矮地茶治療骨質疏松癥的網絡藥理學分析及實驗研究

譚雅文，原茵，吳紫璇，郭亞萍，王瑾源，彭雁飛，鄭紡

〔摘要〕 目的 基于網絡藥理學及體外實驗探究矮地茶治療骨質疏松癥（osteoporosis， OP）的作用機制。方法 使用TCMSP、GeneCards數據庫篩選矮地茶治療骨質疏松癥的有效成分及關鍵靶點（疾病靶點與藥物活性成分靶點的交集）；使用Cytoscape 3.7.1軟件構建“中藥-活性成分-交集靶點-疾病”網絡；使用STRING數據庫構建關鍵靶點蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction， PPI）網絡；通過DAVID數據庫對關鍵靶點進行GO分析和KEGG信號通路富集分析。體外實驗使用矮地茶醇提物干預成骨誘導的ST-2細胞，通過堿性磷酸酶染色（alkaline phosphatase， ALP）、RT-qPCR、Western blot等檢測其對成骨分化的影響并驗證網絡藥理學信號通路預測結果。結果 共獲得槲皮苷、山柰酚、射干醇A、丹皮酚、肉桂醛等193個矮地茶主要活性成分；預測出82個矮地茶與OP的關鍵靶點，這些關鍵靶點主要參與調控雌激素信號通路、凋亡、Wnt/β-catenin信號通路等。體外實驗顯示，矮地茶能有效提高ST-2細胞成骨轉錄因子表達（P＜0.05），同時上調Wnt/β-catenin信號通路關鍵蛋白β-catenin的表達（P＜0.05），并下調通路抑制因子Sfrp1的mRNA水平（P＜0.05）。結論 矮地茶可通過多靶點、多通路治療OP，主要與Wnt/β-catenin信號通路有關。

〔關鍵詞〕 骨質疏松癥；矮地茶；成骨分化；網絡藥理學；Wnt/β-catenin信號通路

〔中圖分類號〕R274.9? ? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.08.020

Network pharmacological analysis and experimental study of Aidicha （Ardisiae Japonicae Herba） in treating osteoporosis

TAN Yawen， YUAN Yin， WU Zixuan， GUO Yaping， WANG Jinyuan， PENG Yanfei， ZHENG Fang*

School of Integrated Chinese and Western Medicine， Tianjin University of Chinese Medicine， Tianjin 301617， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the mechanism of action of Aidicha （Ardisiae Japonicae Herba） in treating osteoporosis （OP） based on network pharmacology and in vitro experiments. Methods TCMSP and GeneCards databases were used to screen active ingredients and key targets （intersection of disease targets and drug active ingredient targets） for Aidicha （Ardisiae Japonicae Herba） treating OP; Cytoscape 3.7.1 software was applied to constructing "herb-active ingredient-intersection target-disease" network; STRING database was used to construct the key target protein-protein interaction （PPI） network. GO analysis and KEGG signaling pathway enrichment analysis of the key targets were performed by DAVID database. In vitro experiments were performed using Aidicha （Ardisiae Japonicae Herba） alcohol extracts to intervene in osteogenic-induced ST-2 cells. Alkaline phosphatase （ALP） staining， RT-qPCR， and Western blot were applied to detecting their effects on osteogenic differentiation and validating the prediction made by network pharmacological signaling pathway analysis. Results A total of 193 major active ingredients of Aidicha （Ardisiae Japonicae Herba）， including quercetin， kaempferol， belamcandol A， paeonol， and cinnamaldehyde， were obtained; 82 key targets （intersection targets） of Aidicha （Ardisiae Japonicae Herba） and OP were predicted， and they were mainly regulating estrogen signaling pathway， apoptosis， Wnt/β-catenin signaling pathway， etc. In vitro experiments showed that Aidicha （Ardisiae Japonicae Herba） effectively increased the expressions of osteogenic transcription factors in ST-2 cells （P<0.05）. Meanwhile， it up-regulated the expression of β-catenin， a key protein of Wnt/β-catenin signaling pathway （P<0.05）， but down-regulated the mRNA level of Sfrp1， a pathway suppressor （P<0.05）. Conclusion Aidicha （Ardisiae Japonicae Herba） can treat OP through multiple targets and pathways， mainly related to Wnt/β-catenin signaling pathway.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 osteoporosis; Aidicha （Ardisiae Japonicae Herba）; osteogenic differentiation; network pharmacology; Wnt/β-catenin signaling pathway

