血清淀粉樣蛋白A1基因rs12218位點多態性與非酒精性脂肪性肝病的關系▲

龍 穎 許雪清 韋麗娟 覃素梅 鄒 格 徐鈺鈞 秦和平

(廣西醫科大學附屬柳州市人民醫院消化內科,廣西柳州市 545006)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是全球常見的慢性肝病之一,患病率約為25%,可導致代謝相關并發癥、肝硬化甚至肝癌,嚴重威脅人類生活質量[1-2]。NAFLD是代謝應激性肝損傷的表現,與遺傳易感性、胰島素抵抗、代謝綜合征、2型糖尿病、動脈硬化性心腦血管疾病等密切相關[3]。血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A,SAA)主要在肝臟合成,是一個包含SAA1、SAA2、SAA3和SAA4 4種同源體的高度異質性蛋白家族,功能尚未完全明確,與代謝綜合征、胰島素抵抗、動脈粥樣硬化等疾病的發生、發展密切相關[4]。在人體中,4種SAA同源體對應的4個編碼基因位于11號染色體短臂1區5帶1亞帶(11p15.1),總長度約150 Kb,其中SAA1基因編碼SAAl蛋白。有研究表明,SAA1基因rs12218位點多態性與脂質代謝紊亂[5]、心肌梗死[6]、冠心病[7]和缺血性腦卒中[8]等多種疾病的發生有關,但其與NAFLD的關系尚未見報告。故本研究探討SAA1基因rs12218位點多態性與NAFLD的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年6月至2021年5月在廣西醫科大學附屬柳州市人民醫院就診的74例NAFLD患者作為觀察組,另選取同期在我院體檢的126例健康者作為對照組。納入標準:(1)性別不限;(2)年齡≥18歲;(3)NAFLD患者的診斷符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018年更新版)》的診斷標準[9];(4)所有研究對象均同意參加本研究并簽署知情同意書。排除標準:(1)合并乙肝病毒感染、丙肝病毒感染、酒精性肝病(每日飲酒量男性>20 g/L、女性>10 g/L)、自身免疫性肝病、遺傳代謝性肝病、藥物性肝病等其他慢性肝病;(2)繼發于營養不良、藥物、代謝性疾病等的脂肪肝;(3)合并惡性腫瘤;(4)合并嚴重神經及精神性疾病;(5)合并心、肺、腎、腦等重要臟器嚴重疾病。本研究已獲得廣西醫科大學附屬柳州市人民醫院醫學倫理委員會批準,所有研究對象之間無血緣關系。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料的收集:收集所有研究對象的年齡、性別、身高、體重,并計算體質指數。體質指數=體重(kg)/身高2(m2)。

1.2.2 血清SAA1、C反應蛋白及生化指標水平的檢測:在研究對象體檢或首次就診時,采集其清晨空腹狀態下外周靜脈血10 mL,取5 mL置于無菌的EDTA抗凝管,保存于-80 ℃超低溫冰箱,用于提取基因組DNA;將其余5 mL置于生化管,室溫下以560 r/min離心20 min,留取上清液。采用ELISA檢測血清SAA1水平,檢測試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司(批號:ml851423-J),所有操作均嚴格按照說明書進行。采用cobas 8000全自動生化分析儀(Roche公司)檢測血清C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)、總膽固醇、三酰甘油、HDL-C、LDL-C、肌酐、尿素氮、尿酸、總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素、總蛋白、白蛋白、球蛋白、ALT、AST水平,檢測試劑盒購自羅氏診斷產品(上海)有限公司(貨號均為61709901)。

1.2.3 SAA1基因rs12218位點基因型的檢測:將置于無菌的EDTA抗凝管且保存在-80 ℃超低溫冰箱備用的5 mL外周靜脈血取出,迅速將其置于37 ℃水浴鍋進行解凍。采用購自天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血液基因組提取試劑盒(批號:DP329)提取基因組DNA,采用瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性(電泳條帶清晰可見,無明顯降解,且無RNA污染,即為完整性良好,見圖1)。采用微量分光光度計檢測DNA的濃度(OD260/280介于1.8～2.0,OD260/230≥2.0,即為純度良好)。將完整度、純度良好的DNA提取物于-20 ℃保存。由Life Technologies公司設計并合成引物,上游引物序列為GCCCCATTCATTGGCAGCCTGATCA,下游引物序列為GCCCCATTCATTGGCAGCCTGATCG。采用SNaPshot熒光探針法檢測SAA1基因rs12218位點單核苷酸序列(探針序列為GCCATGGTGCGGAGGACTCGCTGGC)。反應體系包括2×PCR Mix 5 μL、上游引物(10 μmol/L)0.1 μL、下游引物(10 μmol/L)0.1 μL、熒光探針(10 μmol/L)0.2 μL、無酶水3.6 μL、gDNA 1 μL,總共10 μL。反應條件為95 ℃預變性5 min;95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,共40個循環。反應結束后采用CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)自帶軟件解讀分型結果。

1.3 統計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示,組間比較采用兩獨立樣本t檢驗;計數資料以例數(百分比)表示,組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法;采用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗兩組基因型是否符合遺傳平衡。以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組研究對象一般資料及血清SAA1、CRP、生化指標水平的比較 觀察組的體質指數及血清CRP、三酰甘油、尿酸、ALT水平均高于對照組,而HDL-C水平低于對照組(均P<0.05)。兩組研究對象的性別、年齡及血清SAA1、總膽固醇、LDL-C、肌酐、尿素氮、總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素、總蛋白、白蛋白、球蛋白、AST水平差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 兩組研究對象一般資料及血清SAA1、CRP、生化指標水平的比較

