基于轉錄組測序技術探討電針對應激性胃潰瘍模型大鼠的分子機制*

潘 婷 王海麗 李雪峰 陳春海 陳新華△

（1.長春中醫藥大學，吉林 長春 130117；2.長春中醫藥大學附屬醫院，吉林 長春 130021）

應激性胃潰瘍（SGU）指機體在應激狀態下，胃和十二指腸黏膜出現的糜爛、潰瘍、出血等表現的一種急性胃黏膜病變，某些潰瘍向深部發展可造成穿孔，其發生和發展的機制尚未完全明確［1］。此病的發生會嚴重影響人們的生活質量，但目前國內外尚無有效的防治方法，許多化學合成藥物雖可治療和控制胃潰瘍及相關問題，但具有毒副作用，可能引起更多并發癥［2］。胃潰瘍屬中醫學“胃脘痛”“嘈雜”“胃瘍”等范疇，針灸治療SGU 在臨床上已獲得良好的效果。針灸具有良性的雙向調節作用，針灸治療胃潰瘍是從多方面、多層次的綜合調理，起到保護胃黏膜的作用［3-4］。本研究通過對大鼠進行電針針刺治療后建應激性胃潰瘍模型大鼠，觀察各組大鼠胃黏膜損傷和胃組織基因表達譜的情況，以期為電針治療應激性胃潰瘍的應用提供基礎依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性Wistar 大鼠24 只，體質量180～220 g，生產許可證號：SCXK（吉）2020-0002。大鼠在長春中醫藥大學動物中心喂養，自然照明，室溫為（25±3）℃，相對濕度為（55±5）%，普通飼料喂養，自由飲水，保持自然生物節律。實驗過程按長春中醫藥大學動物倫理委員會的要求進行，倫理審查批準編號：2021222。

1.2 試劑及儀器

鼠維持用顆粒飼料（長春市億斯實驗動物技術有限責任公司）；不銹鋼無菌針灸針（貴州安迪藥械有限公司生產，0.18×10 mm，產品批號：20182270011）；SDZ-V 型電子針療儀（產品批號：YZB/蘇0691-2013）；小動物專用吸入麻醉機（美國MATRX VMR）；多聚甲醛固定液（產品編號：BL539A，Biosharp）；RNAlater 固定液（產品編號：R0118，Beyotime）；TRIzol（Invitrogen公司，美國）；NEBNext? Magnesium RNA Fragmentation Module（貨號E6150S，美國）；Bioanalyzer 2100（Agilent公司，USA）；Invitrogen SuperScript ⅡReverse Transcriptase（貨號1896649，美國）；E.coli DNA polymerase I（NEB，貨號m0209，美國）；RNase H（貨號m0297，美國）；dUTP Solution（貨號R0133，美國）；illumina NovaseqTM6000（LC Bio Technology CO.杭州，中國）等。

1.3 分組與干預

將大鼠適應性飼養7 d 后分隨機分為空白組（8只）、模型組（8 只）、電針組（8 只）。1）空白組：常規喂養，無任何處置。2）模型組：適應性喂養7 d，與電針組同期使用異氟烷于麻醉機中進行麻醉，每日1 次，每次20 min，共7 次。第8 天采用水浸束縛法（WIRS）進行造模。3）電針組：適應性喂養7 d，將大鼠使用異氟烷于麻醉機中進行麻醉后，取穴參照《實驗針灸學》《大鼠穴位圖譜的研制》記載的腧穴位置，選擇足三里、內關進行電針針刺治療。每日1次，每次20 min，共7次，第8 天采用束縛-水浸應激法進行造模。針刺后分別以單側內關、足三里為電針連接對穴，連接華佗牌SDZV型電子針療儀，調至連續波，頻率20 Hz，強度為1。

1.4 模型制備

針刺干預結束后，將電針組與模型組進行WIRS造模［5］。大鼠禁食、不禁水24 h，造模時用繩子將其四肢縛住，背部固定于在自制金屬網上，使其頭部在上、尾部在下，垂直放入（22±2）℃的恒溫水箱中，保持水的液面始終在大鼠胸骨劍突，水浸時間為12 h。

