耐膽汁型牛黃轉化菌的分離、鑒定及其牛黃轉化活力研究

王厚偉，竇彥玲，趙金龍，孫 燕

耐膽汁型牛黃轉化菌的分離、鑒定及其牛黃轉化活力研究

王厚偉1，竇彥玲2*，趙金龍1，孫 燕1

1. 山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355 2. 山東中醫藥大學智能與信息工程院，山東 濟南 250355

分離和鑒定能夠耐受牛膽汁的牛黃轉化細菌，并應用到體外培育牛黃的制備。從形成牛黃的牛膽囊膽汁中分離到可在牛膽汁中長期存活且具有較強牛黃轉化能力的菌株（NDZNM-01），觀測其外部形態、理化性狀、分類學地位、牛膽汁耐受力，以及牛黃轉化活力。根據對NDZNM-01菌株外部形態與生理生化特征的檢測結果，判斷為檸檬酸桿菌屬細菌。進一步根據其16S rDNA序列的聚類分析結果，顯示該菌株與其他3種檸檬酸桿菌屬的細菌聚在一個分支上，但形成單系，屬于新發現的菌株。應用菌株NDZNM-01發酵新鮮牛膽汁，其中的膽紅素含量增加了2.35倍，膽酸含量增加了2.13倍。綜合對NDZNM-01菌株的形態觀察、生理生化鑒定，以及分子鑒定結果，NDZNM-01屬于一種能夠耐受牛膽汁的檸檬酸桿菌屬的腸道細菌，具有高效轉化牛膽汁為牛黃的活力。該牛黃轉化細菌最終命名為NDZNM-01 Wang Houwei，菌種收藏編號為CGMCC24893。

牛黃轉化菌；檸檬酸桿菌屬；牛膽汁；體外培育牛黃；分子鑒定

牛黃是?？苿游锱mel在病理狀況下于其膽囊或膽管內形成的結石的干燥品，屬于名貴中藥之一，具有清心、開竅、鎮驚、清熱、解毒等多種臨床功效[1]，中醫歷代本草學家均認為：牛黃性涼，味苦而甘，入手少陰心經與足厥陰肝經[2]。牛黃在中醫臨床上有廣泛應用，約有650種中藥成方制劑含有牛黃，包括安宮牛黃丸、犀黃丸、片仔癀等名貴中成藥[3]。然而，牛黃的自然產量十分稀少，自古皆有“藥中之貴，莫復過此”之說[4]。為解決供需矛盾，20世紀90年代蔡紅嬌教授首先研制出體外培育牛黃，并收錄于《中國藥典》2000年版[5]。體外培育牛黃是模擬病理條件下牛膽結石形成過程，應用牛膽汁與微生物共培養轉化而成，其化學成分與臨床功效與天然牛黃相近，多數情況可等同于天然牛黃入藥和臨床應用[6]。菌種的牛黃轉化效率是體外培育牛黃及其生產成本的關鍵。但由于牛膽汁具有廣譜性抑菌作用，使多數膽囊細菌不能較長時間耐受膽汁而存活，特別是一些高效牛黃轉化菌在牛膽汁中的存活時間很難超過48 h，嚴重影響體外培育牛黃的轉化效率、生產成本和市場價格。本實驗從形成牛黃的牛膽囊膽汁中分離鑒定出一種耐受膽汁的檸檬酸桿菌，對該菌株理化性狀、分類學地位、牛膽汁耐受力，以及牛黃轉化活力作了研究。

1 材料與儀器

1.1 材料

新鮮的含牛黃牛膽囊購自山東省濱州市陽信縣肉牛屠宰與加工基地，經山東中醫藥大學中藥鑒定教研室徐凌川教授鑒定為牛Gmel的膽囊，用于從中分離耐受牛膽汁的牛黃轉化菌。

1.2 儀器

HY-45A型控溫搖床（上海一恒有限公司），SJ-CJ-2F型超凈工作臺（蘇州蘇信有限公司），GL-21M型離心機（力康生物醫療科技有限公司），TF-FD-18S型冷凍干燥機（上海舜制有限公司），MJX-250B型生化培養箱（上海一恒有限公司），PCR-THG型PCR儀（賽默飛有限公司），DYY-8C型核酸電泳儀（北京六一有限公司）。

