不同劑量的地龍提取物對肺纖維化小鼠肺組織波形蛋白、α-平滑肌肌動蛋白表達水平及纖維化程度的影響▲

陳 宏 王文增 李可心 王玉葉 張明浩 鄧琳千 張佩穎 趙建云 陳 群

(1 黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院兒一科,黑龍江省哈爾濱市 150040;黑龍江省哈爾濱市阿城區人民醫院2 神經內科,3 檢驗科,黑龍江省哈爾濱市 150300)

肺纖維化是一種肺間質性疾病,是結締組織病的常見并發癥,其發病機制及誘因復雜,主要的病理過程為纖維細胞病理性增生分化為肌成纖維細胞,導致肺組織增厚,肺泡通氣量減少,進而引起呼吸困難和呼吸衰竭等癥狀[1-2]。目前尚無治療該病的特效藥物,患者預后較差,病死率高,且近年來發病率呈逐年上升趨勢[3]。西醫治療肺纖維化的常用藥物為吸入激素類氣霧劑、色甘酸鈉氣霧劑等,這些藥物雖然起效快,但長期服用容易產生耐藥性,而停藥后在誘因作用下容易導致疾病復發。中醫認為肺纖維化屬于“絡病”范疇,肺絡瘀阻是肺纖維化進展的主要病機。地龍是我國重要的中藥材之一,其是蚯蚓的干燥體,富含多種氨基酸,具有清熱定驚、通絡、平喘的功效[4],用于治療肺纖維化時可以發揮化痰散結、活血化瘀、消癥解毒、補益肺腎的作用。研究表明,波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白參與了肺纖維化的發生、發展[5-6]。我們推測,地龍可能通過調節波形蛋白及α-平滑肌肌動蛋白的表達而改善肺纖維化。為此,本研究探討不同劑量的地龍提取物對肺纖維化小鼠模型肺組織波形蛋白、α-平滑肌肌動蛋白表達水平及纖維化程度的影響,為地龍提取物治療肺纖維化提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性C57小鼠90只,8～10周齡,體重(22.3±3.5)g,購于青龍山動物繁殖中心[許可證號:SCXK(蘇)2017-0001],飼養于黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院動物實驗中心,環境溫度(23.0±1.5)℃,相對濕度(50.0±3.5)%,自由飲食。本研究遵循實驗動物護理指南的原則,并已通過黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院動物實驗倫理審查委員會審查及批準。

1.2 主要實驗試劑 百草枯(北京百靈威科技有限公司,批號:2020-35-5;濃度>98%);地龍干燥飲片(廣東天誠中藥飲片有限公司,批號:2020-20-8);波形蛋白一抗和α-平滑肌肌動蛋白一抗(Abcam公司,批號:ab32575、ab92547),HE染色試劑(上海舜田生物科技有限公司,批號:SBT10001),Masson染色試劑(北京索萊寶科技有限公司,批號:G1340),辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠二抗(湖北鴻鑫瑞宇精細化工有限公司,批號:275-632-5),GAPDH 抗體(Proteintech Group,Inc.,批號:ELK8632)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及建模方法:按隨機數字表法將小鼠分為空白組、模型組、高劑量組、中劑量組和低劑量組,每組18只。除空白組外,其余4組均通過一次性腹腔注射40 μmol/L百草枯(18 mg/kg)建立肺纖維化模型[7]。給予空白組小鼠腹腔注射等量無菌生理鹽水。

1.3.2 地龍提取物的提取方法及小鼠的干預方法:(1)地龍提取物的提取。將地龍干燥飲片剪碎并用乙醇回流提取2次,過濾回收后濃縮,并溶于5 mL生理鹽水備用。(2)小鼠的干預方法。建模后1周,分別給予高劑量組、中劑量組、低劑量組小鼠灌服80 mg/(kg·d)、40 mg/(kg·d)、20 mg/(kg·d)地龍提取物,1次/d,干預14 d。給予空白組和模型組小鼠灌服等量的生理鹽水。