骨質疏松癥（osteoporosis， OP）為代謝性骨病[1]，多發于中老人及絕經后婦女。最新數據顯示，OP在中國50歲以上人群中男女性患病率分別為13.5%、29%[2]。及早發現骨丟失現象并加以治療具有重要的社會意義。OP的發生與骨重建失衡關系密切，理想的OP治療藥物應能恢復骨形成與骨吸收平衡，然而目前臨床上大多治療藥物只能抑制骨吸收，限制了在OP治療中的臨床應用。因此，從根本上治療OP，尋找能夠增強成骨細胞活性、促進骨形成的安全藥物至關重要。

矮地茶（ardisiae japonicae herba， AJH）為我國西南地區少數民族常用藥，具有化痰利濕、活血化瘀之功效。目前，臨床上多用其治療風濕痹痛、跌打損傷、脫力勞傷等外傷疾病。OP在中醫學中屬于“骨痿”范疇，常因肝腎虧虛，外感誘生濕熱痰瘀致病。研究發現，AJH中槲皮素、山柰酚、肉桂醛、楊梅素等中藥單體可能是其治療骨代謝疾病的主要有效成分，槲皮素及其衍生物可能通過抗氧化、抗炎、促進成骨細胞、抑制破骨細胞及其雌激素樣作用部分逆轉骨質減少[3]；槲皮素通過調節自噬和凋亡提高骨細胞總數、預防骨質疏松[4]；山柰酚通過減少miR-10a-3p和提高CXCL12促進BMSC成骨分化和改善OP[5]；肉桂醛抑制破骨細胞生成，促進成骨細胞生成[6]；楊梅素通過激活Wnt/β-catenin增強BMSC的成骨分化[7]。然而AJH治療OP的具體作用機制尚不明確。因此，本研究擬通過網絡藥理學預測AJH治療OP的潛在作用靶點及通路，通過體外實驗觀察AJH對ST-2細胞成骨分化的影響并驗證預測結果，以期為揭示AJH治療OP的作用機制提供參考。

1 材料

1.1? 數據庫及軟件

所用數據庫包括：中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）：http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php，GeneCards：https：//www.genecards.org、韋恩Venny2.1.0：http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/、String蛋白質相互作用分析平臺：https：//string-db.org、DAVID 6.8 GO功能和KEGG通路富集分析平臺：https：//david.ncifcrf.gov；所用軟件包括：Cytoscape3.7.1、R×64 3.6.3、PERL。

1.2? 細胞

小鼠骨髓基質細胞系ST-2（批號：ZY-900），購于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.3? 主要儀器

JJQ5型熒光定時定量PCR儀（美國伯樂BIO-RAD公司）；K5500型超微量紫外分光光度儀（北京凱奧科技發展有限公司）；Varioskan Flash型多功能讀板機（賽默飛世爾科技公司）。

1.4? 藥品與試劑

AJH醇提物由天津中醫藥大學中醫藥研究院制備；DMEM（批號：SH30022.01B）、α-MEM培養基（批號：SH30265.01B）、胰蛋白酶（批號：25200056）均購自美國Gibco公司；二甲基亞砜（DMSO，批號：D8418）購自德國Sigma-Aldrich公司；CCK-8（批號：LF696）均購自北京博奧拓達科技有限公司；總RNA提取試劑盒（HP Total RNA Kit，批號：R6812-02）購自美國Omega公司；逆轉錄試劑盒（批號：K1622）購自美國賽默飛世爾科技公司；Ultra SYBR Mixture試劑盒（批號：CW0957MM）購自康為世紀生物科技有限公司。

2 方法

2.1? 網絡藥理學

2.1.1? 藥物活性成分及其靶點、疾病靶點收集? 以口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%，類藥性（drug likeness， DL）≥0.18作為活性成分的篩選標準，通過TCMSP數據庫檢索AJH的活性成分及其靶點。使用GeneCards數據庫檢索關鍵詞"Osteoporosis"得到OP相關靶點。

2.1.2? “中藥-活性成分-交集靶點-疾病”網絡構建

將AJH活性成分的作用靶點與OP靶點導入Venny2.1平臺中，獲得交集靶點即AJH治療OP的關鍵靶點，繪制韋恩圖；利用Cytoscape3.7.1軟件構建“中藥-活性成分-交集靶點-疾病”可視化網絡并進行拓撲分析。

