基于FoxP3、RORγt及相關細胞因子探討半夏瀉心湯對慢性萎縮性胃炎的干預機制▲

韋玉娜 羅旋特 艾 軍 游 琛 何 泉 張亞萍

(廣西中醫藥大學基礎醫學院,廣西南寧市 530200)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)是胃黏膜因受致病因素反復刺激而出現固有層腺體萎縮或腸上皮化生、異型增生的一種慢性消化道疾病[1],主要表現為脹滿、納呆、胃脘痛等癥狀[2]。CAG的發病機制尚不完全清楚,目前認為與幽門螺桿菌感染、年齡、免疫因素等有關[3]。正常胃黏膜-慢性淺表性胃炎-CAG-腸上皮化生-異型增生-胃癌是胃癌發生的主要病理通路[4]。據統計,CAG的癌變率可達10%～14%[5],亞洲是CAG 發生的主要地區,其中我國的CAG發病率最高[6],且我國2020年胃癌新發病例數在所有癌癥中位居第4[7]。及時阻斷CAG的進展,對于降低胃癌發病率具有重要意義。

Th17與組織炎癥、自身免疫疾病的發生有著密切聯系,其可分泌白細胞介素(interleukin,IL)-17、 IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)等炎癥因子,其中IL-17是Th17的特異性細胞因子,可與中性粒細胞、上皮細胞等細胞的IL-17受體結合從而發揮促炎作用[8-9]。調節性T淋巴細胞(regulatory T lymphocyte,Treg)是一類能介導多種免疫效應的T淋巴細胞亞群,可通過分泌轉化生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)、IL-10來促進自身分化,同時TGF-β、IL-10還可通過誘導免疫細胞凋亡進而抑制炎癥反應[10]。Th17和Treg通過分泌細胞因子以相互作用,共同維持機體的免疫平衡[11]。Th17和Treg的分化分別受轉錄因子RAR相關孤兒受體γt (RAR-related orphan receptor gamma t,RORγt)和叉頭框蛋白P3(forkhead box P3,FoxP3)的調控,而RORγt和FoxP3與胃癌的發生和病理變化高度相關[12-13]。

目前,西醫治療CAG的常用藥物有葉酸、維酶素等[2],其中葉酸具有抑制胃黏膜炎癥反應和修復胃黏膜的作用[14]。中醫藥治療CAG具有整體化、個性化、副作用少的優勢[15]。中藥方劑半夏瀉心湯出自張仲景的《傷寒雜病論》,是治療痞滿的經典方劑,全方由法半夏、黨參、干姜、黃連、黃芩、炙甘草、大棗組成,具有健脾益氣、解毒消痞的功效。潘小亮等[16]應用加味半夏瀉心湯治療CAG,發現總有效率達96.7%。有研究報告,黃連中的黃連素可抑制IL-17、IL-6等促炎因子的轉錄,促進抑炎因子TGF-β的轉錄[17],甘草水提物可以提高IL-10的表達[18]。由此可推測作為黃連、甘草等中藥復合體的半夏瀉心湯可能也具有類似作用。已有研究報告,半夏瀉心湯可降低CAG患者的血清IL-6、TNF-α水平[19]。但半夏瀉心湯對CAG患者機體Th17相關細胞因子(IL-17)、Treg相關細胞因子(IL-10、TGF-β)及轉錄因子FoxP3和RORγt是否有影響,未見相關研究報告。本研究通過觀察半夏瀉心湯對CAG大鼠模型臨床癥狀、胃黏膜組織病理學變化、Th17和Treg相關細胞因子含量、FoxP3和RORγt表達的影響,闡釋其對CAG的干預機制,為今后臨床治療和實驗研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體級雄性SD大鼠48只,7周齡,體質量250～300 g,由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供[實驗動物生產許可證號:SCXK(湘)2019-0004]。所購大鼠均飼養于廣西中醫藥大學仙葫校區無特定病原體級動物實驗室。飼養環境:室溫(21±3)℃,濕度范圍50%～70%,晝夜等分照明。喂養條件:統一提供常規大鼠飼料和滅菌水,自由飲水。

