let-7c-5p通過靶向CD74基因在糖尿病視網膜病變中的致病作用

楊立平，曹亞微，王亞莉，劉一棟

糖尿病是一種以高血糖為特征的慢性代謝紊亂，其病因是糖穩態受損、胰島素活性降低和胰島素抵抗。高血糖的長期并發癥包括血脂異常、高血壓和氧化應激。這些反過來又導致嚴重的多系統并發癥，導致微血管和神經功能障礙，包括腎病、神經病變、大血管相關中風、缺血性心臟病和視網膜病變。糖尿病視網膜病變（DR）是其嚴重的多系統并發癥之一，其發展緩慢且往往是隱匿的。這種疾病是工作年齡成年人視力喪失的最常見原因，其特征是視網膜的功能和形態變化。它是由血管改變引起的缺血和炎癥狀況惡化引起的，例如白細胞淤滯的發展、基底膜的增厚、視網膜新生血管和玻璃體視網膜界面處的纖維血管組織形成。而目前所有的療法都針對DR的后期階段，因此，及早發現早期預警標志物并探明其調節機制對DR防控具有重要意義。

微RNA（miRNA）是一種單鏈非編碼小RNA（19～22個核苷酸），它們也屬于高度保守的內源性RNA序列。到目前為止，已經在整個人類基因組中鑒定出約2 000個miRNA，并在生理學和病理生理學中發揮重要作用，參與主要的生物過程，包括細胞生長，分化和凋亡。miRNA作為參與糖尿病微血管并發癥的潛在參與者而受到廣泛關注，影響腎臟，視網膜和外周神經元［1-4］。研究表明，異常表達的miRNA在微血管并發癥的關鍵致病過程中具有關鍵作用［5］，例如氧化應激、細胞凋亡、炎癥和血管生成。DR是一種進行性疾病，其持續時間依賴性，在嚴重程度逐漸增加的階段發展，伴有氧化應激、炎癥和血管生成等，導致微血管改變［6］。高血糖是DR中已知的誘因，可能引起氧化應激［7］，研究表明miRNA表達水平的變化可能與DR 的發生和進展有關［8］。并且高血糖還會刺激炎癥并促進視網膜血管功能障礙，導致毛細血管通透性和血管滲漏增加［9-10］。因此，炎癥信號通路在DR進展中可能扮演著不可或缺的角色。miRNA可以與mRNA靶標的非翻譯區（UTR）中發現的miRNA反應元件上的mRNA相互作用［11-13］。總之，miRNA以各種方式參與DR的發病機制，包括炎癥、氧化應激和血管生成。研究它們在DR中的作用可以導致對疾病的發展及其有效治療的更詳細的了解。隨著更多miRNA的發現，miRNA作為DR中的生物標志物已成為研究熱點［14］。

加權基因共表達網絡分析（WGCNA）是一種用于描述微陣列樣本中基因之間的相關性的模式系統生物學方法，廣泛用于識別候選生物標志物或治療靶標［15］。例如，使用WGCNA方法構建共表達網絡以探索糖尿病相關易感模塊和心血管疾病基因的研究［16］。在本研究中，我們使用WGCNA方法篩選出DR進展的核心miRNA和核心基因，通過雙螢光素酶實驗驗證了兩者的靶向結合關系，可為DR的診斷和治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 數據來源 本研究所有數據來源基因表達綜合數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO）數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），從GEO數據庫GSE160306、GSE160308數據集中獲得43例正常對照和80例糖尿病視網膜病變病人的miRNA表達譜數據。

1.2 加權基因共表達網絡的構建 GSE160306、GSE160308數據集包括80例糖尿病視網膜病變病人的性別、年齡和病理評分，適合構建加權基因共表達網絡。使用R包“WGCNA”構建GSE160306、GSE160308基因表達數據矩陣，選擇樣本中方差最大的前25%的基因作為后續WGCNA的輸入數據集。為了選擇標準的無標度網絡，在選擇合適的軟閾值函數之前，采用樣本層次聚類方法檢測并去除異常樣本。下一階段，構建鄰接矩陣和拓撲重疊矩陣（TOM），計算對應的相異度（1-TOM），并采用動態樹切割完成基因樹和模塊識別。最小模塊大小為30。然后通過聚類融合模塊特征基因，將高度相似的模塊合并。

1.3 核心網識別 將所需模塊中的基因輸入到相互作用基因/蛋白質檢索工具（STRING，https：//cn.string-db.org/）網站進行蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction ，PPI）分析，并獲得PPI分數。然后，將結果導入Cytoscape并使用MCODE插件進行分析。