2.1.3? 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction， PPI）? 將交集靶點導入STRING平臺，設定物種為“Homo sapiens”，構建PPI可視化網絡并導出圖片與tsv統計文件，利用R軟件通過度值預測核心靶點，并分析靶點之間的互作關系。

2.1.4? GO功能與KEGG信號通路富集分析? 將交集靶點導入DAVID數據庫，進行GO功能富集分析與KEGG信號通路富集分析，設定閾值為P≤0.05。GO富集分析包括生物過程（biological process， BP）、分子功能（molecular function， MF）及細胞組成（cellular component， CC）。使用R軟件將富集結果可視化處理為條形圖與氣泡圖，分析AJH治療OP的潛在作用機制。

2.2? 體外實驗

2.2.1? 細胞培養? 將小鼠骨髓基質細胞系ST-2用DMEM完全培養基（含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素）在37 ℃、5% CO2條件下培養。每隔1天換液，待細胞匯合至70%～80%融合度時進行傳代。

2.2.2? CCK-8法檢測ST-2細胞的增殖? 將細胞接種至96孔板中，24 h后進行分組：空白對照組（Control組）、DMSO組和10、20、50、100、150、200 μg/mL AJH組。各組分別干預0、24、48、72 h后，根據CCK-8試劑盒說明書步驟，在每孔培養基中加入10% CCK-8溶液，37 ℃孵育1 h。使用酶標儀檢測各組在450 nm處的光密度（OD）值。

2.2.3? ALP染色觀察ST-2細胞成骨分化? 培養ST-2細胞，待細胞生長至70%～80%融合度時均換為含成骨誘導劑（1.0 μmol/L地塞米松+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉+50 μmol/L維生素C）的α-MEM完全培養基，給藥組加入10 μg/mL AJH干預細胞，每3天換液1次，培養至14 d。按照ALP顯色試劑盒說明書進行染色。

2.2.4? RT-qPCR法檢測成骨轉錄因子和β-catenin、Sfrp1的mRNA表達? 將ST-2細胞分別接種至六孔板中，1 d后進行分組干預：空白對照組（Control組）、成骨誘導組、成骨誘導＋10 μg/mL或20 μg/mL AJH組。干預細胞5 d后棄去培養基，使用β-巰基乙醇裂解細胞，按照總RNA提取試劑盒說明書步驟提取細胞總RNA，檢測RNA含量與純度；按照 cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書步驟逆轉錄獲得cDNA，逆轉錄條件：25 ℃ 10 min，37 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。以cDNA為模板，β-actin作為內參基因，按照Ultra SYBR Mixture 試劑盒說明書步驟采用RT-qPCR法檢測目的基因的表達，反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，共 38 個循環。擴增反應后進行熔解曲線分析，排除非特異性擴增。目的基因相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。引物序列見表1。

2.2.5? Western blot檢測成骨轉錄因子和β-catenin的蛋白表達? 成骨誘導劑與10 μg/mL AJH干預ST-2細胞5 d后，使用RIPA蛋白裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白并使用BCA蛋白定量法檢測其濃度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉移至PVDF膜上。TBST漂洗后，于5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h。封閉結束后用TBST漂洗，加入Runx2、Osterix、β-catenin、β-actin一抗（稀釋比例1∶1000），4 ℃孵育過夜。TBST漂洗，二抗（稀釋比例1∶10000）孵育2 h。ECL顯影、成像。以β-actin為內參進行統計。

2.3? 統計學處理

采用SPSS 21.0統計軟件分析，計量資料結果以“ｘ±s”表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和重復測量資料方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1? AJH活性成分及作用靶點

通過TCMSP數據庫篩選得到AJH活性成分193個，結果見表2。通過活性成分篩選并去重后得到AJH潛在作用靶點116個。

3.2? “中藥-活性成分-交集靶點-疾病”網絡分析

通過GeneCards數據庫得到OP的靶點4 613個，取疾病靶點與藥物活性成分靶點的交集，并繪制韋恩圖。詳見圖1。

基于AJH活性成分與OP靶點的相互作用，采用Cytoscape軟件構建“中藥-活性成分-交集靶點-疾病”網絡，結果見圖2。圖中節點分別代表藥物、疾病、交集靶點、活性成分等，線代表兩節點之間存在互作關系。結果顯示AJH中的槲皮苷、山柰酚、射干醇A、丹皮酚、肉桂醛等多種活性成分能調控PTGS1、NR3C1、AR等多個靶點，體現了AJH具有多靶點、多成分協同調控OP的特點。