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗結果 觀察組及對照組SAA1基因rs12218位點的基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(χ2=5.736、4.486,P=0.057、0.106)。

2.3 SAA1基因rs12218位點的等位基因與NAFLD的相關性 SAA1基因rs12218位點的等位基因為T、C。兩組SAA1基因rs12218位點的等位基因分布頻率差異有統計學意義(P<0.05),其中C等位基因會增加NAFLD的發病風險[OR=2.170(95%CI:1.330,3.543)]。見表2。

表2 SAA1基因rs12218位點的等位基因與NAFLD的相關性[n(%)]

2.4 SAA1基因rs12218位點的基因型與NAFLD的相關性 SAA1基因rs12218位點有TT、TC、CC 3種基因型。在共顯性模型中,相比于TT基因型,TC基因型會增加NAFLD的發病風險[OR=2.541(95%CI:1.400,4.613)];在顯性模型中,相比于TT基因型,TC/CC基因型會增加NAFLD的發病風險[OR=2.671(95%CI:1.477,4.830)]。見表3。

表3 SAA1基因rs12218位點的基因型與NAFLD的相關性

3 討 論

NAFLD在不同種族、不同年齡的人群中均可發病,但患病率、嚴重程度等存在顯著差異,造成這些差異的原因尚未完全清楚。有研究顯示,NAFLD與“多重打擊”有關,炎癥反應是其發生的核心環節[10]。“多重打擊”學說認為,NAFLD是機體在發生胰島素抵抗時,由細胞氧化應激、細胞因子大量釋放、脂肪毒性等多重因素共同引起廣泛的炎癥反應,導致肝細胞損傷、壞死[11]。同時,已有研究表明,NAFLD的發生、發展與多種基因多態性密切相關,如磷脂酶域3基因多態性[12]、跨膜蛋白6超家族成員2基因多態性[13]、膜結合O-酰基轉移酶7基因多態性[14],但尚不能完全解釋NAFLD的發病機制。探討NAFLD的易感基因及基因多態性,有助于闡明NAFLD的發病機制,從而為NAFLD新藥研發、分子遺傳學預警、預測模型建立等提供依據。

Zhao等[8]發現SAA1基因 rs12218位點的C等位基因會增加缺血性腦卒中及大動脈粥樣硬化的易感性。Wang等[6]發現,心肌梗死患者SAA1基因 rs12218位點的CC+CT基因型分布頻率顯著高于健康人群,因此認為SAA1基因 rs12218位點多態性可能與心肌梗死的發生有關。本研究結果顯示,觀察組與對照組的SAA1基因rs12218位點的等位基因分布頻率差異有統計學意義(P<0.05),其中C等位基因會增加NAFLD的發病風險;在共顯性模型中,攜帶TC雜合子基因型的個體罹患NAFLD的風險高于攜帶TT純合子基因型的個體;在顯性模型中,攜帶TC/CC基因型的個體罹患NAFLD的風險高于攜帶TT基因型的個體。這提示SAA1基因rs12218位點多態性檢測可用于NAFLD高危群體的篩查、患病相關基因的鑒定、分子生物學的基礎研究等方面。

SAA可引起全身系統性炎癥反應,在創傷、感染性疾病、代謝性疾病、心腦血管疾病、自身免疫性疾病和腫瘤等多種疾病的發生與發展過程中發揮重要作用[15]。SAA難溶于水,需通過與HDL-C結合溶解于血液循環中[16]。但在炎癥狀態下,白細胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)刺激肝細胞大量分泌SAA并釋放入血液,使血液中的SAA水平顯著升高[17],SAA可以取代載脂蛋白A1,與HDL-C結合,從而損傷HDL-C的膽固醇逆轉運功能[18]。動物實驗結果顯示,與正常HDL-C顆粒相比,SAA-HDL顆粒與平滑肌細胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的結合能力明顯增強,這可能與SAA的C端第78～104位氨基酸的特殊結構有關[19]。還有研究表明,SAA可促進中性粒細胞的成熟,使內皮細胞及單核-巨噬細胞系中TNF-α、IL-1、IL-6、IL-23等多種炎癥因子的表達上調,從而加重機體的炎癥反應[20-21]。本研究結果顯示,與健康人群相比,NAFLD患者血清CRP水平升高,HDL-C水平下降(均P<0.05),但兩組血清SAA1水平差異無統計學意義(P>0.05)。分析其原因:(1)盡管基因編碼區域及非編碼區域的單核苷酸基因多態性均與疾病的發生有關[22],但SAA1基因包含4個外顯子和3個內含子,rs12218位點位于內含子區域,當rs12218位點的核苷酸T被C取代時,其氨基酸序列并未發生明顯變化,故該位點基因多態性不會導致SAA1水平的差異。(2)在預測重型/危重型新型冠狀病毒肺炎時,SAA的敏感度為100%,特異度高于CRP[23],但目前研究認為NAFLD是慢性炎癥性疾病[24],可能在NAFLD患者的診斷中,CRP的敏感性高于SAA。(3)本研究測定的是血清SAA1水平,未測定血清總SAA水平,SAA發揮功能作用的主要組分是SAA1和SAA2,但二者在各類的疾病炎癥反應中發揮作用的大小尚未見報告,SAA2是否在NAFLD的炎癥反應中發揮作用還有待進一步研究。

綜上所述,NAFLD的發生與血清SAA1水平無明顯相關性,但SAA1基因rs12218位點多態性與NAFLD相關,SAA1基因rs12218位點的C等位基因、TC基因型、TC/CC基因型可能會增加NAFLD的發病風險,這或許可為NAFLD的防治提供了新思路。