1.5 標本采集與檢測

1）胃黏膜損傷評估：各組大鼠在呼吸麻醉狀態下開腹，抽取大鼠腹主動脈血，取胃組織，用提前放置在4 度冰箱中的生理鹽水沖凈胃組織表面血跡后，將胃展開，用游標卡尺將展開的胃組織進行測量，測量潰瘍面最大長徑和最大橫徑并計算出胃黏膜損傷指數（UI）。評分標準如下：斑點糜爛1 分；糜爛直徑＜1 mm 2 分；1 mm＜糜爛直徑＜2 mm 3 分；2 mm＜糜爛直徑≤4 mm 4分；糜爛直徑＞4 mm 5分；寬度＞2 mm時分值×2；最后將分數相加即為潰瘍指數（UI）。2）HE染色病理分析：完成大鼠胃黏膜損傷評估后，將1/4胃組織分組放入10 mL試管中，4%多聚甲醛溶液浸泡24 h，脫水，包埋，切片，顯微鏡下觀察大鼠胃黏膜病理變化，將1/4剩余胃組織于-80 ℃下保存，以便在后續實驗中使用。3）將1/2胃組織放入RNAlater 固定液中，常溫放置24 h 后，放入-80 ℃冰箱中保存備測。對總樣品的RNA 進行分離和純化，對總RNA 的量與純度進行質控，然后對RNA的完整性進行檢測，同時通過瓊脂糖電泳的方案進行驗證。通過兩輪的純化對其中的帶有多聚腺苷酸的mRNA進行特異性捕獲。在高溫條件下將mRNA進行片段化，并通過逆轉錄酶的作用合成cDNA。將處理后的DNA 與RNA 的復合雙鏈轉化成DNA 雙鏈，對其片段大小進行篩選和純化，最終形成片段大小為（300±50）bp 的文庫。最后，使用illumina NovaseqTM6000 按標準操作對其進行雙端測序，測序模式為PE150。使用R 包對樣本之間進行顯著差異分析，將差異倍數FC＞2倍或FC ＜0.5倍且P＜0.05的基因定義為差異基因，并對其進行GO和KEGG富集分析。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠UI比較

見表1。造模過程中模型組和針刺組各有2 只大鼠掙脫束縛，故排除，最后納入6 只進行比較。與空白組相比，模型組大鼠胃黏膜損傷指數較空白組高（P＜0.01），說明本實驗建立的胃潰瘍大鼠模型較理想。與模型組大鼠相比，電針組胃黏膜損傷指數有明顯降低（P＜0.01），說明預電針干預可使SGU 大鼠胃黏膜損傷指數降低。

表1 各組大鼠UI比較（mm，±s）

表1 各組大鼠UI比較（mm，±s）

注：與空白組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01。

UI 0.00±0.00 17.52±2.05**9.46±1.52△△組 別空白組模型組電針組n8 6 6

2.2 各組大鼠胃組織大體形態比較

見圖1。空白組胃黏膜肉眼可見光滑完整，顏色呈淡粉色；模型組可見多處出血點（如圖2 模型組黑色箭頭所示），且出血點大小形態不一。電針組與模型組相比其出血點面積較小，且分布較散（如圖1 電針組黑色箭頭所示）。

圖1 各組大鼠胃組織肉眼大體形態比較

圖2 各組大鼠胃組織病理結果比較（HE染色，200倍）

圖3 各組小鼠差異基因表達的影響比較

2.3 各組大鼠胃組織病理觀察結果比較

見圖2。空白組大鼠胃組織細胞結構光滑完整、排列整齊有序。模型組大鼠胃組織結構破損，細胞排列雜亂無序，細胞內多處可見充血、毛細血管出血，在擴張的血管內可見大量胞漿紅染。電針組胃組織表面有部分脫落，上皮細胞受損部位表淺且范圍較小，細胞內充血情況較模型組明顯減少，炎癥細胞浸潤較少（如圖2黑色箭頭所示）。

