哮喘患兒血清CircZNF652的表達水平及其臨床意義▲

榮會蓉 周金成 夏 思 楊 凡

(1 長江大學附屬仙桃市第一人民醫院兒科,湖北省仙桃市 433000;2 湖北省仙桃市仙桃職業學院醫學院,湖北省仙桃市 433000;3 長江大學附屬仙桃市第一人民醫院內科,湖北省仙桃市 433000)

哮喘是一種臨床上常見的慢性呼吸道疾病,兒童的肺功能發育尚未成熟,免疫功能尚不健全,因此哮喘在兒童中的發生風險較高[1]。近年來,兒童哮喘的發病率呈逐年上升趨勢[2-3]。哮喘患兒主要癥狀為咳嗽、胸悶等,同時伴隨喘息反復發作,長期反復的炎癥刺激還可能會引起氣道重塑及氣道狹窄,嚴重影響患兒日常生活及健康[4-6]。哮喘的發病機制尚不十分明確,目前認為與遺傳因素、環境因素、免疫功能等有關[7]。因此,積極探索兒童哮喘的發病機制,尋找相關治療靶點對于改善哮喘患兒預后具有重要意義。環狀RNA(circular RNA,CircRNA)是環狀共價閉合環狀非編碼RNA,2013年Hansen等發現CircRNA可以通過靶向調控miRNA參與各種生理過程的調控[8],此后,CircRNA逐漸受到人們的重視。Circ鋅指蛋白652(zinc finger protein 652,ZNF652)是CircRNA家族成員之一,其在炎癥相關疾病中表達異常[9],推測其可能參與炎癥反應過程。哮喘本質上是一種氣道炎癥反應,目前CircZNF652與哮喘的相關研究鮮有報告。因此,本研究探討哮喘患兒血清CircZNF652表達水平及其臨床意義,旨在為兒童哮喘的診斷及靶向治療提供新方向。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年5月至2021年3月長江大學附屬仙桃市第一人民醫院收治的105例哮喘患兒作為觀察組,年齡5～12(7.90±2.25)歲,男童57例、女童48例。納入標準:(1)符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[10]中的相關診斷標準;(2)患兒配合度較好,患兒家屬同意本研究并簽署知情同意書。排除標準:(1)合并先天性心肺功能不全者;(2)合并肝、腎功能不全者;(3)合并其他過敏性疾病及免疫系統疾病者;(4)一個月內出現過呼吸道感染者。另選取同期在長江大學附屬仙桃市第一人民醫兒童保健科體檢的80例健康兒童作為對照組,年齡6～12(8.24±2.37)歲,男童43例、女童37例。觀察組與對照組兒童性別、年齡差異均無統計學意義(均P>0.05),具有可比性。本研究所有實驗過程均符合《赫爾辛基宣言》相關要求,并經我院醫學倫理委員會審核批準。

1.2 分組 根據觀察組患兒的臨床表現,依照《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[10]相關標準將觀察組的105例哮喘患兒分為急性發作期組57例和慢性緩解期組48例,其中急性發作期組男童32例、女童25例,年齡5～11(7.85±2.22)歲;慢性緩解期組男童30例、女童18例,年齡5～12(7.96±2.29)歲。急性發作期組與慢性緩解期組的性別、年齡差異均無統計學意義(均P>0.05),具有可比性。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集:采集觀察組入院第1天、對照組體檢時晨起空腹的外周靜脈血4 mL,3 000 r/min離心15 min,留取上清液,于-80 ℃條件下保存待檢。

1.3.2 實時熒光定量PCR法檢測血清CircZNF652的表達水平:取上清液,按照TRIzol試劑(Thermo Fisher Scientific,批號:10296010CN)的操作步驟分離、提取上清液中的總RNA,并檢測其純度和濃度,嚴格按照逆轉錄試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號:RP1105)的操作步驟合成cDNA。采用Bio-Rad T100型實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)檢測各組樣品,以GAPDH做內參,反應條件為95 ℃ 預變性30 s,95 ℃變性5 s、60 ℃退火20 s、68℃延伸15 s 35個循環。采用2-ΔΔCt方法計算CircZNF652的相對表達量。CircZNF652上游引物:5′-GGGCACAAACAGTTCATGTG-3′,下游引物:5′-TGCGTTTGAATGATTTTCCA-3′,引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.3 血清炎癥因子水平檢測:采用ELISA檢測血清腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細胞介素(interleukin,IL)-6表達水平(試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,批號:E-EL-H0109c、E-EL-H6156),嚴格按照說明書方法進行操作。

