基于GC-MS/MS聯合HPLC-MS/MS測定大棗禁用農藥殘留

吳祿祥 黃若干 周勁松 劉春榮 藍曉東 鐘林靜

摘 要：目的：建立QuEChERS結合氣相色譜-串聯質譜法（Gas Chromatography-tandem Mass Spectrometry，GC-MS/MS）聯合高效液相色譜-串聯質譜法（High Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）檢測大棗禁用農藥殘留的方法。方法：樣品以體積比為1%的乙酸乙腈為溶劑，高速勻漿，采用QuEChERS法凈化處理樣品，分別以氣質法和液質法進行分析，氣質法采用外標法定量，液質法采用內標法定量。結果：氣相色譜-串聯質譜法檢測的35種農藥線性關系良好，相關系數均≥0.997 2，定量限為0.000 1～0.005 5 mg·kg-1，回收率為65.54%～101.03%，相對標準偏差為0.38%～11.54%。高效液相色譜-串聯質譜法測定的30種農藥線性關系良好，相關系數均≥0.989 6，定量限為0～0.000 49 mg·kg-1，回收率為62.92%～109.96%，相對標準偏差為0.04%～3.71%。結論：該方法操作簡便、高效、定量定性準確、靈敏度高、重現性和穩定性良好，適用于大棗禁用農藥殘留的快速檢測。

關鍵詞：大棗；氣相色譜法-串聯質譜法；高效液相色譜-串聯質譜法；QuEChERS；禁用農藥殘留

Abstract： Objective： The method of QuEChERS combined with gas chromatography-tandem mass spectrometry（GC-MS/MS） and high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS） for the determination of forbidden pesticide residues in jujube was established. Method： The samples were purified by QuEChERS method using acetonitrile with 1% volume ratio as solvent and homogenized at high speed. The samples were analyzed by temperament method and liquid mass method respectively. The temperament method was quantified by external standard method， and the liquid mass method was quantified by internal standard method. Result： The linear relationship of 35 pesticides detected by gas chromatography-tandem mass spectrometry was good. The correlation coefficients were all greater than 0.997 2， the limits of quantitation were 0.000 1～0.005 5 mg·kg-1， the recoveries were 65.54%～101.03%， and the relative standard deviations were 0.38%～11.54%. The 30 pesticides determined by high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry have good linear relationships. The correlation coefficients were all greater than 0.989 6， the limits of quantification were 0～0.000 49 mg·kg-1， the recoveries were 62.92%～109.96%， and the relative standard deviations were 0.04%～3.71%. Conclusion： This method is simple and efficient， with accurate quantitative and qualitative analysis， high sensitivity， good reproducibility and stability， and is suitable for the rapid detection of prohibited pesticide residues in jujube medicinal materials.

Keywords： jujube; gas chromatography-tandem mass spectrometry; high performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry; QuEChERS; prohibited pesticide residues

大棗（Ziziphus jujuba Mill.）屬于鼠李科植物棗的干燥成熟果實[1]，有養胃、健脾、益血等效果，屬安神類中藥[2]，被廣泛應用于臨床、中藥制劑、大健康產品的開發。現代藥理研究證明，大棗含黃酮、生物堿、三萜類和多糖類等化合物，具有降壓、鎮靜催眠、抗腫瘤、免疫調節、抗衰老、補血、增強心肌收縮力和減輕疲勞等作用[3]。大棗極易遭受病蟲害，種植戶濫用農藥導致農藥殘留超標已成為影響大棗質量和安全的重要因素。農藥殘留會導致人體多種疾病，如引發心肌炎[4]，危害神經系統，甚至有致癌、致畸、致突變等危害[5]，導致女性患乳腺癌、子宮癌的風險增加[6]，已經成為不容忽視的問題[7]，引起普遍關注。中國藥典2020年版收錄了中藥材及飲片（植物類）33種禁用農藥，農藥殘留檢測方法氣相色譜法[8]和氣相色譜-串聯質譜法[9]，中國藥典“第五法藥材及飲片（植物類）中禁用農藥多殘留測定法”[10]規定了中藥材及飲片的禁用農藥殘留測定方法為氣相色譜-串聯質譜法、高效液相色譜-串聯質譜法。大棗作為藿香正氣顆粒的主要原料，常有農藥殘留超標的情況發生。為保證用藥安全，廣西白云山盈康藥業有限公司特別關注了原料大棗的質量和農藥殘留問題，通過建立QuEChERS結合氣相色譜-串聯質譜法（Gas Chromatography-tandem Mass Spectrometry，GC-MS/MS）聯合高效液相色譜-串聯質譜法（High Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS），以中國藥典2020年版農藥殘留分析方法為依據，對大棗中禁用農藥殘留進行了研究，可為中藥禁限用農藥監管和檢測提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