2 方法

2.1 耐牛膽汁型牛黃轉化菌株的分離

2.1.1 固體培養基的制備 用于篩選耐膽汁牛黃轉化細菌的培養基配方：胰蛋白胨1.00 g，牛肉膏0.30 g，氯化鈉0.50 g，加去離子水定容100 mL，加溫溶解，冷卻后調pH為7.2，再煮沸10 min，冷卻后濾過分裝，高壓滅菌30 min。配制固體培養基時加入1.5 g瓊脂粉；配制半固體培養基時加入0.3 g瓊脂粉。

2.1.2 牛黃轉化菌的制備 取牛膽囊中的牛膽汁，在固體培養基上劃線培養，于37 ℃恒溫培養24 h后，挑取分離度良好的單個菌落，分別接種于“2.1.1”項培養基中，做好編號，培養24 h后，各取100 μL菌液加入至50 mL滅菌牛膽汁中，培養96 h后，再各取10 μL涂布于固體培養基上，培養72 h后，計數菌落數量，將菌落數量大于1000的菌落指定為牛膽汁耐受菌株。根據《中國藥典》2020年版[1]方法檢測各培養耐受菌株的牛膽汁中膽紅素與膽酸含量，將發酵牛膽汁中膽紅素與膽酸含量超過天然牛膽汁2倍以上的菌落指定為牛黃轉化菌。

2.2 耐牛膽汁型牛黃轉化菌NDZNM-01的形態學觀察與生理生化鑒定

按照“2.1”項方法分離得到46個單菌落，用含70%牛膽汁的液體培養基進行培養，每隔1 d取培養液進行菌體計數與膽紅素和膽酸含量檢測，選取一株膽紅素和膽酸綜合轉化率高的耐膽汁菌株命名為NDZNM-01，將菌株接種于“2.1.1”項固體培養基上，37 ℃培養24 h后，記錄其菌落形態特征，進行革蘭氏染色，進行形態學觀察。取純化的NDZNM-01菌種接種于“2.1.1”項所述液體培養基，37 ℃，160 r/min振蕩培養24 h，取10 μL菌液接種細菌微量生化反應管，37 ℃培養24～48 h，參照《伯杰細菌鑒定手冊》進行生理生化鑒定實驗[7]，包括革蘭染色、葡萄糖和蔗糖發酵實驗、檸檬酸鹽和硝酸鹽利用實驗、乙酰甲基甲醇實驗（V.P實驗）、淀粉水解實驗、甲基紅實驗（M.R實驗），并根據參考文獻方法[8]進行胞外酶活性檢測（接觸酶、氧化酶、賴氨酸脫羧酶、苯丙氨酸脫氨酶）。

2.3 牛黃轉化菌NDZNM-01的生長曲線測定

菌株NDZNM-01分別用“2.1.1”項所述液體培養基、含60%牛膽汁的“2.1.1”項液體培養基、過濾除菌的牛膽汁進行培養，pH為7.2，培養溫度為37 ℃，振蕩培養（160 r/min），每隔12 h測定培養液吸光度（560），以對應的不接種菌株的培養液為對照，制作時間-吸光度曲線。

2.4 牛黃轉化菌NDZNM-01的分子鑒定

采用TIANGEN 細菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）按試劑盒說明書提取菌株NDZNM-01的基因組DNA。應用BLASTn程序對GenBank的nr數據庫中收錄的腸桿菌16S rDNA序列做多重比對，根據比對結果選擇保守的共有序列作為PCR擴增引物。正向F引物（16 bp）：5’-CGCAAGCC- TGATGCAG-3’；反向R引物（16 bp）：5’-CTTCGCGTTGCATCGA-3’。PCR反應體系（25 μL）包含：DNA模板1.0 μL，5×Buffer 3.0 μL，F引物（10 μmol/L）和R引物（10 μmol/L）各0.5 μL，dNTP（2.50 mmol/L）1 μL，ddH2O定容至25 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，50℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環30次后，72 ℃延伸12 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，應用TIANGEN（DP209）瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收，委托上海生工生物工程公司完成測序。應用BLASTn程序檢索GenBank的nr數據庫，對測得的16S rDNA序列做同源性比對。采用Fast Minimum Evolution法構建系統發育樹，建樹Max Seq Difference值設為0.1。應用DNAStar的EditSeq子程序進行序列統計分析。