2.4 各組大鼠胃組織轉錄組學分析

2.4.1 差異基因表達篩選 對差異表達基因進行篩選，我們以差異倍數FC≥2 或FC≤0.5（即log2FC 的絕對值≥1）且P＜0.05 作為標準，認為由此篩選出的基因為差異表達基因。測序結果顯示，模型組與空白組比較，篩選出的顯著差異基因共1 161 個，其中上調基因555個，下調基因606 個，排名前10 的基因見表2。電針組與模型組比較，篩選出的顯著性差異基因共51 個，其中上調基因23個，下調基因28個，排名前10的基因見表3。電針組與空白組比較，篩選出的顯著性差異基因共有1 595 個，其中上調基因853 個，下調基因742 個，排名前10 的基因見表4。同時統計了3 組比較的差異基因，共有7個，基因名分別為LOC108348108、LOC299282、Crabp2、Elovl6、RT1-CE10、Steap4、Pfkfb3。

表2 模型組與空白組顯著性差異基因（top10）

表3 電針組與模型組顯著性差異基因（top10）

表4 電針組與空白組顯著性差異基因（top10）

2.4.2 差異基因的GO 富集分類分析 對各組的差異基因進行GO富集分析，以P＜0.05為篩選標準。GO富集分析主要包括生物過程（Biological Process）、細胞組成（Cellular Component）和分子功能（Molecular Function）。由于在生物過程、細胞組分、分子功能這3 種GO function 上富集的GO Term 數目比較多，無法把所有的注釋結果都展示在一張圖中，因此3 種GO function 我們根據注釋到GO Term 的差異基因數目由大到小降序排列，分別挑選Top25、Top15、Top10的GO Term進行繪圖展示。通過GO 富集分析可以看出，電針組和空白組相比，差異基因在細胞組成中有487 條差異基因富集于細胞膜（membrane），在分子功能有306 條差異基因富集于蛋白結合（protein binding），在生物過程中有112 條差異基因富集于生化過程（biological_process）圖4b 得到的共表達差異基因在細胞組成中富集最多的是細胞質（cytoplasm），為12 條，而在分子功能中8 條差異基因具有蛋白結合（protein binding）功能，在生物過程中差異基因聚集最多的兩個類群是翻譯（translation）和氧化還原（oxidation-reduction process），均為4 條。圖4c 得到的共表達差異基因在細胞組成中富集最多的是細胞膜，有373 條，在分子功能中差異基因聚集最多的兩個類群是蛋白結合（protein binding）和金屬離子結合（metal ion binding），分別為221和134條，在生物過程中富集最多的是生化過程和氧化還原2個類群，分別為79、72條。

圖4 差異基因GO富集分析

2.4.3 差異基因的KEGG 代謝通路富集分析 對差異轉錄本KEGG 通路進行分析，根據KEGG 富集的顯著性（pvalue）取Top20 的pathway 進行氣泡圖繪圖展示（如圖5 所示）。其中電針組與空白組相比差異轉錄本共富集到301條通路，其中排名前5的分別為癌癥通路（Pathways in cancer）、單純皰疹病毒1 型感染（Herpes simplex virus 1 infection）、PI3K-Akt 信號通路（PI3KAkt signaling pathway）、人乳頭瘤病毒感染（Human papillomavirus infection）和MAPK 信號通路（MAPK signaling pathway）。空白組與模型組相比差異轉錄本共富集到290 條通路，其中排名前5 的分別是癌癥通路（Pathways in cancer）、單純皰疹病毒1 型感染（Herpes simplex virus 1 infection）、PI3K-Akt 信號通路（PI3KAkt signaling pathway）、人類乳頭瘤病毒感染（Human papillomavirus infection）和受體相互作用（Cytokinecytokine）。電針組與模型組相比差異轉錄本共富集到66 條通路，其中排名前5 的分別為雌激素信號通路（Estrogen signaling pathway）、抗原處理及呈遞（Antigen processing and presentation）、非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease）、細胞黏附分子（Cell adhesion molecules）和內吞作用（Endocytosis）。

