向日葵花盤蛋白提取工藝優化分析酶解物抗氧化活性研究

◎ 董毓卿，張挺嘉，馬惠茹，劉紅微，劉 帥

(河套學院農學系 長江大學農學院，內蒙古 巴彥淖爾 015000)

向日葵作為我國主要的油料作物，對鹽堿、干旱、瘠薄土地等具有較強抗性，有較廣的種植區域，其中，內蒙古、新疆、東北三省的種植面積最大[1]。向日葵種子是主要經濟作物，可食用或榨油。葵花盤作為向日葵副產物，除部分作為飼料加工原料，大多數都棄之荒野或填埋處理，這樣極易造成資源浪費和環境污染。

植物多肽的生物活性很多，抗氧化活性是其重要生物活性之一，也是目前研究的熱點[2，3]，但多數研究集中在植物籽蛋白[4-6]，對葵花盤、秸稈等農業低值副產物研究較少。葵花盤中含有多糖、黃酮、生物堿等多種活性成分[7-9]，其中，總蛋白含量與糧食相近，約為7%～13%[10]。因此，對向日葵花盤蛋白進行開發利用，不僅能提高農業低值副產物利用率，還能減少對環境造成的污染，為向日葵花盤的綜合利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

自然晾曬干制的向日葵花盤，采自內蒙古巴彥淖爾市臨河區遠景村；中性蛋白酶、堿性蛋白酶，上海源葉生物科技有限公司；木瓜蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

PR124ZH電子天平，奧豪斯OHAUS儀器有限公司；EU-2200紫外可見分光光度計，杭州綠博儀器有限公司；PHSJ-3F實驗室pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料預處理

將脫籽后自然晾曬干制的葵花盤，磨粉過篩（70目），正己烷脫脂后40～50 ℃條件下烘干，制得葵花盤粉，備用。

1.3.2 葵花盤蛋白質含量測定

葵花盤總蛋白含量采用GB 5009.5—2016中的第1種方法進行測定。

葵花盤粉提取液中蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法。蛋白質濃度標準曲線如圖1所示。

圖1 蛋白質標準曲線圖

1.3.3 葵花盤粗蛋白提取

將上述制得的葵花盤粉，按一定的料液比調配成水溶液，調節浸提液pH及溫度，浸提液于4000 r/min的速度離心20 min。去沉淀后，上清液使用0.1 mol/L HCl調節pH至等電點，4000 r/min的速度離心20 min，沉淀用蒸餾水洗至中性，真空冷凍干燥制得葵花盤粗蛋白，備用。

1.3.3.1 單因素實驗

以葵花盤蛋白提取率為指標，分別考察在料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）、浸提溫度（20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃）、浸提時間（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min）、堿液pH（pH9、pH10、pH11、pH12、pH13）對葵花盤蛋白提取率的影響，確定葵花盤粗蛋白提取實驗的正交試驗條件范圍。

1.3.3.2 正交試驗

根據葵花盤蛋白提取單因素實驗結果，以料液比（A）、浸提溫度（B）、浸提時間（C）、堿液pH（D）為考察因素，以向日葵花盤蛋白提取率的指標，利用正交表L9（34），設計正交實驗，實驗中各因素水平見表1。

表1 正交試驗水平表

1.3.4 葵花盤蛋白酶解

分別選擇木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶，調節溶液pH至酶反應最適pH（如表2所示），對底物濃度為2%葵花盤蛋白水解液進行單酶酶解，每隔30 min測定酶解液的pH，使其始終保持在蛋白酶反應的最適pH，反應時間結束后，于100 ℃滅酶10 min，酶解液于4000 r/min條件下離心15 min，進一步測定上清液抗氧化能力。

表2 酶解反應條件表

1.3.5 葵花盤多肽粗提物抗氧化能力測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力的測定

參照JAMDAR等[11]方法，對不同蛋白酶酶解出的葵花盤多肽粗提物的DPPH自由基清除能力進行測定。取樣品提取液3 mL及濃度為0.5 mmol/L的DPPH溶液0.25 mL，先后加入到同一試管中，搖勻，避光37 ℃放置20 min，以溶劑為參比，在吸光度514 nm處測定其吸光度為Ai。再取0.5 mmol/L的DPPH溶液0.75 mL與3 mL70%乙醇，一起放入同一試管，搖勻，在避光37 ℃放置20 min，以溶劑為參比，在吸光度514 nm處測定其吸光度A0。分別取葵花盤蛋白酶解液3 mL與70%乙醇0.75 mL放入同一試管中，混勻后避光置于37 ℃恒溫箱內反應20 min，以溶劑為參比，在吸光度514 nm處測定其吸光度為Aj。依據DPPH自由基清除率計算公式得出結果。

1.3.5.2 超氧陰離子自由基清除能力的測定

將濃度為0.05 moL/L的Tris-HCL緩沖溶液4 mL加入到10 mL試管中，置于25 ℃水浴20 min，將樣品液和0.2 mmol/L鄰苯三酚分別放入水浴鍋中預熱20 min，并依次向試管中分別加入葵花盤蛋白酶解液1 mL，將試管內溶液混合均勻后于25 ℃水浴鍋中，4 min后立即用濃鹽酸終止反應[12]。在波長325 nm處測吸光度A1，同時作參比溶液，參比溶液為10 mL試管中加入緩沖溶液4 mL和1 mL樣液以及1 mL 0.05 mol/L HCl。對照組用蒸餾水代替，最后依據超氧陰離子清除率計算公式計算得出結果。