1.3.3 Western blot檢測波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白的相對表達水平:以小鼠建模當天記為第0天,分別于建模后第14天、第21天和第28天,采集各組小鼠右肺組織,采用Western blot檢測波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白相對表達水平。于每個時間點,每組選取6只小鼠,采用脫頸椎法處死,解剖小鼠后分離其新鮮右肺組織并稱重,冰上研磨后,采用RIPA細胞裂解液裂解細胞,提取細胞總蛋白,利用二喹啉甲酸法檢測細胞蛋白濃度。取95 ℃高溫變性后的150 μg蛋白,通過SDS-PAGE分離等量蛋白,將蛋白轉至PVDF膜。使用5%脫脂牛奶在4 ℃下封閉PVDF膜1 h,用TBST洗膜3次,5 min/次,然后加入波形蛋白一抗(1 ∶500)、α-平滑肌肌動蛋白一抗(1 ∶500)及GAPDH一抗(1 ∶2 000),4 ℃濕盒孵育過夜,TBST洗膜3次,5 min/次,再將膜置于辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠二抗(1 ∶3 000)中,室溫孵育1 h,TBST洗膜5次,5 min/次。以GAPDH為內參蛋白,顯影曝光后,利用Image-Pro Plus圖像分析軟件分析蛋白條帶的灰度值[8]。

1.3.4 肺組織HE染色及Masson染色:建模第21天,采用脫頸椎法處死小鼠,用滅菌生理鹽水進行心臟灌流后,取左上肺組織,將其固定于4%的多聚甲醛,經石蠟包埋、切片后,進行HE染色和Masson染色,嚴格按照試劑說明進行操作。其中HE 染色的切片用于評估肺組織纖維化情況,Masson染色的切片用于觀察肺組織膠原沉積情況[9]。

1.4 統計學分析 采用SPSS 26.0軟件進行統計分析。計量資料用(x±s)表示,多組間比較采用方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同時間點各組小鼠肺組織波形蛋白表達水平的比較 建模后第14天,模型組及各劑量組小鼠肺組織的波形蛋白表達水平均高于空白組(均P<0.05)。建模后第21天及第28天,模型組小鼠肺組織的波形蛋白表達水平均高于空白組,高劑量組、中劑量組、低劑量組小鼠肺組織的波形蛋白表達水平均低于模型組(均P<0.05)。建模后第28天,高劑量組小鼠肺組織的波形蛋白表達水平低于低劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 不同時間點各組小鼠肺組織波形蛋白相對表達水平的比較(x±s)

2.2 不同時間點各組小鼠肺組織α-平滑肌肌動蛋白表達水平的比較 建模后第14天,模型組和各劑量組小鼠肺組織的α-平滑肌肌動蛋白表達水平均高于空白組(均P<0.05)。建模后第21天及第28天,模型組小鼠肺組織的α-平滑肌肌動蛋白表達水平均高于空白組,高劑量組、中劑量組、低劑量組小鼠肺組織的α-平滑肌肌動蛋白表達水平均低于模型組(均P<0.05)。建模后第28天,高劑量組小鼠肺組織的α-平滑肌肌動蛋白表達水平均低于中劑量組與低劑量組(均P<0.05)。見表2。

表2 不同時間點各組小鼠肺組織α-平滑肌肌動蛋白相對表達水平的比較(x±s)

2.3 各組小鼠肺組織HE染色結果 建模第21天時,空白組小鼠肺組織結構完整,肺泡清晰,未見肺泡間隔明顯增厚等纖維化表現;模型組小鼠肺組織結構異常,正常肺泡結構消失,肺泡壁明顯增厚,成纖維細胞增生明顯;相較于模型組,高劑量組、中劑量組、低劑量組小鼠的肺纖維化程度明顯減輕,肺泡結構相對完整,且地龍提取物濃度越高,小鼠肺組織結構越完整,纖維化程度越輕。見圖1。