1.4 細胞培養 人視網膜內皮細胞（human retinal endothelial cells，HREC）用含1 g/L葡萄糖的DMEM培養基與10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素培養。融合細胞在無血清的DMEM培養基中饑餓過夜，以減少血清的影響，然后以高濃度葡萄糖（25 mmol/L）刺激24 h。

1.5 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR） 使用Trizol試劑（Invitrogen， Carlsbad， CA）按照制造商的指導原則從各組細胞中提取總RNA。用Primescript RT試劑盒（Takara，中國大連） 將RNA合成互補DNA（cDNA）。利用SYBR Green mix （Takara）在Applied Biosystems 7500儀器中進行cDNA擴增和定量。本研究使用的引物序列在表1。采用2-ΔΔCt法測定基因相對表達量。內對照分別為Ⅱ型穿膜蛋白CD74和let-7c-5p的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）和U6。

表1 引物序列

1.6 雙螢光素酶報告實驗 將含有let-7c-5p結合位點的野生型（WT）或突變型（MUT）CD74片段引入pGL3-basic載體（Promega， Madison， WI， USA）。為了進行螢光素酶檢測，Hep-2細胞同時加入let-7c-5p模擬物或相應的陰性對照（NC）。48 h后，應用螢光素酶報告系統（Promega）來檢查螢光素酶的活性。

1.7 統計學方法 采用SPSS 24.0和GraphPad Prism 8.0.1軟件處理數據。符合正態分布計量資料以表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，采用Pearson相關性分析檢驗兩變量的相關性。以P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 WGCNA鑒定與DR進展相關的核心miRNA 為了鑒定與DR進展相關的miRNA，我們通過WGCNA在GSE160308中構建共表達網絡，使用80個樣本構建鄰接矩陣（圖1A）。在本研究中，我們選擇β=5作為閾值構建無縮放網絡（圖1B、1C），在使用合并的動態樹切割后共鑒定出4個miRNA表達模塊，通過構建隨機基因網絡圖譜，分析其與DR進展的相互作用關系，通過計算模塊特征基因與臨床特征之間的相關性，我們發現turquoise模塊與DR的發展相關性最強（圖1D），隨后我們以severity score≥0.2與相關系數≥0.8共獲得let-7c-5p和miR-26a-5p兩個核心miRNA（圖1E）。

圖1 鑒定與糖尿病視網膜病變（DR）進展相關的核心微RNA（miRNA）：A為樣本樹狀圖；B、C分別為分析無尺度擬合指數和各種軟閾值函數的平均連通性，評估β=5時的無縮放拓撲；D為模塊特征基因與DR臨床性狀相關性的熱圖；E為miRNA severity score與相關系數散點分布圖（每個點代表一個miRNA）

2.2 WGCNA鑒定與DR進展相關的核心基因隨后，我們進一步鑒定與DR進展相關的基因，通過WGCNA在GSE160308構建共表達網絡，在本研究中，我們選擇β=3作為閾值構建無縮放網絡，動態樹切割后共鑒定11個基因模塊。為了獲得中心基因，我們分析了與DR相關性最高模塊中基因的PPI網絡，將結果導入Cytoscape軟件，用MCODE插件進行處理，并在度截止值=2的條件下得到11個核心基因，包括CD74（圖2）。

圖2 與糖尿病視網膜病變（DR）相關性最強的模塊中的蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）核心網絡

2.3 高糖誘導的視網膜細胞let-7c-5p與CD74表達及相關性 為了進一步驗證DR進展的調節機制，探尋核心miRNA和核心基因的相互關系。我們通過ENCORI數據庫對核心miRNA和核心基因進行匹配，發現let-7c-5p與CD74存在靶向結合的可能性，因此我們在高糖誘導的人類視網膜細胞中檢測let-7c-5p和CD74的表達水平，結果表明與正常培養的人類視網膜細胞（1.01±0.02，1.00±0.01）相比，高糖處理的會顯著下調let-7c-5p的水平（0.46±0.08，t=20.01，P＜0.001）和顯著上調CD74的水平（3.62±0.13，t=60.28，P＜0.001）。隨后，我們對let-7c-5p 和CD74兩者之間的相關性進行分析，發現兩者呈現負相關關系（r=-0.99，P=0.012）。

