基于網絡藥理學與分子對接技術探討復方仙草顆粒治療足細胞損傷的作用機制▲

羅 佳 黃國東 蘭天瑩 孫一銘 梁靜妍 周 雁 農復香 許文聰

(1 廣西中醫藥大學附屬國際壯醫醫院腎病科,廣西南寧市 530219;2 廣西中醫藥大學壯醫藥學院,廣西南寧市 530001;3 廣西中醫藥大學第一附屬醫院脾胃肝病科,廣西南寧市 530213)

腎小球濾過屏障主要由血管內皮細胞、腎小球基底膜和足細胞組成,任何一部分的結構或功能改變都會使腎小球濾過功能受損,而足細胞則是腎小球濾過屏障的最后一道防線[1],具有調解內皮細胞功能、維持毛細血管袢正常開合的作用。許多腎臟疾病會導致足細胞損傷,包括狼瘡性腎炎、局灶節段性腎小球硬化、糖尿病腎病等[2]。足細胞損傷的臨床特征是蛋白尿,伴有或不伴有腎小球硬化導致的腎功能損傷[3],嚴重時可導致腎小球基底膜脫離[4]。足細胞損傷是許多腎臟疾病的早期病理變化[5],對于評估狼瘡性腎炎[6]、糖尿病腎病[7]等腎臟疾病的進展和預后具有重要意義。

已有研究表明,復方仙草顆粒中的多種成分可以保護足細胞骨架、促進足細胞成活、抑制足細胞凋亡,最終減少足細胞損傷[8]。本研究基于網絡藥理學與分子對接技術探究復方仙草顆粒治療足細胞損傷的有效活性成分、作用靶點及可能作用機制,為復方仙草顆粒治療足細胞損傷的進一步研究提供理論和實驗基礎。

1 資料與方法

1.1 有效活性成分的篩選 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP;https://old.tcmsp-e.com/index.php)搜索框中輸入復方仙草顆粒6味中藥(八仙草、黃芪、三七、薏苡仁、大黃、甘草)的名稱[9],以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、藥物相似性(drug-likeness,DL)≥0.18為篩選條件,進一步篩選出有效活性成分[10]。

1.2 有效活性成分作用靶點的收集 在TCMSP中收集各個有效活性成分的作用靶點蛋白的名稱,借助UniProt(https://www.uniprot.org/)數據庫查找靶點蛋白的標準基因名。

1.3 足細胞損傷相關靶點的篩選 以“podocyte injury”為關鍵詞在OMIM?(https://www.omim.org/)[11]、PHARMGKB(https://www.pharmgkb.org/)[12]、GeneCard?(https://www.genecards.org/)3個數據庫進行檢索,匯總檢索結果后去重,得到足細胞損傷相關靶點。

1.4 交集靶點的獲取 使用R 4.0.5軟件對有效活性成分作用靶點與足細胞損傷相關靶點取交集,并以Venn圖展示結果。

1.5 “成分-靶點”網絡的構建 將有效活性成分與交集靶點導入Cytoscape 3.9.1軟件,制作“成分-靶點”網絡圖[13]。利用Cytoscape 3.9.1軟件內置的Analyze Network計算度值,根據度值進行由大到小排序,將排名前3的有效活性成分作為關鍵有效活性成分。

1.6 交集靶點的蛋白-蛋白相互作用網絡的構建及核心靶點的篩選 將交集靶點導入STRING數據庫(https://string-db.org/)[14],生物體類型設置為“homo sapiens”,獲得蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)數據,將置信度設置為0.400,其他參數使用默認數值,同時去除網絡中未連接的節點,利用Cytoscape 3.9.1軟件建立PPI網絡。然后利用Cytoscape 3.9.1軟件中的CytoNCA插件,根據介數中心性(betweenness centrality,BC)、接近度中心性(closeness centrality,CC)、度中心性(degree centrality,DC)、特征向量中心性(eigenvector centrality,EC)、局部邊連通性(local average connectivity,LAC)、網絡中心性(network centrality,NC)6項參數進行篩選,以上述6項參數都大于中位值的靶點作為核心靶點。當納入的靶點數目較多時,可通過CytoNCA插件再次進行核心靶點的篩選,篩選條件不變。

1.7 富集分析 利用R 4.0.5軟件對交集靶點進行基因本體論(Gene Ontology,GO)功能富集分析,以P<0.05為具有統計學意義,完成生物學過程、細胞組分、分子功能分析。借助Metascape數據庫(https://metascape.org/gp/index.html)對交集靶點進行京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,選擇物種為人類(H.sapiens),以P<0.01為具有統計學意義[15]。

