球毛殼菌ND35 對枸杞扦插苗根系發育的影響

馬深成，王 杰，李 旭，呂新民，吳俊東，高尚坤，田葉韓*

（1.泰安市泰山森林病蟲害防治檢疫站 山東 泰安 271000；2.平度市大澤山林場 山東 平度 266700；3.泰安市徂徠山林場 山東 泰安 271000；4.山東農業大學植物保護學院/山東省林業有害生物防控工程技術研究中心，山東 泰安 271018）

球毛殼菌（Chaetomium globosum）隸屬于子囊菌門（Ascomycota），核菌綱（Pyrenomycetes），糞殼菌目（Sordariales），毛殼菌科（Chaetomiaceae），毛殼菌屬（Chaetomium），是公認的生產碳水化合物活性酶和抗生素的真菌，也是公認的植物生防菌[1-3]。球毛殼菌（C.globosum）ND35 是分離自健康毛白楊的一株具有促生、抗逆和防病功能的植物內生真菌。大量試驗數據表明，球毛殼菌ND35 能夠在宿主植物體內長期定殖，促進植物生長發育，提高植物抗逆性，同時對多種植物病原菌產生拮抗作用[4-10]。

枸杞（Lycium），茄科枸杞屬多年生木本植物，起源于中國，多分布于溫帶和亞熱帶地區，在中國北方多數省區都有栽培。枸杞喜光，喜冷涼氣候，耐寒、耐寒、耐鹽堿能力較強，在干旱荒漠地、鹽堿地動能生長。扦插育苗是枸杞是規模化育苗的主要無性繁殖方式的，具有保持品種遺傳特性、繁殖系數高、成苗快速、成本低等特點。目前，枸杞扦插育苗的研究主要集中在提高插穗成活率的技術措施，如促生根劑的選擇及使用方法、采條時間、促進生根等措施[11-13]。為了解決枸杞扦插育苗成活率低，扦插育苗病蟲害等問題。本試驗通過采用植物內生菌處理寧夏枸杞扦插苗，觀測球毛殼菌ND35 處理對寧夏枸杞扦插苗根形態生長發育的影響，篩選枸杞苗木繁育篩選新型微生物生根劑，為枸杞扦插育苗繁育質量和產量提供理論依據。

2 材料與方法

2.1 供試材料

供試的球毛殼菌ND35 菌株由山東農業大學高克祥教授饋贈，枸杞扦插枝（寧枸7 號）由寧夏農林科學院李越鯤研究員饋贈，并于2022 年—2023 年分別在平度市大澤山林場、泰安市徂徠山林場的溫室內進行引種定植。2023 年5 月從各林場挑選苗高、地徑較均勻一致的健康枸杞扦插苗共60 株，隨機選擇20 株為一組，共3 組處理。球毛殼菌ND35 對枸杞扦插苗根系發育影響的試驗均在山東農業大學微生物實驗室開展。

2.2 試驗方法

2.2.1 試驗設計

枸杞扦插枝清水浸泡30 分鐘后進行試驗處理，本試驗設置2 個處理，即對照組（CK），枸杞扦插時不加ND35 菌劑；處理組（ND），枸杞扦插時接種球毛殼菌ND35（使用蘸根法接種球毛殼菌ND35 菌劑（孢子濃度2×107 個/g），要求球毛殼菌ND35 菌劑均勻覆蓋扦插枝表皮，ND35 菌劑用量約為1.0 g），并于扦插后60 天取樣調查，調查側根數量、根系活力和葉綠素含量等指標。

2.2.2 根系活力測定

根系活力測定的樣品應該保證扦插苗根系的完整，取0.2 g 根系生命活動力最為旺盛的部位是根尖（根分生區）作為測定根系活力的材料。采用北京索萊寶科技有限公司所生產的植物根系活力檢測試劑盒（TTC法，BC5270）測定不同處理下枸杞根系活力。

2.2.3 根系木質素含量及其合成相關酶活性測定

根系木質素測定的樣品應該保證扦插苗根系的完整，取0.2 g 根系成熟區（靠近扦插條的部位）作為測定根系木質素含量、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性和過氧化物酶（POD）活性的材料。采用北京索萊寶科技有限公司所生產的木質素含量檢測試劑盒（BC4200）、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性檢測試劑盒（BC0210）、過氧化物酶(POD)活性檢測試劑盒（BC0090）測定不同處理下枸杞根系活力及其合成相關酶活性。

2.2.4 葉綠素含量測定

將材料葉片表面的灰塵清洗干凈，用打孔器取直徑約1 cm 的葉片組織，取樣時注意避開主脈和較粗大的副脈。每一重復稱取0.2 g 樣品組織并剪成細絲，可使葉綠素提取更加充分。處理完成后放入試管內，加入10 mL 丙酮乙醇等比例混合液，充分搖晃使提取液完全浸沒葉片細絲，置于30℃黑暗條件下提取至細絲完全變白，提取過程中輕輕搖晃試管幾次可以有效縮短提取時間。分別在波長為663 nm 和645 nm 下測定提取液吸光度值，記錄吸光度D 的值。將吸光度D 帶入對應公式中計算葉綠素a 含量、葉綠素b 含量和葉綠素總量并求均值。