2 結果與分析

2.1 向日葵花盤蛋白提取

2.1.1 向日葵花盤粉粗蛋白含量

利用凱氏定氮法對粉碎過篩干燥后的向日葵花盤粉原料粗蛋白進行測定，測定結果為9.19%。

2.1.2 不同料液比對向日葵花盤粗蛋白提取率的影響

通過圖2可看出，料液比對向日葵花盤粗蛋白提取率有一定影響，當料液比在1∶10～1∶30范圍內，向日葵花盤粗蛋白提取率隨提取液體積的增加而升高，并且提取率差距較明顯，而料液比在1∶30～1∶50范圍內，提取率略有下降，故選擇葵花盤粗蛋白提取料液比1∶30 g/L。

圖2 不同料液比對向日葵花盤粗蛋白提取率的影響圖

2.1.3 不同提取溫度對向日葵花盤粗蛋白提取率的影響

通過圖3可看出，提取溫度對向日葵花盤蛋白質提取率有一定影響，提取溫度20～30 ℃范圍內，向日葵花盤蛋白提取率增高，在溫度30 ℃時達到峰值；而提取溫度在30～50 ℃范圍內，提取率明顯下降，由此可見，高溫提取條件下可能會導致葵花盤蛋白變性，故不考慮60 ℃或更高提取溫度，選擇30 ℃作為最適提取溫度。

圖3 不同提取溫度對向日葵花盤粗蛋白提取率的影響圖

2.1.4 不同提取時間對向日葵花盤粗蛋白提取率的影響結果

通過圖4可看出，浸提時間在10 min～50 min范圍內，向日葵花盤粗蛋白提取率先有增加，后緩慢下降，并趨于平緩；在浸提20 min時，達到最大值，故選擇20 min為最適提取時間。

圖4 不同提取時間對向日葵花盤粗蛋白提取率的影響圖

2.1.5 不同堿液pH對向日葵花盤粗蛋白提取率的影響結果

通過圖5可看出，堿液pH對向日葵花盤蛋白提取率有一定影響，堿液pH9～pH11，向日葵花盤蛋白提取率差距不大；堿液pH11～pH13，向日葵花盤蛋白提取率差異顯著，在堿液pH12時達到峰值，故選擇pH12為最適提取pH值。

圖5 不同堿液pH對向日葵花盤粗蛋白提取率的影響圖

2.1.6 葵花盤蛋白提取正交實驗分析

正交實驗后，本研究找到向日葵花盤粗蛋白最佳提取條件為A3B3C2D2，即料液比1∶35、溫度35 ℃、時間20 min、堿液pH12。由表3可知，提取液的pH和料液比對蛋白的提取率有顯著性影響。

表3 葵花盤蛋白提取正交實驗表

由此可見，向日葵花盤中粗蛋白提取率的影響因素順序為：提取液pH＞料液比＞浸提時間＞浸提溫度。從正交實驗中得出的堿提酸沉法最佳條件下提取向日葵花盤中蛋白，其得率為20.23%。

2.2 不同酶解處理后所得向日葵花盤多肽抗氧化能力結果

2.2.1 不同酶解處理后所得向日葵花盤多肽對DPPH·的清除能力

由圖6可知，向日葵盤蛋白經不同酶解后，其酶解多肽對DPPH·清除能力存在較明顯差異。其中，葵花盤蛋白中性蛋白酶酶解液對DPPH·的清除能力最強，達到23.1%；葵花盤蛋白木瓜蛋白酶酶解液的DPPH·清除能力為10.3%；而堿性蛋白酶處理后的樣品的清除能力僅為5.1%。由此可見，在相同條件下，堿性蛋白酶處理后得到的多肽清除DPPH·自由基的能力最弱；中性蛋白酶處理后的多肽對清除DPPH·自由基的能力最強。

圖6 不同酶解處理后所得向日葵花盤多肽對DPPH·的清除能力圖

2.2.2 超氧陰離子清除能力

由圖7中的清除率數值可知，用中性蛋白酶和堿性蛋白酶分別單獨處理葵花盤蛋白后，得到的葵花盤多肽溶液對超氧陰離子清除能力均約為40%，添加木瓜蛋白酶處理后得到的葵花盤多肽溶液，其超氧陰離子自由基清除能力約為前兩者的一半，依次為40.03%、39.64%和19.70%[12]。

圖7 不同蛋白酶處理后的葵花盤多肽對超氧陰離子自由基的清除能力圖

3 結論

本研究以蛋白質提取率為指標，通過正交實驗對向日葵花盤粗蛋白進行堿提酸沉法提取工藝優化，并采用考馬斯亮藍法對提取液中蛋白含量進行測定，得到向日葵花盤粗蛋白堿提酸沉最優工藝。隨后，分別使用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶，對向日葵花盤蛋白進行酶解，并通過抗氧化實驗對酶解液抗氧化能力進行評價。結果顯示，上述3種酶解產物均表現出一定的抗氧化能力，其中，中性蛋白酶酶解后得到的葵花盤多肽的抗氧化能力相對突出。因此，本研究可為向日葵花盤抗氧化肽的制備提供理論依據，提高向日葵花盤的利用價值。