1.2 藥物與試劑 半夏瀉心湯組方為黃芩16 g、干姜16 g、黨參16 g、炙甘草16 g、法半夏14 g、大棗10 g、黃連5 g,實驗用中藥材均選用農本方?濃縮中藥配方顆粒[培力(香港)健康產品有限公司]。葉酸片(天津力生制藥股份有限公司,國藥準字H12020215,規格為5 mg/片),0.3%氨水(Sigma-Aldrich?Lab &Production Material公司,批號:SHBK0854),脫氧膽酸鈉溶液(Solarbio?Life Sciences公司,貨號:D8330;濃度為40 mmol/L)。大鼠IL-10、IL-17、TGF-β ELISA試劑盒(江蘇晶美生物科技有限公司,批號分別為JM-01602R1、JM-01495R1、JM-01588R1),TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒-POD(博士德生物,貨號:MK1011),TBS緩沖液(武漢博士德生物工程有限公司,貨號:AR0031),DAB顯色液(武漢博士德生物工程有限公司,貨號:AR1022),TRIzol試劑(Invitrogen公司,貨號:15596026),DEPC處理水 (Invitrogen公司,貨號:4387937),反轉錄試劑(Thermo Fisher Scientific公司,貨號EP0442),THUNDERBIRD?qPCR Mix試劑盒(TOYOBO公司,貨號:QPS-201),引物由Invitrogen公司合成。

1.3 主要儀器 5430/R型臺式高速冷凍離心機(Eppendorf公司),Infinite M200 Pro型多功能酶標儀(TECAN公司),BX53型熒光正置顯微鏡(OLYMPUS公司),HISTOCENTRE 3型包埋機(Thermo Fisher Scientific公司),RM2255型全自動輪轉式切片機(徠卡顯微系統有限公司),LightCycler?96型實時熒光定量PCR儀(Roche公司)。

1.4 動物造模、分組及給藥 采用隨機數字表法,從48只大鼠中選取42只作為模型制備組,余下6只設為空白組。采用脫氧膽酸鈉加氨水聯合造模法[20-21]制備CAG大鼠模型,即每日用40 mmol/L的脫氧膽酸鈉溶液灌胃,每次灌胃量為10 mL/kg,1次/d,同時每日提供0.3%氨水(50 mL/只)供自由飲用。給予空白組大鼠滅菌水(50 mL/只)自由飲用。自造模開始第12周,每周處死2只模型制備組大鼠,剖取胃部組織經HE染色后置于光鏡下觀察以判斷是否造模成功,到第16周時經病理科醫師驗證已達到CAG診斷標準[2]。造模過程中有2只大鼠死亡。

將剩余的30只模型制備組大鼠按隨機數字表法分為模型組、葉酸組、半夏瀉心湯低劑量組、半夏瀉心湯中劑量組、半夏瀉心湯高劑量組,各6只。按10 mL/kg給予空白組和模型組大鼠灌喂生理鹽水,1次/d。用超純水溶解研磨后的葉酸片,按1.35 mg/kg給予葉酸組大鼠灌喂葉酸,1次/d。按成人與大鼠劑量比換算半夏瀉心湯的給藥劑量,現已知中藥湯劑的總克數為93 g,換算系數為6.3,假設人的體重為70 kg,則大鼠給藥劑量=人給藥劑量×換算系數=93/70×6.3≈8.37 g/kg,取該數值0.5倍即為低劑量組濃度,2倍即為高劑量組濃度,故給予半夏瀉心湯低劑量組、半夏瀉心湯中劑量組、半夏瀉心湯高劑量組大鼠的灌胃劑量分別為4.185 g/kg、8.37 g/kg、16.74 g/kg,1次/d。各組均連續灌胃12周。

1.5 樣本采集 給藥后12周,在禁食24 h后皮下注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉各組大鼠后,開腹取腹主動脈全血20 mL,室溫靜置30～60 min,之后以2 500 r/min轉速離心15 min以獲得血清,用于ELISA檢測。然后切取大鼠全胃組織,沿著胃小彎切開直至幽門處,剖開后用生理鹽水沖洗干凈,再將胃組織平均分成4份,其中一份用于HE染色進行組織病理學觀察,余下3份分別用于TUNEL染色、實時熒光定量PCR檢測、課題組其他實驗。