3.3? PPI網絡分析

PPI網絡結果顯示共有82個節點、801條邊構成，平均度值為19.5，見圖3。使用R軟件統計預測出的AJH治療OP的關鍵蛋白，見圖4。PPI結果顯示，IL-6、ESR1、CASP3、HSP90AA1、PPARG、HIF1A、EGFR、MYC、FOS、CCND1度值較高，可能是在AJH治療OP中發揮重要作用的核心靶點。

3.4? GO功能及KEGG通路富集分析

GO富集分析得到條目共1 358個，其中BP條目1 248個、CC條目25個、MF條目85個。可視化結果見圖5。GO功能分析結果預測，關鍵靶點主要涉及類固醇激素的反應、對酮的反應、活性氧代謝過程的調控等。KEGG富集分析結果見圖6，關鍵靶點可富集得到114個信號通路主要包括雌激素信號通路、凋亡、Wnt/β-catenin信號通路等，提示AJH可通過多種信號通路對OP發揮治療作用。

3.5? AJH對ST-2細胞增殖能力的影響

CCK-8結果顯示ST-2細胞在不同濃度AJH干預0、24、48、72 h后，與Control組相比，10 μg/mL AJH組、20 μg/mL AJH組的OD值無統計學意義（P＞0.05），見圖7。結果表明10、20 μg/mL AJH對ST-2細胞增殖的影響沒有差異，因而選取10、20 μg/mL AJH進行后續實驗。

3.6? AJH對ST-2細胞成骨分化的影響

ALP染色結果顯示，與成骨誘導組相比，AJH組ALP染色顏色明顯加深，提示AJH能夠促進ST-2細胞向成骨方向分化。詳見圖8。

3.7? AJH對ST-2細胞成骨轉錄因子mRNA表達的影響

與Control組相比，成骨誘導組Runx2、Osterix、ALPL的mRNA表達顯著提高，差異有統計學意義（P＜0.05），表明成骨誘導能夠有效促進成骨轉錄因子表達；與成骨誘導組相比，10 μg/mL AJH組Runx2、Osterix、ALPL的mRNA表達顯著提高，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖9。

3.8? AJH對ST-2細胞成骨轉錄因子蛋白表達影響

與Control組相比，成骨誘導組Runx2蛋白表達顯著提高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與成骨誘導組相比，10 μg/mL AJH組Osx、Runx2蛋白表達顯著提高，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖10。

3.9? AJH對ST-2細胞β-catenin與Sfrp1表達的影響

與Control組相比，成骨誘導組β-catenin的mRNA及蛋白表達水平顯著提高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與成骨誘導組相比，10 μg/mL AJH組β-catenin的mRNA及蛋白表達水平顯著提高，差異有統計學意義（P＜0.05）。此外，與成骨誘導組相比，10 μg/mL AJH組Wnt/β-catenin信號通路抑制因子Sfrp1的mRNA表達顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖11。

4 討論

OP是一種以骨量減少、骨微細結構破壞，導致骨脆性增加及骨折危險性增高為特征的全身性代謝性骨病[8]。OP的治療與骨重建關系密切。骨形成與骨吸收是骨重建相偶聯的兩個過程，成骨細胞和破骨細胞分別是其效應細胞。骨形成和骨吸收的動態平衡一旦被打破，將會引起包括OP和佩吉特病等[9-10]在內的多種骨代謝疾病。目前，臨床上存在的OP治療藥物大多不能從根本上逆轉已出現的骨量減少和骨微細結構破壞，即使是少數能夠促進骨形成的藥物如雌激素，也因有增加乳腺癌發生的風險，限制了其在OP治療中臨床應用[11]。中醫藥在治療脂代謝疾病方面具有多靶點、多通路、藥物安全性高等優點，因此，尋找治療OP的有效中藥具有重要意義。

中藥AJH，始載于《圖經本草》，其性平、味辛、微苦，歸肺、肝經。2020年版《中華人民共和國藥典》[12]記載AJH具有化痰利濕、活血化瘀之功效，其歸經與功效與OP病因病機聯系緊密。OP在中醫學中屬于“骨痿”范疇，常為虛實夾雜、本虛標實之候，與肝、腎密切相關[13]。因外感致病者，濕熱邪毒耗傷陰津，久則損耗肝腎陰血，是為虛實夾雜；因內傷致病者，多因津液、氣血、精髓的虧虛而生。“腎主骨，生髓”，腎精虧虛虧損則導致筋骨失養、骨萎失用，久則兼現濕熱痰瘀，是為本虛標實。因此，AJH從藥效上分析其有治療OP潛能。