1.8 分子對接驗證 通過檢索文獻,將1.6中獲得的核心靶點中研究最多的5個靶點確定為與足細胞損傷關聯最大的靶點,將其與關鍵有效活性成分進行分子對接,得出分子對接效能。主要步驟:利用PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取關鍵有效活性成分的2D結構,并將其保存為.sdf格式文件后導入Chem3D 19.0軟件,利用Chem3D 19.0軟件中的“Minimize Energy”將關鍵有效活性成分進行能量最小化,并保存為.mol2格式文件。利用PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)獲取5個核心靶點的.pdb格式文件,通過SYBYL-X軟件2.0的“Docking Suite”對核心靶點進行去除水分子、加氫離子、加電荷等操作。最后應用SYBYL-X軟件2.0的Surflex模塊對關鍵有效活性成分與核心靶點進行分子對接,獲得對接的Total Score。Total Score越大則結合活性越好,4.25≤Total Score≤5.00提示關鍵有效活性成分與核心靶點之間具有一定的結合活性,5.007.0提示關鍵有效活性成分與核心靶點之間具有強烈的結合活性。

2 結 果

2.1 有效活性成分及其作用靶點的篩選結果 共收集到133種有效活性成分,主要為黃酮類、查爾酮類、蒽醌糖甙類、三萜類等化合物,其中11個有效活性成分屬于多味中藥的共有有效活性成分,見表1。分別收集到八仙草、大黃、黃芪、三七、薏苡仁、甘草的有效活性成分的作用靶點28個、56個、185個、162個、27個、209個,將6味中藥的有效活性成分作用靶點進行匯總、去重后得到有效活性成分的作用靶點234個。

表1 不同中藥的共有有效活性成分

2.2 足細胞損傷相關靶點的收集結果 在GeneCard?、OMIM?、PHARMGKB數據庫中分別收集到1 722個、3個、20個靶點,去重取并集后共收集到1 733個靶點。

2.3 交集靶點 對有效活性成分作用靶點與足細胞損傷相關靶點取交集,得到102個交集靶點,即復方仙草顆粒治療足細胞損傷的相關靶點,見圖1。

圖1 有效活性成分作用靶點與足細胞損傷相關靶點的Venn圖

2.4 “成分-靶點”網絡 采用Cytoscape 3.9.1軟件構建“成分-靶點”網絡(見圖2),該網絡共有206個節點、845條邊。其中,槲皮素對應的靶點最多(69個),其次是山柰酚(22個)、柚皮素(20個),且三者的度值位居前三,其可能是復方仙草顆粒治療足細胞損傷的關鍵有效活性成分。

圖2 “成分-靶點”網絡圖

2.5 交集靶點的 PPI網絡 構建交集靶點的PPI網絡(見圖3),該PPI網絡由101個節點和1 618條邊組成,平均節點度值為32。利用Cytoscape 3.9.1中CytoNCA插件篩選所需的核心靶點,其中第1次篩選出40個核心靶點,第2次篩選出17個核心靶點,即復方仙草顆粒治療足細胞損傷的核心靶點,分別為血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1,HMOX1)、腫瘤抗原p53(tumor antigen p53,TP53)、細胞周期蛋白D1(cyclin D1)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)、信號轉導及轉錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、前列腺素內過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、白細胞介素1B(interleukin 1 beta,IL-1B)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase,AKT)1、絲裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)A、缺氧誘導因子 1α(hypoxia-inducible factor 1 alpha,HIF1A)、Caspase-3、C-X-C基序趨化因子配體8(C-X-C motif chemokine ligand 8,CXCL8)、過氧化物酶體增生激活受體γ(peroxisome proliferative activated receptor gamma,PPARG)、Myc原癌基因蛋白(Myc proto-oncogene protein,MYC),見圖4。

圖3 交集靶點的PPI網絡圖

圖4 核心靶點

2.6 交集靶點的GO功能富集分析與KEGG通路富集分析 GO功能富集分析共得到2 145個生物學過程,主要涉及氧化應激等;共得到61種細胞組分,主要與囊泡等有關;共得到144種分子功能,主要與酶結合、抗氧化活性等有關。根據富集顯著程度由高至低對GO功能富集分析的生物學過程、細胞組分、分子功能進行排序,選取前10個條目進行展示,見圖5。KEGG通路富集分析共得到259條通路,主要涉及癌癥通路、糖尿病并發癥中的終末期糖基化終產物(advanced glycation end product,AGE)-AGE受體(receptor of AGE,RAGE)信號通路、VEGF信號通路、糖尿病性心肌病、叉頭框O(forkhead box O,FoxO)信號通路、酒精性肝病、p53信號通路、核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信號通路、壽命調節通路、壞死性凋亡、AMP依賴的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信號通路等。根據-lgP值由大到小進行排序,選取排名前20的信號通路進行展示,見圖6。