2.4 let-7c-5p靶向抑制CD74表達 為了確定在人類視網膜細胞中let-7c-5p靶向結合CD74，我們在ENCORI數據庫中預測let-7c-5p與CD74的結合位點（圖3）。此外，let-7c-5p模擬物降低了CD74-WT的相對螢光素酶活性（1.00±0.01比0.43±0.06；t=28.11，P＜0.001）。我們沒有發現CD74-MUT組之間的差異（1.01±0.03比0.99±0.02；t=1.66，P=0.116）。

圖3 生物信息學網站預測let-7c-5p與CD74的結合位點

3 討論

DR是糖尿病最常見的并發癥之一，并且仍然是全球視力喪失和失明的主要原因［17］。糖尿病會影響眼睛的許多組成部分，但威脅視力的主要病理發生在視網膜中。盡管在 DR 的預防和治療方面取得了重大進展，但是DR的失明率并未見下降，這表明 DR 的預防和抑制仍然面臨多重挑戰，需要進一步研究。與傳統檢測和治療手段相比，miRNA的在其中扮演的角色可能非常重要。因此，通過生物信息學方法篩選關于DR進展相關的核心miRNA和核心基因，探明核心miRNA與核心基因之間的相互調節關系可能為DR進展的調控作用機制提供新的見解，可為治療DR提供新的方法。

在本研究中，我們通過WGCNA篩選出關于DR進展的兩個核心miRNA（let-7c-5p和miR-26a-5p），其中let-7c-5p在DR中顯著下調。在Grieco等［18］的研究中，DR病人血液循環中let-7c-5p不僅比正常的病人低，還比2型糖尿病的病人低。此外還有研究表明，在1型糖尿病（T1D）中， let-7c-5p與病人快速進展為終末期腎病的風險相關［19］。同時還有研究表明，let-7c-5p與2型糖尿病腎病的進展有關，可以作為2型糖尿病腎病的診斷標志物［20］。在我們的研究中let-7c-5p與DR進展相關，并且let-7c-5p呈現顯著下降趨勢。在周小平、歐鄺［21］的研究中，過表達let-7c-5p可以阻止大鼠DR模型的發展。以上數據表明，通過WGCNA篩選的let-7c-5p可以作為鑒定DR進展的標志物，通過監測let-7c-5p可以有效鑒定DR進展情況，但是本研究并未針對臨床資料進行研究，缺乏數據體現，后續研究將主要分析let-7c-5p對DR臨床意義，這也是我們后續的研究目標。

本研究通過WGCNA篩選出DR進展的核心miRNA和核心基因，并在細胞中進行let-7c-5p與CD74的表達水平和相關性，結果表明let-7c-5p靶向抑制CD74的表達。CD74是一種跨膜糖蛋白，作為伴侶調節細胞內蛋白質運輸，是細胞因子巨噬細胞移動抑制因子（MIF）和D-多巴色素互變異構酶 （DDT/MIF-2） 的同源細胞表面受體。在一項關于人類1型糖尿病病人基因表達譜進行的最大規模的研究發現，CD74是其中上調的基因之一，這些基因主要富集在炎癥響應通路中，參與高糖引起的免疫調控［22］。MIF/CD74軸在許多疾病中起到了至關重要的作用，在糖尿病足細胞損傷中，CD74在足細胞中充當MIF的受體，在糖尿病腎病的發病機制中發揮作用［23］。在一些研究中，MIF作為T1D疾病發病機制的一個促成因素，在糖尿病小鼠模型中，MIF基因表達和CD74+白細胞頻率增加，表明MIF/CD74 信號通路在促進T1D中巨噬細胞介導的炎癥中的可能作用［24］。最近有研究表明，二甲雙胍作為糖尿病的有效治療藥物，可在2型糖尿病病人中表現出其足細胞保護能力，其潛在機制可能部分歸因于其抑制MIF-CD74軸介導的炎癥級聯反應的作用［25］。而在DR中MIF/CD74信號傳導參與增殖性糖尿病視網膜病變［26］。此外，血管功能障礙和血管退化是各種炎癥性中樞神經系統疾病和炎癥相關視網膜疾病（如糖尿病視網膜病變）的標志。小膠質細胞的激活和體液先天免疫系統是促成因素。已經提出抗炎方法作為神經血管疾病的療法，包括調節小膠質細胞活化。小膠質細胞活化與炎癥性視網膜血管侵犯相關［27］，而MIF/CD74信號傳導阻礙小膠質細胞M1極化［28］。

總之，本研究通過WGCNA方法篩選出DR進展核心miRNA let-7c-5p和核心基因CD74，且兩者存在靶向抑制關系，通過探明let-7c-5p通過靶向抑制CD74 在 DR進展中的作用，可為DR的治療開發新的遺傳治療策略的靶標。