1.6 觀察及檢測相關指標

1.6.1 大鼠一般情況:實驗期間觀察各組大鼠皮毛、飲食量、排泄物性質等情況,并且定期稱量大鼠體質量。

1.6.2 HE染色觀察胃黏膜組織病理學變化:取材后使用多聚甲醛進行標本組織固定;用乙醇和二甲苯分別進行脫水、透明處理;對樣品組織進行石蠟包埋后,進行切片處理;經二甲苯脫蠟后進行常規HE染色;滴加中性樹膠封片,置于顯微鏡下觀察。

1.6.3 ELISA檢測血清細胞因子含量:根據ELISA試劑盒的操作說明書,加入稀釋后呈濃度梯度的標準品(IL-10、IL-17、TGF-β)50 μL,在待測樣品微孔內加入稀釋后的待測樣品(含40 μL稀釋液和10 μL待測樣品)并拍勻孵育30 min,清洗5次,加入100 μL酶標試劑,封板后37 ℃孵育1 h。去除微孔內液體并用預先配制好的清洗液反復清洗5次并拍去多余液體。每個微孔依次滴加A、B顯色劑各50 μL,拍勻,37 ℃避光反應15 min。加入終止液50 μL,最后通過多功能酶標儀測定450 nm吸光度,根據標準曲線計算樣品中各細胞因子含量。

1.6.4 TUNEL染色觀察胃黏膜細胞凋亡情況:按照1.6.2步驟制作脫蠟標本組織后,在切片上滴加用0.01 mmol/L TBS緩沖液稀釋的蛋白酶K(稀釋比例為1 ∶200),室溫消化8 min,再用0.01 mmol/L TBS緩沖液清洗3次,加入40 μL標記緩沖液以保持濕潤。取末端脫氧核苷酸轉移酶和Biotin-dUTP各2 μL,加入36 μL標記緩沖液中并攪拌混勻作為標記液。甩去多余液體后加入標記液,37 ℃標記2 h,用0.01 mmol/L TBS緩沖液清洗3次。滴加封閉液,37 ℃孵育30 min。取1 mL經抗體稀釋液稀釋后的鏈霉親和素-生物素(strept avidin-biotin complex,SABC),37 ℃孵育30 min。用DAB顯色液顯色,滴加蘇木素復染、堿性溶液返藍、中性樹脂封片。置于顯微鏡下觀察,細胞核顯棕色則為陽性細胞。

1.6.5 實時熒光定量PCR法檢測FoxP3 mRNA、RORγt mRNA相對表達水平:取樣本組織20 mg,按照試劑盒說明書的步驟,利用TRIzol試劑提取總RNA,通過分光光度計檢測RNA純度與濃度后,利用反轉錄試劑進行反轉錄獲得cDNA。然后進行實時熒光定量PCR檢測,反應體系包含12.5 μL qPCR Mix(2×)、2.5 μmol/L基因引物(上、下游引物各1 μL)、2.0 μL反轉錄產物、8.5 μL ddH2O。反應步驟為95 ℃預變性1 min,95 ℃變性15 s、58 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s(循環40次),72 ℃末段延伸5 min。以GAPDH作為內參基因,采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平,引物信息見表1。

表1 引物信息

1.7 統計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計量資料以(x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,采用LSD-t檢驗(方差齊)或Dunnett′s T3檢驗(方差不齊)進行兩兩比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 6組大鼠的一般情況 在實驗期間,與空白組大鼠相比,模型組大鼠毛色泛黃且光澤度下降,飼養盒內可見較多掉落鼠毛,食盒內的食料剩余量較多,大便稀溏,肛周潮濕,體質量下降。給予藥物干預后,葉酸組和半夏瀉心湯各劑量組大鼠毛色光澤度有一定改善,飲食量增大,大便情況較模型組有不同程度改善,肛周毛發干燥,體質量快速增長,其中半夏瀉心湯低劑量組大鼠的改善情況最好,且改善程度略優于葉酸組。