圖5 GO功能富集分析結果

圖6 KEGG通路富集分析結果

2.7 分子對接結果 經過檢索,確定與足細胞損傷關聯最大的5個核心靶點分別是EGFR、MMP9、STAT3、VEGFA及PTGS2,將其與關鍵有效活性成分槲皮素、山柰酚、柚皮素進行分子對接,得出分子對接Total Score(表2)。 EGFR、MMP9、PTGS2與槲皮素、山柰酚之間,以及EGFR、MMP9與柚皮素之間,均有一定的結合活性。Total Score>5.00的分子對接圖見圖7。

表2 復方仙草顆粒關鍵有效活性成分與核心靶點對接后的Total Score

圖7 Total Score>5.00的分子對接圖

3 討 論

腎為“先天之本”,藏精化氣、主生殖,為元陰元陽封藏之處。足細胞由細胞體、初級突起和分支足突組成,其中足突可以調節腎臟的濾過功能,防止蛋白等重要物質流失體外,與腎臟藏精功能息息相關,因而足細胞的發育、增殖和凋亡與元陰元陽有關,如腎氣不固、藏精功能失常,則可出現足細胞損傷。除了腎虛不固,脾之運化、統攝失常亦在足細胞損傷中發揮了重要作用:腎精首源于先天父母,亦受后天脾胃資助,脾胃能正常運化水谷、輸布精微,則腎精充足;若先天稟賦不足,后天飲食失養,元陰元陽生成乏源,則可導致足細胞凋亡[16]。與此同時,痰濕熱邪致使腎臟功能失常,痰濕內阻、氣機不暢則損傷足細胞,熱邪內盛、腎絡受損可引起腎足細胞功能異常。因此,足細胞損傷是“脾腎虛”“痰濕熱內盛”二者共同作用的結果,治療上應立足于“虛”和“邪實”,以健脾益腎補虛、清熱利濕祛邪為主要治療原則。復方仙草顆粒包含八仙草、三七、大黃、黃芪、薏苡仁、甘草6味中藥,以益腎健脾、清熱利濕為組方原則。方中八仙草入肝經,其味苦、辛,性寒,具有清熱解毒、止痛、散瘀止血之功效,現代研究表明八仙草有抗氧化的作用,可以減輕氧化應激所致的足細胞損傷[17];三七入肝經、胃經,其味甘、微苦,性溫,具有散瘀止血、消腫定痛之功效,其主要成分三七總皂苷通過抗氧化應激作用進而抑制足細胞凋亡[18];大黃入脾經、胃經、大腸經、肝經、心經,其味苦,性寒,具有清熱瀉火、涼血解毒之功效,其有效成分大黃酸能夠抑制足細胞的nephrin表達[19],對于改善足細胞損傷具有積極作用;黃芪入脾經、肺經,其味甘,性微溫,具有固表止汗、補氣升陽、利水消腫之功效,其有效成分可以改善游離脂肪酸或高糖所致的足細胞凋亡,同時通過抗氧化作用修復損傷的足細胞[20];薏苡仁入脾經、胃經、肺經,其味甘、淡,性涼,具備利水滲濕、健脾止瀉、解毒散結之功效,其提取物可以有效抑制糖尿病腎病大鼠的腎臟纖維化進程及改善炎癥反應[21];甘草入心經、脾經、肺經、胃經,其味甘,性平,具有補中益氣、清熱解毒等功效,其有效成分甘草酸可以抑制高糖所致的足細胞損傷[22]。足細胞損傷是糖尿病腎病早期病理改變之一,與糖尿病腎病的進展息息相關[23]。一項關于早期糖尿病腎病的臨床研究表明,復方仙草顆?？梢愿纳圃缙谔悄虿∧I病患者機體的炎癥狀態[24]。由此可見,應用復方仙草顆粒治療足細胞損傷具有一定的理論支持。本研究通過網絡藥理學方法探討復方仙草顆粒治療足細胞損傷的可能機制,為足細胞損傷相關疾病的臨床治療提供參考。