1.3.4 肺功能指標檢測:由同一位醫生操作,指導研究對象按照正確的步驟進行檢測,記錄觀察組入院第1天、對照組體檢時1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second,FEV1)、呼氣峰值流速(peak expiratory flow,PEF)、用力肺活量(forced vital capacity,FVC),計算FEV1/FVC值。肺功能指標檢測重復3次,取平均值。

1.4 統計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示,組間比較采用兩獨立樣本t檢驗;計數資料以例數(%)表示,組間比較采用χ2檢驗;采用Pearson檢驗分析觀察組血清CircZNF652表達水平與肺功能指標及血清TNF-α、IL-6表達水平的相關性;采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析血清CircZNF652表達水平對兒童哮喘的診斷價值,并計算ROC曲線下面積(area under the curve,AUC);采用多因素Logistic回歸模型分析兒童哮喘急性發作的影響因素。以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 觀察組與對照組血清CircZNF652、TNF-α、IL-6表達水平與肺功能指標的比較 觀察組FEV1、PEF、FEV1/FVC值均低于對照組,而血清CircZNF652、TNF-α、IL-6表達水平均高于對照組(均P<0.05)。見表1。

表1 觀察組與對照組血清CircZNF652、TNF-α、IL-6表達水平及肺功能指標的比較(x±s)

2.2 急性發作期組與慢性緩解期組血清CircZNF652、TNF-α、IL-6表達水平及肺功能指標的比較 急性發作期組的FEV1、PEF、FEV1/FVC值均低于慢性緩解期組,而血清CircZNF652、TNF-α、IL-6表達水平均高于慢性緩解期組(均P<0.05)。見表2。

表2 急性發作期組與慢性緩解期組血清CircZNF652、TNF-α、IL-6表達水平及肺功能指標的比較(x±s)

2.3 觀察組血清CircZNF652表達水平與肺功能指標及血清TNF-α、IL-6表達水平的相關性 Pearson相關性分析結果顯示,觀察組血清CircZNF652表達水平與FEV1、PEF、FEV1/FVC值均呈負相關,與血清TNF-α、IL-6表達水平均呈正相關(均P<0.05)。見表3。

表3 血清CircZNF652表達水平與肺功能指標及血清TNF-α、IL-6表達水平的相關性

2.4 血清CircZNF652表達水平對兒童哮喘的診斷價值 以是否哮喘作為狀態變量(無哮喘=0,哮喘=1),以血清CircZNF652表達水平作為檢驗變量繪制ROC曲線。結果顯示,血清CircZNF652表達水平診斷兒童哮喘的AUC為0.741(95%CI:0.671,0.802),靈敏度和特異度分別為75.24%、67.50%,最佳截斷值為1.12。見圖1。

圖1 血清CircZNF652水平對兒童哮喘診斷價值的ROC曲線圖

2.5 哮喘患兒急性發作的影響因素分析 以哮喘患兒哮喘發展期作為因變量(0=急性發作期,1=慢性緩解期),以FEV1、PEF、FEV1/FVC值及血清CircZNF652、TNF-α、IL-6表達水平作為自變量進行多因素Logistic回歸分析,結果顯示,FEV1、PEF、FEV1/FVC值,以及血清TNF-α、IL-6、CircZNF652表達水平均是哮喘患兒急性發作的影響因素(均P<0.05)。見表4。

表4 多因素Logistic回歸分析兒童哮喘急性發作的影響因素

3 討 論

哮喘是兒童常見的一種慢性呼吸道疾病之一,是由多種炎癥因子共同參與導致的變態反應性疾病[11-12],以持續性氣道炎癥、氣道高反應為主要特征[13],患兒會出現反復咳嗽、呼吸困難等臨床表現,嚴重影響患兒的生活質量。由于呼吸系統處于高敏狀態,哮喘患兒氣道極易受到外界因素的影響[14],誘發哮喘急性發作,嚴重時可危及生命。哮喘的發病機制十分復雜,受多種因素的影響,若能盡早評估哮喘發生的風險,及時采取早期預防手段,將極大地降低高風險兒童哮喘的發病率,具有重要的臨床意義。