圖5 各組差異基因KEGG富集分析

3 討 論

SGU 發病機制尚不明確，且因其病程較長沒有特效藥，所以臨床上有效的治療手段較少。中醫藥治療SGU多以辨證施治，調和臟腑機能，以達到標本兼治的目的。該病病位在胃，與肝脾相關，病性多為本虛標實，治療以條暢氣機、補益氣血為主。針灸以其簡便易行、安全性高、價廉效優的獨特優勢在治療此類疾病上具有明顯優勢，其治療原則為調和氣血、緩急止痛、疏通經脈，治療機理與發病機制密切相關，主要通過調節神經內分泌系統功能、平衡胃黏膜損傷因子和防御因子的相互關系從而影響SGU，緩解其癥狀。在本實驗中選取足三里和內關穴，進行按部位上下取穴法。足三里為胃經下合穴，具有通降腑氣、扶正祛邪、培補中焦、運脾和胃、行氣活血的作用。下合穴是六腑之氣輸注出入的部位，依據“合治內腑”“合主逆氣而泄”“肚腹三里留”的理論可知下合穴用于治療腑病，其中足三里是治療胃腑病的主穴。內關穴為心包經絡穴，又是八脈交會穴，聯絡三焦，通于陰維脈。內關穴可調暢三焦氣機，和胃止痛，尤對氣滯血瘀證之胃脘痛效果更佳［6］。另外，內關穴常可與足三里穴合用，調理脾胃。

本研究通過構建空白組、模型組、電針組胃組織的轉錄組文庫，獲得全部基因表達譜，并對差異基因進行分析，針對這些差異基因進行了GO 功能分類，KEGG代謝通路分析，通過其分析結果并查閱相關文獻，在富集通路中與應激性胃潰瘍發生發展密切關聯的通路有PI3K/Akt 信號通路和MAPK 信號通路［7-11］。PI3K 是一種胞內磷脂酰肌醇激酶［12］，Akt 是絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，參與細胞增殖、細胞遷移、細胞凋亡等過程［13］，PI3K 由催化亞基p110 與調節亞基p85 構成，其被激活時，p110 可誘導PIP2 轉變為PIP3 與Ak 結合促使其活化［14-15］，PI3K、Akt 基因及蛋白異常表達會促進細胞發生凋亡并推動胃潰瘍疾病進展。MAPK 通路主要參與細胞應激反應和損傷反應，通過干擾基因的轉錄和調控，來調節細胞増殖、分化和凋亡等，可在傷害性刺激、生長因子及炎癥介質等因素影響下被激活，參與多種神經病理痛的形成［16］。

有研究表明理中湯可明顯降低胃潰瘍大鼠血清炎癥水平，下調大鼠胃組織PI3K、Akt 蛋白表達，可能與調控PI3k/Akt 通路有關［17］；也有研究認為，PI3K、Akt基因及蛋白表達水平異常會促進炎性細胞因子釋放并誘導胃黏膜細胞發生凋亡，從而加重胃潰瘍病情。PI3K/Akt信號通路及其上下游分子可能是治療各種炎癥性疾病的靶點［18］。研究表明［19］，p38 MAPK 在被急、慢性炎癥激活以后，可以改變多種細胞因子的表達，進而影響炎癥病變的預后；也有研究［20-21］顯示白及多糖可通過下調P38 MAPK 基因和蛋白表達水平，抑制炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）及白細胞介素-6（IL-6）異常分泌而發揮保護胃黏膜的作用。一項動物實驗證實鐵皮石斛多糖可通過調節MAPK 信號通路中相關基因和蛋白的表達，降低炎性因子，從而減輕無水乙醇引起的胃潰瘍損傷［22］。因此，根據本次研究的結果，推斷電針對胃潰瘍的治療可能通過PI3K-/AKT、MAPK 等信號通路的介導，從而對SGU起治療作用。

綜上，本研究觀察電針干預后對SGU 模型大鼠的轉錄組學分析其相應基因的表達情況，從基因水平上預測了SGU 的形成以及針刺對胃潰瘍治療的可能作用途徑，為進一步解析電針防治SGU 的分子機制研究奠定了良好的基礎。本研究仍存在不足之處，由于此次研究主要是采用生物信息學的方法進行分析，大量的數據結果是基于計算機與數學的統計功能進行的預測分析，未通過RT-PCR 等技術驗證轉錄組學數據的可靠性，這也是本課題組接下來需要完成的工作內容，同時還需要對發現的關鍵信號通路及其靶點進行更全面、更深層次的探究。