本研究最終獲得與足細胞損傷關聯最大的5個核心靶點,即復方仙草顆粒治療足細胞損傷的核心靶點,分別是EGFR、MMP9、PTGS2、STAT3、VEGFA。EGFR是各類能夠激活和控制細胞增殖、分化及凋亡的細胞內信號分子的停靠位點。有研究表明,腎小球腎炎患者腎臟組織中的肝素結合性表皮因子能夠激活足細胞的EGFR信號傳導[25],阻斷這一過程能夠為炎癥性腎臟疾病的治療提供新思路。另一項研究顯示,槲皮素可通過調節EGFR信號通路進而抑制足細胞凋亡,減輕足細胞損傷[26]。MMP9是腎小球足細胞發生上皮-間質轉化后的表面標志物之一,抑制MMP9表達能夠減慢足細胞的上皮-間質轉化進程,進而靶向保護足細胞,同時減少糖尿病腎病早期的尿蛋白水平[27]。還有研究表明,視黃酸受體α的過表達能夠下調受損足細胞中MMP9的表達并抑制其活性,從而保護腎功能并延緩體內腎小球硬化的進程[28]。PTGS2作為腎臟血流動力學和炎癥的關鍵調節因子,其過表達可能會導致足細胞損傷[29-30],從而導致尿蛋白增加。STAT3是機體重要的靶點信號,Janus激酶2/STAT3信號通路與炎癥反應及細胞的生長、凋亡相關。當磷酸化STAT3表達水平上升時,炎癥因子表達水平也隨之增加,進而導致足細胞損傷[31]。VEGFA對于調節足細胞的Ca2+穩態和保護足細胞存活具有其積極意義,但腎小球中過度表達的VEGFA會激活VEGFA/VEGF受體2信號通路和去氧腎上腺素信號通路,導致足細胞損傷[32-33]。將上述核心靶點與復方仙草顆粒的關鍵有效活性成分槲皮素、山柰酚、柚皮素進行分子對接,結果顯示,EGFR、MMP9、PTGS2與3個關鍵有效活性成分具有良好的對接效能(除PTGS2與柚皮素外),其中EGFR與槲皮素、MMP9與柚皮素、PTGS2與槲皮素展現出較好的對接效能。由此推測,復方仙草顆粒的關鍵有效活性成分槲皮素、山柰酚、柚皮素作用于EGFR、MMP9、PTGS2、STAT3、VEGFA后,通過抗炎、抗細胞凋亡等方式發揮治療足細胞損傷的作用。

本研究GO功能富集分析結果顯示,復方仙草顆粒治療足細胞損傷的相關靶點涉及酶結合、抗氧化活性等分子功能,以及與氧化應激相關的生物學過程。本課題組的前期研究顯示,在阿霉素誘導的人腎足細胞損傷中,復方仙草顆?？赏ㄟ^降低活性氧簇水平來抑制氧化應激水平,從而實現對腎足細胞的保護作用[34],這與GO功能富集分析的結果相符。本研究通過KEGG通路富集分析發現,多種通路共同參與復方仙草顆粒治療足細胞損傷的過程,包括糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、NF-κB信號通路、VEGF信號通路、FoxO信號通路、AMPK信號通路、壞死性凋亡等。其中,AGE-RAGE能通過氧化應激及NF-κβ信號通路,刺激生長因子和細胞因子的增殖,最終導致足細胞損傷及腎小球硬化[35],干預AGE-RAGE信號通路能夠有效減輕足細胞損傷及延緩腎小球硬化進程。同時,NF-κB信號通路在高糖環境下會被激活,進而誘導足細胞發生上皮-間質轉化及遷移[36],從而導致足細胞損傷。VEGF信號通路能夠刺激內皮細胞的增殖、增加血管的通透性、促進新血管生成[37],對減輕腎小球病變具有一定的積極意義。FoxO信號通路能夠有效調節氧化應激、細胞凋亡,活化FoxO1可以抑制足細胞上皮的間充質細胞轉化[38]。一項細胞實驗結果顯示,復方仙草顆粒能夠通過降低FoxO4在腎臟組織中的表達,以抑制其對腎足細胞凋亡的誘導作用[39]。當出現急性腎損傷時,AMPK信號通路會被激活,進而引發一系列細胞損傷[40],因此,干預AMPK信號通路能夠減輕足細胞損傷。壞死性凋亡與腎臟缺血-再灌注損傷相關,也參與缺血-再灌注損后的腎臟纖維化進程,抑制壞死性凋亡則可明顯改善缺血-再灌注損傷后的腎功能,減輕足細胞損傷[41]。

綜上所述,復方仙草顆粒治療足細胞損傷具有多成分、多靶點、多通路協同作用的特點,復方仙草顆粒的多個有效活性成分可能通過EGFR、MMP9、PTGS2、STAT3、VEGFA等主要靶點作用于多個信號通路,來發揮抗氧化應激、抗炎及抗細胞凋亡等作用,從而減輕足細胞損傷。目前,復方仙草顆粒治療足細胞損傷的部分作用機制已得到實驗驗證,但是更多的作用機制尚未被證實,本研究的結果或許能夠為后續研究提供方向和參考,未來需要更多的實驗性研究對本研究結論加以驗證。