空白組 模型組 高劑量組 中劑量組 低劑量組

2.4 各組小鼠肺組織Masson染色結果 建模第21天時,空白組小鼠肺泡結構完整,少見藍色的膠原纖維沉淀;模型組小鼠肺泡間隔和間質均存在大量藍色沉淀,肺泡結構異常;相較于模型組,高劑量組、中劑量組、低劑量組小鼠肺泡間隔和間質的藍色沉淀明顯減少,肺泡結構相對完整,且地龍提取物濃度越高,上述改善越明顯。見圖2。

空白組 模型組 高劑量組 中劑量組 低劑量組

3 討 論

目前,肺纖維化的發病機制尚未完全清楚,其病理過程主要為肺間質細胞增生和細胞外基質沉積,導致肌成纖維細胞大量形成,進而引起呼吸困難和肺功能衰竭[10]。研究表明,肺纖維化的發生與炎癥、上皮-間質轉化、肺成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞等有關,而且多種細胞因子參與其中[11]。波形蛋白是細胞骨架蛋白,正常情況下在間葉組織中表達,其表達水平與肺纖維化程度呈正相關,可作為反映肺纖維化進程的標志物[12]。α-平滑肌肌動蛋白是肌成纖維細胞的標志物及平滑肌細胞收縮的結構基礎,其具有較強的收縮能力及促進膠原合成能力,能促進膠原沉積并形成纖維化,其表達水平與肺纖維化程度呈正相關[13]。

肺纖維化屬于中醫的“絡病”范疇,由肺絡瘀阻所致,因此中醫認為消除絡脈之瘀濁、保持脈(經)絡氣血通暢和肺絡無損是治療肺纖維化及肺系脈絡病的關鍵[14]。地龍是較早被應用的動物類藥物之一,其由蚯蚓去除雜質、炒制干燥制成,味咸、寒,歸肝、脾、膀胱經,具有清熱定痙、通絡、平喘、利尿的功效,在治療肺纖維化的多個中醫方劑中均有地龍[15]。有研究表明,地龍能下調肝臟細胞α-平滑肌肌動蛋白表達水平,改善小鼠肺纖維化程度[16],但其最佳的干預劑量目前仍有爭議。本研究采用百草枯建立肺纖維化小鼠模型,結果顯示,模型組小鼠肺組織結構異常,正常肺泡結構消失,肺泡壁明顯增厚,成纖維細胞增生明顯,且建模后第14天,模型組小鼠肺組織的波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白表達水平均高于空白組(均P<0.05)。這說明肺纖維化小鼠模型建模成功。本研究結果還顯示,建模后第21天起,高劑量組、中劑量組、低劑量組小鼠肺組織的波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白表達水平均低于模型組(均P<0.05);建模后第28天,高劑量組小鼠肺組織的波形蛋白表達水平低于低劑量組,α-平滑肌肌動蛋白表達水平均低于中劑量與低劑量組(均P<0.05)。這提示地龍提取物可以抑制肺纖維化模型小鼠肺組織波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白的表達,且高劑量地龍提取物的效果更佳。HE染色和Masson染色結果顯示,高劑量組、中劑量組和低劑量組小鼠在肺組織結構及膠原纖維沉淀等方面的改善程度均優于模型組,且地龍提取物濃度越高,改善程度越明顯,表明地龍提取物能夠有效保護肺纖維化模型小鼠肺組織結構,減輕纖維化及膠原沉積,以高劑量地龍提取物效果最佳。

綜上所述,地龍提取物能有效抑制肺纖維化小鼠肺組織中波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白的表達,減少肺組織膠原沉積,延緩肺纖維化的進程,其中高劑量[80 mg/(kg·d)]地龍提取物的效果最佳。但本研究例數較少,可能對結果產生影響,故所得結論仍需進一步研究加以證實。