2.2 6組大鼠胃黏膜組織病理學變化 空白組大鼠胃黏膜固有層腺體數量正常、排列規則且緊密。模型組大鼠胃黏膜固有層出現淋巴細胞浸潤,腺體數量減少伴囊性擴張,部分區域還可見潘式細胞。與模型組相比,葉酸組及半夏瀉心湯各劑量組大鼠胃黏膜囊性擴張消失或減少,固有腺體數量不同程度增多,其中以半夏瀉心湯低劑量組改善情況最為明顯。見圖1。

圖1 6組大鼠胃黏膜組織病理學變化(HE染色,×200)

2.3 6組大鼠血清各細胞因子含量的比較 與空白組大鼠相比,模型組大鼠血清IL-10、IL-17、TGF-β含量均升高(均P<0.05);與模型組大鼠相比,半夏瀉湯各劑量組和葉酸組大鼠血清IL-10、IL-17、TGF-β含量均下降(均P<0.05),其中半夏瀉心湯低劑量組大鼠上述細胞因子含量最低(均P<0.05)。見表2。

表2 6組大鼠血清IL-10、IL-17、TGF-β含量的比較(x±s,pg/mL)

2.4 6組大鼠胃黏膜細胞凋亡情況的比較 與空白組大鼠相比,模型組大鼠胃黏膜細胞TUNEL染色陽性率升高(P<0.05);與模型組大鼠相比,半夏瀉心湯各劑量組和葉酸組大鼠胃黏膜細胞TUNEL染色陽性率均降低(均P<0.05),其中半夏瀉心湯低劑量組大鼠的胃黏膜細胞TUNEL染色陽性率最低(均P<0.05)。見圖2和表3。

圖2 6組大鼠胃黏膜細胞凋亡情況(TUNEL染色,×400)

表3 6組大鼠胃黏膜細胞TUNEL染色陽性率的比較(x±s,%)

2.5 6組大鼠胃黏膜組織FoxP3 mRNA、RORγt mRNA相對表達水平的比較 與空白組相比,模型組大鼠胃黏膜組織FoxP3 mRNA、RORγt mRNA表達水平均升高(均P<0.05)。與模型組相比,半夏瀉心湯各劑量組和葉酸組大鼠胃黏膜組織FoxP3 mRNA、RORγt mRNA表達水平均下降(均P<0.05),其中半夏瀉心湯低劑量組大鼠胃黏膜組織FoxP3 mRNA、RORγt mRNA表達水平低于其他半夏瀉心湯劑量組,FoxP3 mRNA表達水平亦低于葉酸組(均P<0.05)。見表4。

表4 6組大鼠胃黏膜組織FoxP3 mRNA、RORγt mRNA相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

CAG的臨床癥狀與我國傳統醫學中“痞滿”的癥狀表現相似,故可將其歸于“痞滿”范疇[2]。關于“痞滿”的病因,《丹溪心法·卷三》記載“痞者,與否同,不通泰也。由陰伏陽蓄,氣與血不運而成。處心下,位中央,膜滿痞塞者,皆土之病也……有中氣虛弱,不能運化精微為痞者;有飲食痰積,不能施化為痞者;有濕熱太甚為痞者”[22];《諸病源候論·卷之十八 濕病諸候(凡三論)》又有“痞者,塞也,言腑臟痞塞不宣通也。由憂恚氣積,或墜墮內損所致”之說[23]。由此可見,CAG的病因復雜,自身情志、飲食失常或外感邪氣侵入均可致病,一般認為該病是本虛標實之證,虛則是脾胃虛弱、胃陰虧損,實則為瘀血、痰濕、濕熱等病理產物阻滯胃絡經脈氣血運行[2],導致脾胃升降失和、濁陰不降、清陽不升,從而出現脹滿、納呆、胃脘痛等癥狀。半夏瀉心湯出自張仲景所著的《傷寒雜病論》,方中法半夏、干姜可降逆祛痰、溫胃化飲、祛除痰濕和寒濕,黃連、黃芩可清熱燥濕、祛除濕熱,黨參、炙甘草、大棗可補中益氣,增強中焦脾胃樞機運轉之力,全方寒熱并用,具有健脾消痞、恢復脾胃正常升降的作用。段馨[24]運用半夏瀉心湯加減治療CAG,在緩解口干口苦、惡心嘔吐、上腹痞滿等癥狀方面均可獲得較好效果。本研究結果顯示,模型組大鼠毛發光澤度下降,大便稀溏,體質量下降,胃黏膜固有腺體減少;而給予藥物干預后,半夏瀉心湯各劑量組大鼠毛色光澤度有一定改善,大便情況較模型組有不同程度的改善,體質量快速增長,胃黏膜固有腺體數量不同程度增多。這說明半夏瀉心湯可改善CAG相關臨床癥狀和病理改變。