本文通過網絡藥理學篩選AJH-OP的交集靶點，進行PPI分析可知，ESR1、CASP3、HSP90AA1、PPARG、HIF1A、EGFR、MYC、FOS、CCND1等可能為主要有效靶點，提示AJH可能通過調節激素、代謝、凋亡等治療脂代謝疾病。GO功能分析證實五苓散作用于脂代謝疾病的靶點主要參與對酮的反應、類固醇激素的反應、活性氧代謝過程；KEGG富集分析主要涉及凋亡、雌激素信號通路、Wnt/β-catenin信號通路等疾病通路。Wnt/β-catenin信號通路是成骨細胞分化的分子開關，該通路在骨質疏松的發生發展和成骨細胞分化調控中的重要作用越來越受到關注。動物實驗發現[14]，作為Wnt配體的共同受體LRP5[15]的增加能夠促進成骨細胞的數量增多，而LRP6受體缺失的小鼠骨密度較正常小鼠低。同時細胞實驗表明，Wnt蛋白能夠改變膜受體構象，調節Wnt信號傳遞，從而影響成骨細胞的發育[16]。丹參素等中藥單體成分也可通過Wnt/β-catenin信號通路促進成骨細胞分化[17]。鑒于Wnt/β-catenin信號通路在骨重建和成骨細胞分化中的重要作用，因此從Wnt/β-catenin信號通路的視角揭示防治OP藥物的作用機制，能夠為骨代謝相關疾病的治療提供新思路。

骨具有復雜的生理作用，其中骨髓是維持骨生理功能、保證骨發育及內分泌調節的重要成分。骨髓中存在的許多成熟細胞類型都來源于BMSC，BMSC是一種多潛能干細胞，可分化為成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞[18]。生理狀態下，多種信號分子控制著BMSC的定向分化[19]，隨著骨髓間充質干細胞的分化，細胞代謝和形態等發生變化，進一步影響骨形成。在病理狀態下，骨髓間充質干細胞分化失衡，骨形成減少[20-21]，導致骨生長缺陷和骨代謝紊亂，是OP、骨折等疾病的主要內源性因素。目前，研究BMSC成骨分化是治療OP等骨相關疾病的重要策略。在動物模型及臨床試驗中，BMSC已被證實可修復多種退行性疾病的受損組織[22-23]。同時，BMSC具有歸巢能力，可以遷移到損傷部位，分泌有助于組織再生的趨化因子、細胞因子和生長因子[24]。OP治療需要維持骨穩態與促進骨形成，多種信號分子參與了骨穩態維持及骨形成過程。Runx2是參與調節成骨細胞分化的一種特異性轉錄因子[25]。Runx2與Osx啟動子中的DNA元件結合，激活間充質細胞中Osx啟動子，調節骨和軟骨形成。Osx也稱轉錄因子SP7，屬于Sp/KLF因子[26]。實驗證實Osx缺失小鼠，間充質干細胞不能沉積骨基質，骨膜中的細胞無法分化為成骨細胞[27]，已形成的骨骼中Osx失活會導致成骨細胞功能缺陷，進而導致骨小梁生成減少[28]。ALPL是成骨分化晚期及骨形成的重要標志物。它可作為上游基因，影響Wnt蛋白家族的分泌，從而影響間充質干細胞的成骨分化[29]。

本研究結果顯示，ALP染色結果顯示，AJH干預后ST-2細胞ALP染色明顯加深；Runx2、OSX、ALPL基因表達結果顯示，與成骨誘導組相比，10 μg/mL AJH組成骨轉錄因子mRNA表達均顯著提升；同時，AJH可顯著提高Runx2、OSX的蛋白表達水平。這一結果證實AJH能夠促進ST-2細胞成骨分化。AJH可顯著提高β-catenin的mRNA及蛋白表達，同時下調Sfrp1 mRNA水平，這些結果表明，Wnt/β-catenin信號通路介導了AJH促進成骨分化的作用。

綜上，本研究通過網絡藥理學與體外實驗證實，AJH具有多靶點、多通路治療OP的作用，并且Wnt/β-catenin可能是AJH治療OP的重要通路。本研究為揭示傳統中藥治療OP的機制提供了科學依據。

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