、胸痛等癥狀，并有明確的調節血脂作用［1-2］。我們前期研究發現芪蛭通脈顆粒能通過調控前蛋白轉化酶枯草溶菌素9（PCSK9）/低密度脂蛋白受體（LDLR）及血管細胞間黏附分子1（VCAM-1）/細胞間黏附分子-1（ICAM-1）信號通路降低大鼠血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TAG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平，提高高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平，具有調節血脂的作用。該方還可以調控TLR4/NF-κB 信號通路，抑制動脈粥樣硬化模型大鼠冠狀動脈炎癥反應［3］。基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）和基質金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）的平衡是反映動脈粥樣硬化穩定性的重要指標［4］。本實驗通過觀察芪蛭通脈顆粒對冠心病模型大鼠血清及心肌組織MMP-9、TIMP-1 表達水平的影響，分析血清、心肌組織中MMP-9、TIMP-1 含量及相關性，探討該方治療冠心病的機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只Wistar雄性健康大鼠，SPF級，體質量200～250 g，購于昆明醫科大學動物中心。實驗動物生產許可證號：SCXK（滇）2018-0003。大鼠合格證號：430067000017126。對大鼠進行適應性飼養1周。

1.2 藥物 自擬方芪蛭通脈顆粒由黃芪20 g，燈盞細辛15 g，紅曲6 g，三七6 g，水蛭粉3 g組成，以上均為配方顆粒（四川新綠色藥業科技發展有限公司，批號：2008029）。對照藥物血塞通滴丸（昆藥集團藥業有限公司，5 mg/粒，批號：2001820）。垂體后葉素注射液（上海禾豐制藥股份有限公司，6 U/mL，批號：2002014）。注射用異戊巴比妥鈉（上海上藥新亞藥業有限公司，0.25 g/10 mL，批號：20201006）。

1.3 試劑與儀器 MMP-9、TIMP-1 ELISA 試劑盒（上海藍基生物科技有限公司，批號：20200714、20200710）、電子分析天平產自德國sartorius 公司（CX-BA 型）。酶標儀型號：DENLEY DRAGON Wellscan MK 3，Thermo公司；高通量組織研磨器：上海豫明YM-80LD。PT、APTT、TT、FIB 檢測試劑盒（上海太陽生物科技有限公司.批號：B202012023、B202011011、B202012021、B202012013）。谷丙轉氨酶（ALT）、血清尿素氮（BUN）、血清肌酐（Cr）檢測試劑盒（上海藍基生物科技有限公司，批號：20201014、20200910、20201010）。

1.4 造模與分組 60 只大鼠按隨機數字表法分為6組，空白組、模型組、血塞通滴丸組以及芪蛭通脈低、中、高劑量組，每組10 只。在潘繼興制作冠心病模型大鼠的基礎上進行改良，建立冠心病動物模型［5］。除空白組之外的其余各組均給予高脂飼料喂養。具體配方為：膽固醇3%，豬油15%，膽酸鈉1%，丙硫氧嘧啶1%，基礎飼料80%。連續喂養8 周，按5 mL/kg 液體量每日灌胃2 次，空白組給予等量純凈水灌胃。從第8 周第4 日開始，除空白組之外的其余組給予垂體后葉素（每次3 U/kg，每日1 次）腹腔注射，連續給藥3 d；空白組繼續予以等量純凈水灌胃。在給藥第3日，于注射藥物后30 min 內對大鼠進行心電圖檢測，若大鼠心電圖存在QRS 波群的終點與ST 段交接處的J 點位移，且位移＞0.1 mV，則表明大鼠存在心肌缺血，以及心電圖ST 段抬高大于0.1 mV，并且心律不齊，則表明造模成功［6］。

1.5 干預方法 于第9周開始給藥，共干預治療28 d。實驗動物與健康人用藥量的換算方法：給藥劑量（g/kg）=給出的人的劑量（g/kg）×70 kg×系數（0.018）×（1/0.2）。除空白組和模型組予等量純凈水灌胃外，芪蛭通脈低、中、高劑量組分別予以相應劑量芪蛭通脈水溶液給藥，血塞通滴丸組給予血塞通滴丸水溶液灌胃。

1.6 取材 藥物干預4 周后進行檢測，將大鼠按體質量予以1%異戊巴比妥鈉40 mg/kg 劑量腹腔注射麻醉大鼠，固定大鼠，使大鼠呈仰臥位，對大鼠皮膚進行消毒，暴露大鼠腹主動脈，采血5 mL，于室溫2 500 r/min離心20 min，取上清液即血清分裝于1.5 mL 的ependor管中，放入-20 ℃冰箱保存，切開大鼠胸部皮膚、胸大肌、肋骨、取出心臟，每個心臟取左心室室壁3×3 mm心肌2塊，放入-80 ℃冰箱保存待檢。