冰醋酸（優級純，20200427-001）、甲酸（AR，20200710-001），購自天津科密歐化學試劑有限公司；提取鹽（60105-335-B），賽默飛世爾科技（中國）有限公司；分散固相萃取凈化管（6015-509-B），北京迪科馬科技有限公司；甲酸銨（色譜純）、異丙醇（色譜純，L6750432-004）、乙腈（色譜純，M1881440-041）、甲醇（色譜純，06751440-019），中山聯思化科技有限公司；磷酸三苯酯（CDAA-S-412134-JD-1 mL）、55種禁用農藥混合對照品溶液（CDAA-M-490407-TY-1.2 mL），上海安譜實驗科技股份有限公司。委托合格供應商收集山西、新疆、河北、甘肅、山東和福建等10批不同產地的大棗。

1.2 試驗方法

1.2.1 制備對照溶液

（1）制備混合對照溶液。精密量取250 μL禁用農藥混合對照溶液，置于量瓶中，加乙腈配制中間儲備液；精密量取中間儲備液2 mL，置于量瓶中，加乙腈到規定量，搖勻，制備工作溶液。

（2）制備GC-MS/MS法分析用內標溶液。精密取磷酸三苯酯對照品適量，制成0.1 mg·L-1的分析用內標溶液磷酸三苯酯。

（3）制備空白基質溶液。照供試溶液制備方法，取空白基質樣品適量，制成空白基質溶液。

（4）基質混合對照溶液的制備。精密吸取6份空白基質溶液各1.0 mL，40 ℃氮吹濃縮至約0.4 mL，分別加工作溶液l0 μL、20 μL、50 μL、l00 μL、150 μL和200 μL，加乙腈定容至l mL，渦旋混勻，即得。

1.2.2 制備供試溶液

取供試適量，剪切成塊再研磨成粉，取粉末3 g，置于50 mL聚苯乙烯具塞離心管中，加1%冰醋酸溶液15 mL，渦旋后靜置30 min，加乙腈15 mL，渦旋5 min，加質量比為4∶1的無水硫酸鎂與無水乙酸鈉混合粉末7.5 g，加入粉末后立即搖散，并振蕩器劇烈振蕩3 min，置冰浴冷卻10 min，以4 000 r·min-1的轉速離心5 min，再取上清液9 mL，置于已裝有凈化材料（無水硫酸鎂900 mg、N-丙基乙二胺300 mg、十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg、硅膠300 mg、石墨化碳黑90 mg）的分散固相萃取凈化管，以4 000 r·min-1的轉速渦旋振蕩5 min，使凈化完全，精密取上清液5 mL，置水浴吹氮儀上40 ℃蒸至約0.4 mL，加乙腈至1.0 mL，渦旋混勻，取0.5 mL于10 mL離心管中，加入150 μL內標渦旋混勻，0.22 μm有機濾膜濾過，精密量取0.5 mL樣液，置于10 mL離心管中，加入150 μL一級水，渦旋混勻，0.22 μm有機濾膜濾過。

1.2.3 GC-MS/MS法

（1）色譜條件。50%苯基-甲基聚硅氧烷為固定液的彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）。溫度250 ℃，不分流進樣。載氣高純氦氣（He），柱前壓力146 kPa，恒壓模式。升溫程序：初溫60 ℃，保持1 min，30 ℃·min-1升至120 ℃，10 ℃·min-1升至160 ℃，2 ℃·min-1升至230 ℃，15 ℃·min-1升至300 ℃，保持6 min。

（2）質譜條件。采用三重四極桿串聯質譜儀檢測；離子源為EI；溫度250 ℃；碰撞氣為氮氣或氬氣；質譜傳輸接口的溫度為250 ℃；質譜監測模式為多反應監測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）。

1.2.4 HPLC-MS/MS法

（1）色譜條件。色譜柱（10 cm×2.1 mm，2.6 μm）以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相A：0.1%甲酸溶液（含5 mmol·L-1甲酸銨），流動相B：乙腈-0.1%甲酸溶液（含5 mmol·L-1甲酸銨）體積比95∶5，按表1所示時間和流動相比例梯度洗脫，柱溫40 ℃，流速0.3 mL·min-1。

