細胞體外共培養模型在中樞神經系統疾病的應用研究進展▲

朱健敏 陳 煒 吳 林

(1 廣西中醫藥大學科學實驗中心,廣西南寧市 530200;2 廣西中醫藥大學第一附屬醫院,廣西南寧市 530023)

【提要】 細胞間的通訊是正常生理學中不可缺少的活動,但單細胞體外培養模型不能很好地反映人體復雜的細胞通訊活動。細胞體外共培養模型可以通過模擬體內環境,觀察不同細胞與細胞之間,以及細胞與胞外環境之間的相互作用,廣泛應用于神經退行性疾病的研究。神經炎癥引起的神經元損傷與神經退行性疾病發生機制的關系目前尚未完全明確。細胞體外共培養模型可以用于研究特定的炎癥分子途徑,直觀了解大腦細胞之間復雜的相互作用,從而進一步揭示神經細胞與神經膠質細胞之間的串擾機制。本文對不同細胞體外共培養模型在中樞神經系統疾病中的應用研究進行綜述,以期為中樞神經系統疾病的基礎研究提供參考。

細胞間的通訊活動廣泛參與人體的生理及病理過程,如神經遞質、生長因子、細胞外囊泡等介導的通訊活動。細胞體外共培養研究證實供體細胞和受體細胞之間存在RNA轉移,這為研究腫瘤與腦微環境多細胞串擾機制和腫瘤靶向治療提供了新思路[1]。神經炎癥提示中樞神經系統動態平衡紊亂,是當前神經退行性疾病研究的重點[2],但神經炎癥與神經退行性疾病發病機制的關系目前尚未完全明確。可靠的細胞體外共培養模型是臨床驗證中樞神經系統疾病治療方法的重要工具。本文就近年來不同細胞體外共培養模型在中樞神經系統疾病中的應用研究進行綜述。

1 細胞體外共培養模型

由于單細胞體外培養模型容易受到培養環境的影響而減少原有的生物學特征,故在20世紀80年代,便有學者提出“細胞體外共培養模型”的概念,隨后該概念日漸成熟[3]。細胞體外共培養模型是指在同一環境中進行2種或2種以上的細胞培養,根據不同的實驗設計目的,可分為直接接觸共培養、間接接觸共培養等培養模型,還可以細分為直接混合共培養、間接共培養、3D共同培養系統及腦片共培養等培養模型。細胞體外共培養模型可以最大限度地模擬不同細胞之間生物功能信號的相互作用,并促進細胞的定向增殖,建立與體內相似的培養微環境。細胞體外共培養模型的選擇取決于細胞之間的黏附狀態,其中直接混合共培養模型操作較為簡單,且費用較低,但是難以對單一細胞蛋白進行分析,并且其結果的分析和解讀較為困難。間接共培養模型指的是將2種以上類型細胞置于不同的環境中,通過培養室、過濾器、凝膠等儀器觀察體液因子介導細胞間相互作用,進而研究不同類型細胞活動之間的分子機制。其中Transwell小室共培養模型被視為間接共培養模型的標準化方法[4]。3D共同培養系統可同時培養3種以上的人類細胞,滿足參與神經炎癥的不同類型細胞間串擾機制的研究需求[5],形成更加接近人體試驗的數據,且可以進行較為準確的定量與定位分析,但其費用較為昂貴且操作要求較高。腦片共培養的缺點在于細胞容易氧化壞死,不利于用于長時間的培養研究。

2 細胞體外共培養模型在中樞神經系統疾病中的應用

2.1 細胞體外共培養模型在帕金森病中的應用 帕金森病是一類與年齡相關的神經退行性病變,臨床癥狀以行動遲緩、強直、靜止性震顫等運動癥狀及抑郁、睡眠障礙等非運動癥狀多見[6]。目前認為其主要發病機制為α-突觸核蛋白(α-synuclein,αSYN)聚集、氧化應激與神經炎癥,病理特征表現為黑質中多巴胺能神經元的喪失,以及在路易體中天然αSYN絲狀聚集[7]。此外,鐵離子的沉積會加速αSYN原纖維的類朊蛋白增殖[8],加快帕金森病的進展。