CAG是胃黏膜病變進展為胃癌過程中的一個重要節點,免疫系統失衡貫穿該過程[3,25]。FoxP3是Treg的關鍵調節因子[26],Treg通過分泌IL-10、TGF-β等細胞因子發揮免疫抑制作用。其中,IL-10具有減弱提呈細胞活性,抑制多種免疫細胞功能以達到緩解炎癥反應、調節免疫的作用,這可能與IL-10可抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白C1信號通路從而影響巨噬細胞代謝有關[27]。TGF-β是調控各細胞生命周期的細胞因子,其與腫瘤微環境的形成與擴張關系密切[28]。Th17的分化受到RORγt調控,該細胞分泌的IL-17是中性粒細胞浸潤組織的重要驅動核心,可引發多種炎癥反應,同時對腫瘤細胞的生長也有促進作用[29]。Th17與Treg可分泌相應轉錄因子從而相互抑制,但當Th17與Treg比例失衡時可導致機體癌前病變的發生[30]。綜上,RORγt、FoxP3的表達情況與IL-10、IL-17、TGF-β的含量可在一定程度上反映機體內Th17/Treg的分化情況,以及胃黏膜病變進展至胃癌的情況。

本研究結果顯示,與空白組相比,模型組大鼠胃黏膜凋亡細胞數量增加,血清IL-17、TGF-β、IL-10含量及胃黏膜組織FoxP3 mRNA、RORγt mRNA表達水平均升高(均P<0.05),提示此時CAG大鼠模型體內Th17/Treg平衡環境可能被破壞。與模型組相比,各藥物組大鼠胃黏膜凋亡細胞數量減少,血清IL-17、TGF-β、IL-10含量及胃黏膜組織FoxP3 mRNA、RORγt mRNA表達水平均降低(均P<0.05),由此推測半夏瀉心湯可能通過調節FoxP3 mRNA、RORγ mRNA的表達來調控Th17/Treg平衡,從而抑制胃黏膜細胞凋亡并減少炎癥因子的分泌,達到治療CAG的作用。

此外,在各劑量半夏瀉心湯組中,半夏瀉心湯低劑量組大鼠的病理表現改善最為明顯,細胞凋亡率最低,血清中各細胞因子表達水平及胃黏膜組織FoxP3 mRNA、RORγt mRNA表達水平亦最低,表明對于CAG大鼠模型而言,4.185 g/kg(低劑量)可能是最佳的半夏瀉心湯干預濃度。原因可能與黃連、黃芩等苦寒藥濃度有關。有研究顯示,苦寒藥對機體消化系統有雙向調節作用,即低濃度促進生理活動,高濃度抑制生理活動[31]。同時,較高濃度的黃連、黃芩會引起一定程度的胃黏膜損傷[32],相關炎癥因子表達可能受此影響而發生紊亂,導致免疫平衡再次被破壞。但其具體機制尚待進一步研究。

綜上所述,半夏瀉心湯能夠有效改善CAG大鼠的臨床癥狀和病理改變,低劑量的半夏瀉心湯可獲得最佳的干預效果。半夏瀉心湯干預CAG的作用機制可能與其下調大鼠胃黏膜FoxP3、RORγt的mRNA表達及相關細胞因子的含量有關。