1.7 血清及心肌組織相關指標 凝血四項檢測［活化部分凝血酶時間（APTT）、凝血酶原時間（PT）、凝血酶時間（TT）、纖維蛋白酶（FIB）］：按照試劑盒說明書進行檢測。檢測血清ALT、BUN、Cr水平。剪取左心室心肌組織3×3 mm，研磨后用酸鹽緩沖液制成心肌組織勻漿液，離心后取上清液，ELISA法檢測心肌組織MMP-9、TIMP-1［7-8］。

1.8 統計學處理 應用SPSS22.0 統計軟件。計量資料以（±s）表示，運用方差分析進行統計學處理，計量資料采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠血清MMP-9、TIMP-1 水平的比較 見表1（模型組大鼠死亡2 只，芪蛭通脈中劑量組大鼠死亡1 只）。與空白組比較，模型組、血塞通滴丸組、芪蛭通脈低、中劑量組大鼠血清MMP-9 水平升高（P＜0.05）；芪蛭通脈中、高劑量組、血塞通滴丸組與模型組比較MMP-9 水平降低（P＜0.05）。與空白組比較，模型組大鼠血清TIMP-1 水平降低（P＜0.05）；芪蛭通脈中、高劑量組大鼠血清TIMP-1 水平升高（P＜0.05）。芪蛭通脈中、高劑量組與模型組比較，TIMP-1 水平升高（P＜0.05）；芪蛭通脈中、高劑量組與血塞通滴丸組比較TIMP-1水平升高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清中MMP-9、TIMP-1表達水平比較（ng/mL，±s）

表1 各組大鼠血清中MMP-9、TIMP-1表達水平比較（ng/mL，±s）

注：與空白組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。下同。

TIMP-1 22.69±2.35 13.41±3.05*17.61±3.39 18.58±3.32 29.52±4.12*△△28.93±3.55*△△組 別空白組模型組血塞通滴丸組芪蛭通脈低劑量組芪蛭通脈中劑量組芪蛭通脈高劑量組n 10 8 10 10 9 10 MMP-9 26.60±2.95 48.53±7.22**41.89±5.16**△42.24±6.31**36.91±4.17*△32.79±3.92△△

2.2 各組大鼠心肌組織MMP-9、TIMP-1水平比較 見表2。芪蛭通脈中、高劑量組，血塞通滴丸組與模型組比較，MMP-9 水平均降低（P＜0.05）。與空白組比較，模型組、芪蛭通脈低劑量組大鼠心肌組織TIMP-1水平降低（P＜0.05）；芪蛭通脈中劑量組與空白組比較TIMP-1 水平升高（P＜0.05）。芪蛭通脈中、高劑量組與模型組比較TIMP-1水平顯著升高（P＜0.01）。

表2 各組大鼠心肌組織MMP-9、TIMP-1水平比較（ng/mL，±s）

表2 各組大鼠心肌組織MMP-9、TIMP-1水平比較（ng/mL，±s）

組 別空白組模型組血塞通滴丸組芪蛭通脈低劑量組芪蛭通脈中劑量組芪蛭通脈高劑量組n 10 8 10 10 9 10 MMP-9 3.58±0.57 20.31±3.12**17.66±3.21**16.33±3.54**7.20±2.06**△9.54±2.24**△TIMP-1 2.42±0.35 1.02±0.24*1.63±0.32 1.54±0.55*3.69±0.61*△△2.78±0.84△△

2.3 各組大鼠凝血功能指標比較 見表3。各組間凝血功能檢測未見明顯差異（均P＞0.05）。

表3 各組凝血功能指標比較（±s）

表3 各組凝血功能指標比較（±s）

組 別空白組模型組血塞通滴丸組芪蛭通脈低劑量組芪蛭通脈中劑量組芪蛭通脈高劑量組n 10 8 10 10 9 10 APTT（s）23.74±5.56 25.31±6.43 28.62±5.24 30.52±6.28 29.87±6.77 26.32±5.01 PT（s）10.70±1.02 9.11±1.23 11.02±2.24 10.25±2.09 11.54±2.74 9.18±2.55 TT（s）11.70±1.19 10.85±1.02 12.03±1.56 10.93±0.99 12.15±1.45 11.40±1.32 FIB（g/L）2.64±0.32 3.31±0.76 3.25±0.47 4.83±0.61 4.50±0.99 3.69±0.25

2.4 各組大鼠ALT、BUN、Cr水平比較 見表4。與空白組比較，模型組ALT 水平升高（P＜0.05），各組間BUN 水平差異無統計學意義（P＞0.05），其他所有組Cr水平明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，血塞通滴丸組ALT水平降低，芪蛭通脈高劑量組Cr水平下降（均P＜0.05）。

表4 各組大鼠ALT、BUN、Cr水平比較（±s）

表4 各組大鼠ALT、BUN、Cr水平比較（±s）

組 別空白組模型組血塞通滴丸組芪蛭通脈低劑量組芪蛭通脈中劑量組芪蛭通脈高劑量組n 10 8 10 10 9 10 ALT（U/L）43.74±5.56 65.31±7.43*43.62±5.24△55.52±6.28 49.87±6.77 56.32±8.01 BUN（mmol/L）7.70±1.02 10.11±1.23 11.02±2.24 10.25±2.09 11.54±2.74 9.18±2.55 Cr（μmol/L）53.64±6.32 101.31±13.76*88.25±13.47*93.83±10.61*114.50±11.99*78.69±10.25*△