2.1.1 細胞體外共培養模型在帕金森病分子機制研究中的應用:近年來,帕金森病患者腦內鐵離子異常沉積進而加重黑質-紋狀體系統多巴胺能神經元功能損傷的研究逐漸受到關注[9-10]。鐵沉積水平與帕金森病患者認知功能缺損的嚴重程度相關,但其具體分子機制尚未闡明[11]。目前,有關鐵沉積與多巴胺能神經元氧化應激、神經炎癥之間關系的研究較多,而星形膠質細胞(astrocyte,AS)等神經膠質細胞在維持腦內鐵穩態方面具有重要的作用[12]。故腦內細胞的體外共培養模型能模擬體內復雜的生理環境,可用于基礎實驗研究。許曼曼[12]采用Transwell小室共培養大鼠原代AS與腹側神經元細胞發現,AS可加快鐵離子在胞內的轉入與轉出,其機制可能是其通過蛋白激酶C途徑激活6-羥基多巴胺,促進缺氧誘導因子α與膜鐵轉運蛋白1等結合,加快鐵離子在胞內的轉入與轉出,從而加重神經元功能的減退。有學者將經過黑色素處理的神經膠質細胞與神經元細胞混合培養,結果顯示神經膠質細胞具有減輕帕金森病黑色素神經毒性作用的潛力[13]。AS與神經元細胞共培養可通過核因子E2相關因子2系統誘導戊糖酸途徑活化,保護神經元細胞免受多巴胺毒性的影響[14]。與單培養模型相比,共培養小膠質細胞可下調病原體反應途徑,上調穩態功能途徑,并促進抗炎和重塑細胞因子反應,表明共培養模型或許更適合模擬小膠質細胞的生理學特性[15]。有學者通過建立誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)產生的AS與小膠質細胞體外共培養模型,分析兩種膠質細胞在β淀粉樣蛋白(amyloid-beta protein,Aβ)和αSYN清除過程中的協調作用,結果發現與AS相比,小膠質細胞能更好地降解聚集的Aβ和αSYN,這兩種細胞類型之間的相互作用涉及蛋白質聚集體從AS轉移到小膠質細胞,該研究結果對于研究神經退行性疾病的新治療靶點具有重要意義[16]。

2.1.2 細胞體外共培養模型在帕金森病治療研究中的應用:Du等[17]使用Transwell小室插入物建立誘導iPSC衍生的神經元-AS共培養模型,結果發現AS可以減輕線粒體毒素損害,可能起到治療帕金森病患者多巴胺能神經元中的線粒體功能障礙的作用。有學者通過建立神經元PC12細胞和N9小膠質細胞的間接共培養模型,研究白藜蘆醇二聚體ε-長春花素對小膠質細胞活化的抑制作用,結果發現ε-長春花素可以抑制PC12細胞因氧化應激誘導的細胞凋亡,還可以抑制小膠質細胞向M1表型極化,防止神經細胞凋亡[18]。

2.2 細胞體外共培養模型在阿爾茨海默病中的應用 阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease AD)是一種無法治愈的神經退行性疾病,臨床表現為進行性認知功能下降,發病初期患者的短期記憶功能受損最為明顯,疾病發展至后期還會影響語言、情緒、運動與生理功能[19],主要發病機制包括淀粉樣聚集、神經炎癥等[20],病理特征主要為Aβ積累、磷酸化tau形成、神經膠質細胞過度活化和神經元丟失[21]。

2.2.1 細胞體外共培養模型在AD分子機制研究中的應用:在AD早期,神經元、神經膠質細胞參與的神經炎癥會驅動疾病隱匿進展,最終導致其出現認知障礙,故細胞病理學是早期AD研究的重點[22]。利用細胞體外共培養模型探討神經元與神經膠質細胞之間的相互作用,對揭開AD致病分子機制至關重要[23]。目前尚缺乏能夠全面觀察AD患者大腦中多階段細胞間相互作用的體外細胞模型[24]。但AD神經3D共同培養系統模型可利用微流體裝置高度真實模擬AD患者的大腦平臺,反映神經元-小膠質細胞-AS炎癥反應[25]。該模型將人類神經元、AS和小膠質細胞共培養以模擬AD環境,其中中央腔室裝載神經元/AS分化細胞,而角室裝載小膠質細胞,中央室和角室通過遷移通道連接,可觀察小膠質細胞在單細胞分辨率下的實時遷移活動,如Aβ聚集、tau磷酸化、小膠質細胞募集、神經元-小膠質細胞相互作用的神經毒性作用,這為研究AD的神經炎癥分子機制提供了有效的模型,并可能有助于尋找新的治療靶點[21]。