血清生物學分子標志物是近年來疾病研究的熱點,其能夠客觀快速地反映疾病進程,這為哮喘的早期診斷及靶向治療提供了新的研究方向。目前仍無特異性較強的血清生物學分子標志物用于診斷早期哮喘的發生,因此尋找與哮喘相關的血清生物學分子標志物具有重要的臨床意義。CircRNA是近年來新發現的非編碼RNA,許多研究已經報告了CircRNA作為血清生物學分子標志物用于診斷疾病具有巨大的潛力,但目前相關研究多集中在腫瘤領域[15-16]。例如,CircRNA-100367被發現能夠增強抗輻射的食管鱗狀細胞癌細胞(KYSE-150R)的抗放射性,促進KYSE-150R細胞的生長,促進食管癌進展[17];CircWHSC1在子宮內膜癌組織中表達上調,能夠促進子宮內膜癌細胞的增殖和侵襲[18]。研究表明,CircRNA與支氣管哮喘具有密切的關系,CircRNA可以通過參與先天免疫應答過程和調控支氣管上皮的炎癥反應過程來調節支氣管哮喘的發病過程,CircRNA為哮喘的早期診斷提供了新的研究思路[19],但不同的刺激源、不同的CircRNA會對支氣管上皮炎癥反應發揮不同的作用,具體的作用機制還需更深入的研究。

CircZNF652是最新發現的一類CircRNA分子,Liu等[20]發現下調CircZNF652的表達可以緩解脂多糖誘導的炎癥損傷,提示CircZNF652可能參與炎癥反應的調控過程。本研究結果顯示,觀察組血清CircZNF652表達水平高于對照組(P<0.05),與Wang等[21]的研究結果一致,提示CircZNF652可能參與兒童哮喘的發病過程。本研究結果顯示,急性發作期組患兒的血清CircZNF652表達水平高于慢性緩解期組(P<0.05),提示血清CircZNF652表達水平與兒童哮喘的疾病發展期具有一定的相關性。本研究Pearson相關性分析結果顯示,哮喘患兒血清CircZNF652表達水平與FEV1、PEF、FEV1/FVC值均呈負相關,與血清TNF-α、IL-6表達水平均呈正相關,而FEV1、PEF、FEV1/FVC值及血清CircZNF652、TNF-α、IL-6表達水平均是哮喘患兒急性發作的影響因素(均P<0.05),提示臨床監測肺功能和血清CircZNF652、TNF-α、IL-6表達水平對哮喘患兒病情判定、疾病發展具有重要意義。本研究ROC曲線分析結果顯示,血清CircZNF652表達水平診斷兒童哮喘的AUC為0.741,靈敏度和特異度分別為75.24%、67.50%,提示CircZNF652表達水平診斷的效能良好,當血清CircZNF652表達水平>1.12時,應采取合理的防治措施,預防兒童出現哮喘癥狀。目前關于CircZNF652在哮喘發病過程中的作用機制尚不完全清楚,Wang等[21]認為CircZNF652的作用機制可能是通過充當miR-452-5p的海綿體并激活miR-452-5p/酪氨酸激酶2的信號通路及轉錄激活因子6信號通路促進杯狀細胞化生,導致氣道阻塞,進而誘發哮喘,但具體的作用機制還有待更深入的研究。

肺功能檢測對哮喘的診斷、鑒別、病情嚴重程度評估、治療效果判斷及預后起著重要作用,也是臨床診斷兒童哮喘的重要指標。FEV1反映中央氣道的氣流流速,PEF反映大氣道流速,二者均能評估哮喘患者未來不良事件的發生風險;FEV1/FVC值是臨床醫生判斷哮喘嚴重程度的重要因素,有研究證實FEV1/FVC值每下降5%,受試者哮喘嚴重程度表型可能會增加2.36倍[22-24]。另外,炎癥因子表達水平升高也能增加氣道炎癥,容易出現氣道管壁增厚、管腔狹窄,增加氣道外周阻力,促進哮喘的發展[25]。許惠娟等[26]發現,急性發作期哮喘患者FEV1、PEF、FEV1/FVC值低于緩解期患者和健康受試者,且哮喘患者血清IL-33表達水平高于健康受試者。本研究結果顯示,觀察組FEV1、PEF、FEV1/FVC值均低于對照組(均P<0.05),而血清TNF-α、IL-6表達水平均高于對照組(均P<0.05);急性發作期組患兒的FEV1、PEF、FEV1/FVC值均低于慢性緩解期組(均P<0.05),而血清TNF-α、IL-6表達水平均高于慢性緩解期組(均P<0.05),這一研究結果與許惠娟等[26]研究結果相似。

綜上所述,哮喘患兒血清CircZNF652表達上調,并與哮喘急性發作相關,且血清CircZNF652表達水平與肺功能指標呈負相關,與血清TNF-α及IL-6表達水平呈正相關,因此檢測血清CircZNF652表達水平有助于哮喘患兒的病情判定,但其具體作用機制尚不十分明確,今后還需增加樣本量、延長觀察時間,并開展多中心的深入研究。