2.5 發酵條件對NDZNM-01牛黃轉化能力影響

根據《中國藥典》2020年版，將菌株NDZNM-01分別接種到新鮮的牛膽汁中，37 ℃連續震蕩培養（120 r/min）14 d，設置不接種菌種的同一批次牛膽汁作為空白對照，每隔1天檢測培養物560 nm光吸收值（），根據上述《中國藥典》2020年版方法檢測發酵牛膽汁中膽紅素與膽酸的含量，表示菌種NDZNM-01的牛黃轉化能力[1]。

2.5.1 發酵液pH值對菌株NDZNM-01牛黃轉化能力影響 將菌株NDZNM-01接種到含60%牛膽汁的“2.1.1”項液體培養基中，培養3 d，用檸檬酸和氫氧化鈉溶液調節牛膽汁pH值，取菌種培養液5.0 mL分別接種到pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的95.0 mL牛膽汁中，37 ℃條件下振蕩培養（120 r/min），培養7 d后，分別檢測560 nm值，根據上述《中國藥典》2020年版檢測牛膽汁中的膽紅素和膽酸的含量。

2.5.2 發酵溫度對菌株NDZNM-01牛黃轉化能力影響 取用含60%膽汁的“2.1”項培養基培養的菌株NDZNM-01培養液5.0 mL接種到95.0 mL新鮮牛膽汁中，分別在10、15、20、25、30、35和40 ℃條件下振蕩（120 r/min）培養16 d，于560 nm檢測菌體濃度，根據上述《中國藥典》2020年版方法檢測牛膽汁中的膽紅素和膽酸的含量。

3 結果與分析

3.1 耐牛膽汁型牛黃轉化菌NDZNM-01的形態觀察和牛黃轉化能力檢測

按照“2.1.1”項方法，分離到46個菌株能夠耐受牛膽汁且具有牛黃轉化能力。其中菌株NDZNM-01的牛黃轉化能力較強，在“2.1.1”項固體培養基上形成濕潤低凸、表面光滑、邊緣整齊、半透明的灰色圓形菌落，革蘭染色陰性，光鏡下呈短桿狀，兩邊鈍圓，周鞭毛，無菌毛，估算菌體大小約2.5 μm×3.5 μm（圖1）。

A-菌株NDZNM-01的形態特征 B-NDZNM-01發酵牛膽汁形成牛黃顆粒渾濁液 C-NDZNM-01發酵牛膽汁引發牛黃顆粒聚合成石過程 D-NDZNM-01發酵牛膽汁引發牛黃顆粒聚合成型

A-morphological characteristics of strain NDZNM-01 B-NDZNM-01 fermented bovine bile to formgranule turbid liquid C- polymerization ofparticles into lithogenesis by NDZNM-01 fermentation of bovine bile D- polymerization ofgranules by NDZNM-01 fermentation of bovine bile

圖1 耐牛膽汁型牛黃轉化菌NDZNM-01的形態觀察及其牛黃轉化能力

Fig. 1 Morphological observation andtransformation ability of bovine bile-resistant bezoar transforming bacteria NDZNM-01

3.2 耐牛膽汁型牛黃轉化菌NDZNM-01的生理生化特征

菌株NDZNM-01的革蘭氏染色、V. P實驗、淀粉水解、蔗糖發酵實驗等顯陰性，葡萄糖、檸檬酸鹽和硝酸鹽利用實驗、M. R實驗、接觸酶檢測等顯陽性，氧化酶、賴氨酸脫羧酶、苯丙氨酸脫氨酶活性檢測等顯陰性（表1）。將檢測結果與《伯杰細菌鑒定手冊》進行對比，初步判定菌株NDZNM-01為檸檬酸桿菌屬細菌。

表1 菌株NDZ-1的生理生化性質

Table 1 Physio-chemical properties of strain NDZ-1

鑒定指標菌株NDZ-1鑒定指標菌株NDZ-1 革蘭染色?M.R試驗＋ 葡萄糖＋硝酸鹽＋ 檸檬酸鹽＋賴氨酸脫羧酶? 接觸酶＋苯丙氨酸脫氨酶? 氧化酶?蔗糖? V.P試驗?淀粉水解?