外泌體是一種小細胞外囊泡,直徑為20～120 nm[26],可以通過細胞通訊和分子運輸,參與神經毒性[27]、神經退行性疾病[28]的發生、發展過程。研究表明,AD患者腦外泌體富含寡聚Aβ[29],將與紅色熒光蛋白標記的外泌體共同孵育3 h的SH-SY5Y神經細胞置于Transwell小室下室,以及iPSC AF22供體細胞接種在孔徑為0.4 μm的聚碳酸酯膜過濾器上共培養24 h,結果顯示這些紅色熒光蛋白標記的外泌體在與共培養的神經元一起孵育時被神經細胞通過胞吞作用消化,外泌體能將Aβ低聚物在神經元之間進行傳播,從而引起細胞毒性,成為AD的新型細胞間信使[30-31]。研究顯示,將AS單層單獨培養3 d后,與神經元以體積比為2 ∶5的比例繼續共培養7 d,然后將小膠質細胞與神經元以體積比為1 ∶5的比例接種于AS-神經元頂部,或可作為研究AD神經炎癥的共培養模式[32]。AD反應性AS對神經元的非細胞自主毒性高度依賴AS和神經元的細胞比例,但混合比例的培養要求較高,難以精確調控細胞比例[33]。

2.2.2 細胞體外共培養模型在AD治療研究中的應用:神經干細胞(neural stem cell,NSC)移植是AD的主要治療方法,NSC的分化及營養因子的分泌受腦內微環境的影響,目前NSC與各種膠質細胞之間的分子機制尚未完全明確[34]。有學者將原代神經元細胞置于Transwell下室,在Transwell上室添加原代AS、小膠質細胞、NSC,并分別加入含fAβ25-35細胞培養基,結果顯示,NSC可減少Aβ誘導的神經元凋亡[35]。將家族性AD突變的神經細胞與間充質干細胞衍生的外泌體共同培養,可以降低Aβ水平并上調記憶突觸可塑性相關基因的表達[36],但大腦中間充質干細胞外泌體的數量有限,應尋找提高間充質干細胞外泌體大腦靶向能力的方法。

2.3 細胞體外共培養模型在缺血性腦卒中中的應用 缺血性腦卒中約占全部腦卒中的70%[37-38],主要臨床表現為頭暈、肢體乏力、語言及視覺功能異常等,病理特征為腦血管床內不可逆的損傷及形成梗死周圍區域[39],主要病理機制包括神經炎癥、血腦屏障損傷、內質網應激等[40],其中缺血后神經炎癥的繼發性進展是腦損傷的重要原因。

2.3.1 細胞體外共培養模型在缺血性腦卒中分子機制研究中的應用:缺血性腦卒中發病機制復雜,涉及神經膠質、神經元、血管細胞和基質成分之間的相互作用,這些細胞或成分統稱為神經血管單元(neurovascular unit,NVU)[41]。由于缺血性腦卒中涉及的細胞單元復雜,目前尚缺乏靈敏性高且針對性強的診斷標志物[42],因此該病治療手段有限[43]。NVU可以限制較大的極性物質和潛在的神經毒性分子被動擴散到患者大腦中[44],而大多數缺血性腦卒中患者存在NVU功能障礙。有學者將大鼠腦血管內皮細胞與周細胞單獨培養或與AS混合培養,還有學者將上述細胞整合至Transwell小室共培養,以模擬缺血性腦卒中患者的血腦屏障,從而分析炎癥刺激下血腦屏障與NVU的互相作用,但由于NVU功能極為復雜,單純的2D培養存在局限性,或半透膜的存在缺乏流動性,使得細胞之間無法直接接觸[45-47]。研究表明,微流體平臺的NVU建模方式有利于分層培養3D細胞培養物(NVU芯片),通過改進生物技術,可以精確控制介質流量,以及調節培養微環境的參數[48-49],從而將原代腦血管內皮細胞與iPSC來源的AS和神經元共同培養在不同的通道上,并可在芯片底部自動進行培養基的抽吸、細胞混懸液的種植,建立體外缺血性腦卒中模型以供實驗研究之用[50]。但此實驗方法亦存在不足,一是應用熒光素鈉檢驗NVU屏障特性可能會受到動物體內陰離子對轉運蛋白的作用而出現結果偏倚;二是血腦屏障轉運蛋白的RNA分子水平機制復雜,未來仍需對乳腺癌耐藥蛋白1和葡萄糖轉運蛋白1等蛋白進行功能評估;三是該實驗系統操作難度較高,需要在相關專家指導下進行,推廣應用受限。