葉綠素含量的計算公式如下：

2.3 數據處理

用IBM SPSS Statistics 21 軟件對不同處理扦插苗的根系活力、葉綠素總含量和側根數量進行檢驗分析。用WPS 2023、OriginPro 2017 軟件對試驗數據進行統計并作圖。

3 結果與分析

3.1 球毛殼菌ND35 對枸杞根系生長發育的影響

試驗結果表明，球毛殼菌ND35 處理對寧枸7 號扦插苗的成活率沒有影響，但對枸杞扦插苗的根系生長發育存在影響（表1）。相比于對照組（CK），球毛殼菌ND35 處理組（ND）的枸杞扦插苗側根數量、根系活力、根系木質素含量和葉綠色含量顯著增加（P＜0.05），分別提高了 44.83%、14.28%、9.49%和49.05%。

表1 球毛殼菌ND35 對枸杞根系生長發育的影響Table 1 The effect of C.globosum strain ND35 on the root growth and development of Lycium barbarum

3.2 球毛殼菌ND35 對枸杞根系酶活性的影響

從寧枸7 號扦插苗生長時期的苯丙氨酸解氨酶（PAL） 活性和過氧化物酶（POD） 活性活性變化趨勢可以看出，球毛殼菌ND35處理的枸杞扦插苗的PAL活性和POD 活性總體上高于對照組（CK）。球毛殼菌ND35 處理的枸杞扦插苗的生長前期 （7 天和14 天）PAL 活性和POD 活性與對照組（CK）無顯著差異。球毛殼菌ND35 處理的枸杞扦插苗的生長后期 （21～49 天）PAL 活性顯著高于對照組（CK），分別提高了25.86%、20.27%、18.35%、19.22%、23.62%（圖2A）。球毛殼菌ND35 處理的枸杞扦插苗的生長后期 （21～49 天）POD活性總體上高于對照組（CK），分別提高了20.55%、27.12%、-11.94%、20.01%、17.51%，其中，第21 天、第28 天和第42 天時ND 處理組POD 活性顯著高于對照組，第35 天時ND 處理組POD 活性低于對照組（圖2B）。

圖1 球毛殼菌ND35 對枸杞根系生長發育的影響Figure 1 The effect of C.globosum strain ND35 on the root growth and development of L.barbarum

圖2 球毛殼菌ND35 對枸杞根系PAL 活性（A）和POD 活性（B）的影響Figure 2 The effect of C.globosum strain ND35 on PAL activity (A) and POD activity(B) of L.barbarum roots

4 結論與討論

植物內生菌是廣泛分布于自然界植物體內的微生物資源，由于內生菌長期生活在植物體的特殊和環境里，并和宿主協同進化，在演變過程中二者形成了互利共生關系，一方面植物為內生菌提供光合產物和礦物質供內生菌生長需要，另一方面內生菌在宿主的生長發育和系統演化過程中起重要作用[14]。目前研究表明，植物內生菌具有促進植物生長發育，誘導植物抗病性，增強抵抗非生物脅迫的抗性如干旱、寒冷、重金屬，抑制病原微生物生長等功能[15]。植物內生菌促進植物生長發育的方式，主要體現在以下幾方面：1）增進宿主植物對N、P、K 等營養元素的吸收[16]，如植物內生菌Neotyphodium coenophialum 可顯著促進高羊茅的氮積累和氮代謝[17]；2）通過調節植物的激素分泌調節植物內部激素水平來促進植物生長[18]，如植物內生菌印度梨形孢(Piriformospora indica)可通過誘導宿主植物細胞分裂素、生長素的產生，促進了寄主植物的生長[19]；3）植物內生菌能生成與宿主植物相同或相似的次生代謝產物，如高溫脅迫環境下內生菌(Paecilomyces formosus)能夠產生植物激素和有機酸促進粳稻生長[20]。

球毛殼菌（Chaetomium globosum）ND35 是分離自健康毛白楊的一株具有促生、抗逆和防病功能的植物內生真菌。前期試驗數據表明，球毛殼菌ND35 能夠促進楊樹、核桃、板栗、平邑甜茶、楸樹、小麥、草莓、黃瓜、番茄、菜豆、煙草、生姜等十余種植物的生長發育[5-7,21-26]。球毛殼菌ND35 能夠通過誘導植物內源赤霉素(GA)、生長素(IAA)、水楊酸(SA)、茉莉素(JA)等激素產生促進黃瓜胚根的生長發育[5]，同時，球毛殼菌ND35 能夠通過誘導PAL、POD 和多酚氧化酶（PPO）活性的提高，增加植物對病原微生物的抗性[9]。本研究證明球毛殼菌ND35 能夠顯著促進枸杞扦插苗生長發育，對枸杞側根生長和木質化具有積極影響。本研究論文進一步驗證了球毛殼菌ND35 的廣譜促生效果，同時也為球毛殼菌ND35 在枸杞繁育、栽培生產中的開發應用提供理論依據。