（2）質譜條件。采用三重四極桿串聯質譜儀檢測；ESI離子源；MRM監測模式；正離子掃描模式。

1.2.5 測定方法

（1）GC-MS/MS法。分別精密吸取基質混合對照液、供試液各0.5 mL，置于10 mL離心管中，精密加入150 μL內標溶液，混勻，0.22 μm有機濾膜過濾，精密取過濾后的基質混合對照液、供試液兩種溶液各1 μL，注入氣相色譜-串聯質譜儀，按外標標準曲線法計算。

（2）HPLC-MS/MS法。分別精密取基質混合對照液、供試品液各0.5 mL，置于10 mL離心管中，精密加入150 μL純水，混勻，0.22 μm有機濾膜過濾，精密取過濾后的基質混合對照液、供試液兩種溶液各2 μL，注入高效液相色譜-串聯質譜儀，按內標標準曲線法計算。

2 結果與分析

2.1 氣相色譜-串聯質譜檢測及液相色譜-串聯質譜檢測

將一定濃度的混合對照品溶液分別注入液相色譜串聯質譜儀和氣相色譜串聯質譜儀，在MRM模式下，對關鍵參數進行優化，并確定分析條件的最佳參數，獲得總離子流圖，見圖1、圖2。

2.2 標準曲線線性及定量限驗證

實驗結果表明，氣相色譜-串聯質譜法檢測的35種農藥線性關系良好，相關系數均≥0.997 2，定量限為0.000 1～0.005 5 mg·kg-1，說明各禁用農藥成分的氣質曲線線性良好，信噪比均大于10且定量限達到要求，見表2；高效液相色譜-串聯質譜法測定的30種農藥相關系數均≥0.989 6，線性關系良好，定量限為0～0.000 49 mg·kg-1，說明液質曲線線性良好，信噪比均大于10，定量限達到要求，見表3。

2.3 準確度檢驗

稱取約5 g不含目標物的供試品9份，分低、中、高3組，每組3份，低、中、高組分別加中間儲備溶液30 μL、60 μL、90 μL，依照供試品液制備方法檢測，計算回收率和相對標準偏差。35種禁用農藥的氣相色譜-串聯質譜法回收率為65.54%～101.03%，相對標準偏差為0.38%～11.54%，高效液相色譜-串聯質譜法回收率為62.92%～109.96%，相對標準偏差為0.04%～3.71%。實驗回收率均在60.00%～130.00%，相對標準偏差均低于15%，說明本方法準確性、精密度良好，滿足農藥殘留檢測要求。

2.4 穩定性試驗

精密稱定樣品1份，加入1.2.1步驟（1）下的中間儲備溶液30 μL，按照供試液制備方法制備供試液，室溫放置，在0 h、3 h、6 h、9 h、12 h和24 h取樣測定，計算相對標準偏差。氣相色譜-串聯質譜法和高效液相色譜-串聯質譜法各個時間化合物檢出濃度的相對標準偏差均小于15%，說明加標后樣品溶液室溫條件下24 h內穩定。

3 結論與討論

本研究利用氣相色譜-串聯質譜法和高效液相色譜-串聯質譜法對10批來自不同產地的大棗進行禁用農藥殘留檢測分析，該方法穩定性較好，適合大棗的農藥殘留檢測。不同產地的10批大棗均未檢出禁用農藥殘留，質量達標。

目前，國內尚未有關大棗禁用農藥殘留檢測標準的文獻報道，本研究建立了氣相色譜-串聯質譜法聯合高效液相色譜-串聯質譜法測定大棗禁用農藥殘留的方法，通過添加內標和建立基質匹配標準曲線消除基質效應，避免樣品出現假陰性。本研究通過在高效液相色譜-串聯質譜中，采用基質匹配標準曲線，降低基質效應的影響；在氣相色譜-串聯質譜中，通過添加內標物質磷酸三苯酯，降低基質效應的影響，從而解決質譜檢測結果普遍存在基質效應的難題。農藥殘留檢測常用提取溶劑為石油醚、醋酸乙酯、乙腈、正己烷和丙酮等[11-13]。為減少基質效應的干擾，多以乙腈提取，QuEChERS凈化，以提高目標物的富集程度和檢測靈敏度[14-15]。本研究采用1%乙酸浸制30 min，再加入乙腈提取，保護了對酸堿敏感的農藥成分，提高了穩定性。隨著科學技術的進步和檢驗技術的不斷提高，越來越多的標準將采用氣質聯用和液質聯用作為主要的農藥殘留分析手段，本研究對農作物規范化、標準化種植起到積極的推動作用。

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