2.3.2 細胞體外共培養模型在缺血性腦卒中治療研究中的應用:小膠質細胞表型極化在缺血性腦卒中的神經炎癥過程中起著重要的作用,可維持神經元和血腦屏障的功能[51]。有學者將BV2小膠質細胞與人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y共培養,同時將長春西汀干預后的BV2小膠質細胞單獨缺氧缺糖培養后再與SH-SY5Y細胞在缺氧缺糖條件下共培養,結果表明,經長春西汀處理的BV2細胞可以減輕共培養系統中缺氧缺糖誘導的神經元損傷,其機制可能與長春西汀減少小膠質細胞中的磷酸二酯酶,抑制小膠質細胞M1表型,增強自噬通量,保護神經元的存活有關[52],初步驗證長春西汀或可作為新的神經保護劑。有學者將經過缺氧缺糖刺激的神經元細胞系N2a細胞與條件培養基刺激的BV2小膠質細胞共培養12 h,構建神經元-小膠質細胞共培養模型,發現褪黑素通過信號轉導和轉錄激活因子3途徑,調節小膠質細胞向抗炎表型分化,從而對缺血性腦卒中小鼠的神經起到保護作用[53],但該方法使用的是非原代培養細胞,或許未能真實地體現缺血性腦卒中的細胞受損機制。NSC的低存活率及低分化率限制其在缺血性腦卒中的應用,神經膠質細胞的活化可能影響NSC的增殖和分化[54]。研究顯示,將谷氨酸預處理的神經膠質混合細胞與NSC共培養,發現小膠質細胞和AS可誘導NSC的神經元分化并減少神經球的凋亡,將NSC與AS或小膠質細胞共同移植至缺血性腦卒中大鼠模型,可較好地改善大鼠的神經損傷[55],但此神經膠質細胞混合培養的方式增加了后續實驗定量與定性分析單類細胞作用的難度。間充質干細胞具有誘導神經元修復作用,將其與缺氧缺糖處理過的M17神經元細胞間接共培養,可通過降低炎癥因子表達水平,修復缺血性腦卒中大鼠模型的神經功能[56]。

2.4 細胞體外共培養模型在肌肉萎縮側索硬化中的應用 肌肉萎縮側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ASL)是一種進展速度較快且可累及上下神經元的一類神經退行性疾病,臨床表現為嚴重的肌肉萎縮,最終導致呼吸系統肌肉去神經支配而死亡。目前ASL的具體發病機制尚未闡明,但神經炎癥已被證實是該病的重要發病機制之一[57]。

經典的核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)通路參與ASL的發病過程。有學者將運動神經元接種在涂有粘連蛋白的96孔板中,2 d后按每孔35 000個細胞的密度接種小膠質細胞并共培養72 h,結果顯示,運動神經元存活率明顯下降,NF-κB信號通路相關蛋白表達水平明顯升高,且上述改變可被NF-κB抑制劑消除,說明小膠質細胞中NF-κB信號傳導的缺失可減少運動神經元的死亡,這或可為ALS治療提供新的治療靶點[58],但該研究亦存在不足,即僅采用一種膠質細胞模擬復雜的神經炎癥過程。Smethurst等[59]使用iPSC衍生的運動神經元與AS共培養來模擬散發性ALS的早期細胞類型特異性特征,將未處理的AS與種子聚集的運動神經元間接共培養7 d,發現TDP-43蛋白寡聚體對運動神經元具有毒性作用,但對AS無毒性作用,且AS可以通過減少TDP-43蛋白寡聚體的毒性來保護種子聚集的運動神經元。目前,有關細胞體外共培養模型在ASL治療中的應用研究較少,這可能與該病的致病機制尚未明確有關。

3 小結與展望

神經膠質細胞與神經元細胞的體外共培養模型是研究神經系統疾病的重要模型,永生細胞系增加了神經系統疾病研究中細胞培養技術的可重復性[60],目前已成為藥理學和毒理學研究的重要工具。細胞體外共培養模型是多種基礎疾病研究常用的體外模型,可以較為直觀地演示疾病發生與發展的病理過程,且有利于對細胞進行人為干預,減少動物模型體內變量的影響,直接觀察細胞之間的相互交流,還可以作為高通量藥物的刷選手段,避免動物倫理問題。但是細胞體外共培養模型的原代培養細胞存在潛在問題:一是細胞因失去體內環境而有可能缺乏特征,以及細胞本身的表型被活化[61];二是人類大腦是復雜且精細的器官,腦神經細胞的結構精細、功能活躍,細胞系的傳代及干預可能使得細胞共培養的體外模型失去體內表型而降低其研究結果的可靠性。

近年來,iPSC及其衍生的各種原代人類細胞的批準和上市,特別是人工芯片的發展,讓細胞體外共培養模型能更真實地模擬疾病發生與進展過程。然而,由于捐贈者不同的限制,體外基礎實驗的一致性受到了影響。但亦有研究顯示,不同捐獻者的iPSC并不會影響實驗結果[62]。此外,由于重編程、細胞選擇、體外培養過程漫長等問題,iPSC模型可能導致表觀遺傳發生變化。盡管細胞體外共培養模型具有局限性,但其可以在明確的實驗條件下提供比單細胞培養模型更真實的三維視圖和信息,故其亦可用于科學基礎研究。