3 討 論

冠心病屬中醫學“胸痹”“心痛”范疇，多表現為胸部有短暫的壓榨性疼痛或有憋悶感，其基本病機為心脈痹阻，為本虛標實之證［9］。絡病理論對胸痹心痛治療具有重要指導意義，其最早見于《黃帝內經》。由吳以嶺教授推動“絡病證治”進入到“脈絡學說”新階段，創立“三維立體網絡系統”成為現代絡病學理論基礎［10］。經是經絡系統的主體，而絡是由經分出的行于淺表的支脈，經絡共同構成了人體氣血運行的通道。血管及毛細血管、微血管等在解剖形態和功能上與中醫學中“經絡”聯系密切，人體運行血液的循環及微循環系統與運行氣血的脈絡共同形成了“脈絡-血管系統病”“孫絡-微血管病”等新概念［11］。許多具有心絞痛癥狀，且心電圖多數導聯呈ST 段壓低提示有心肌缺血或心肌標志物異常反映心肌壞死，而冠狀動脈造影未見異常的患者大多與冠狀動脈微循環障礙有關［12］。2013 年歐洲心臟病學會在冠心病原本定義的基礎上加入了冠脈微血管功能障礙導致的胸部癥狀［13］，主要依靠功能評估來判斷冠脈微循環功能狀態。

冠脈微循環具有調節心臟血流分布，滿足心肌代謝需要以及調節外周血管阻力的功能［14］。冠狀動脈微循環的結構和功能改變使冠狀動脈血流儲備受損，引起心肌缺血，血管痙攣、內皮功能障礙、血管重構、毛細血管密度降低、血管周圍纖維化、再灌注損傷等原因導致冠脈微循環障礙［15］。冠脈微循環在生理結構及功能上相當于心臟的孫絡，冠脈微循環功能障礙屬于絡病理論中的“孫絡-微血管病”。血脂異常會損傷血管內皮，血管內皮細胞受損后，血管內壁中脂質遷移沉積，形成斑塊并不斷加重，同時血液黏度增加，促使血小板黏附、聚集，誘導血栓形成，使外周微循環受損［16］；動脈粥樣硬化斑塊的穩定程度和纖維帽的薄厚密切相關［17］，而纖維帽的主要成分是細胞外基質（ECM），基質金屬蛋白酶（MMPs）能夠降解ECM，使纖維帽變薄，斑塊更易破裂。MMP-9 是其家族中重要一員，大量存在于易損斑塊中。TIMP-1 是MMP-9 的特異性抑制劑，可反映抑制膠原降解的程度。兩者的動態平衡是維持動脈硬化斑塊穩定的關鍵因素［18］。

對基于絡病理論指導下所組方藥的相關研究表明，通絡的方藥可保護微血管內皮細胞，改善內皮舒縮功能［19］。治療冠心病宜采用活血通絡之法，改善血液循環，使血運通暢，通則不痛，緩解胸痛癥狀。芪蛭通脈由炙黃芪、燈盞細辛、三七、紅曲、水蛭粉等組成，具有益氣活血化瘀、通絡止痛之效。根據藥理研究，本方藥物具有抗凝血、改善血液循環、保護微血管內皮細胞，加速膽固醇代謝等作用［20］。

本研究表明，模型組大鼠血清及心肌組織中MMP-9均升高，TIMP-1水平均降低，芪蛭通脈中、高劑量組能明顯降低血清及心肌組織MMP-9 水平，并提高血清及心肌組織TIMP-1水平，MMP-9/TIMP-1比值有良好的相關性，其相關性在血清中表達更為明顯，這表明血清中MMP-9、TIMP-1 含量對檢測患者斑塊穩定程度具有重要意義；與此同時，芪蛭通脈中、高劑量組對MMP-9/TIMP-1 的調控作用明顯，其可能作用機制是抑制MMP-9 的釋放的同時促進TIMP-1 生成，促進生成MMP-9/TIMP-1 復合物，抑制ECM 降解。根據APTT、PT、TT、FIB 檢測結果，芪蛭通脈低、中、高劑量組未導致凝血功能異常。此外，模型組大鼠ALT、Cr升高，肝、腎功能有一定損傷，用血塞通滴丸干預后，肝、腎功能有一定程度的恢復，而芪蛭通脈低、中、高劑量組與血塞通滴丸組相比較沒有明顯肝腎損害，其作用機制有待進一步研究。

芪蛭通脈可以抑制MMP-9 釋放以及促進TIMP-1生成，抑制ECM 降解，穩定斑塊，防止斑塊破損，減少血栓形成，維持心臟血液循環，使冠脈循環障礙得到有效緩解；而芪蛭通脈對冠脈微循環障礙的改善程度有待進一步研究。