“+”：陽性或有反應；“?”：陰性或沒反應

“+”: positive; “?”: negative or no reaction

3.3 耐牛膽汁型牛黃轉化菌NDZNM-01的分子鑒定與系統分類

菌株NDZNM-01的16S rRNA的基因片段的測序結果如圖2所示。序列總長度為598 bp，（C＋G）含量為55.69%。

應用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）提供的BLASTn程序（https://blast.ncbi.nlm.nih.g ov/Blast. cgi）檢索rRNA/ITS databases數據庫，結果顯示，菌株NDZNM-01的16S rRNA基因擴增片段與檸檬酸桿菌屬對應序列的相似度大于98%，特征性堿基位點包括265-A、275-C、280-G、282-A、537-A、581-A。應用Fast Minimum Evolution法構建系統發育樹，菌株NDZNM-01與其他3種檸檬酸桿菌屬的細菌聚在一個分支上，形成單系（圖3）。

方框內突出顯示的堿基為NDZNM-01的特征性堿基位點

綜合以上對菌株NDZNM-01的形態觀察、生理生化鑒定，以及分子鑒定結果，可以判斷菌株NDZNM-01屬于一種檸檬酸桿菌屬的腸道細菌, 初步命名為NDZNM-01。

3.4 耐牛膽汁型牛黃轉化菌NDZNM-01的生長曲線

將NDZNM-01單菌落接種于5 mL方法“2.1.1”項所述液體培養基中，37 ℃震蕩培養6 h后，再取其中1 mL菌液接種于含100 mL液體培養基中進行振蕩培養，每隔1 d測量菌體密度（OD560），以OD560值為縱坐標，以培養時間為橫坐標制作生長曲線。由圖4可見，菌株NDZNM-01的停滯期在48 h以內，此后便進入了到菌體密度快速增長的對數增長期，培養至96 h時菌體密度最大，此后繼續培養4 d，菌體密度開始緩慢下降。

圖3 基于Fast Minimum Evolution法構建的菌株NDZNM-01及其近緣菌株16S rRNA基因片段序列的無根系統發育樹

圖4 NDZNM-01的生長曲線

3.5 發酵pH值對NDZNM-01的牛黃轉化能力的影響

按照“2.5.1”項方法，取5.0 mL的NDZNM-01菌液（OD560＝0.505）接種到pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的95.0 mL牛膽汁進行振蕩培養，測定牛膽汁中的膽紅素和膽酸的含量，作出pH-膽紅素、膽酸轉化率曲線。由圖5可見，菌株NDZNM-01在pH 7.5時發酵牛膽汁中膽紅素含量最高，為16.75%，在pH 6.5時膽酸含量最高，為5.16%，而未發酵牛膽汁中膽紅素含量僅為7.14%，膽酸含量為2.42%。由此可見，經菌株NDZNM-01發酵的牛膽汁中膽酸和膽紅素含量極顯著提高，其中膽紅素含量增加了2.35倍，膽酸含量增加了2.13倍。

由圖5可見，牛膽汁的pH值對菌株NDZNM-01的膽酸與膽紅素的轉化率影響不一致，膽紅素在偏堿性條件下轉化率高，而膽酸則在偏酸性環境下轉化率高。其中膽酸含量遠超過中國藥典標準，因此發酵牛膽汁的pH值以優先滿足膽紅素的轉化為原則。綜合2方面因素，菌株NDZNM-01的牛黃轉化效率以發酵膽汁的pH值為7.2為佳，pH過高和過低都不利于牛黃轉化。

圖5 牛膽汁pH值對NDZNM-01牛黃轉化率的影響

3.6 發酵溫度對菌株NDZNM-01牛黃轉化能力的影響

按照“2.5.2”項方法，接種5.0 mL的NDZNM-01培養液（OD560＝0.505）于95.0 mL新鮮牛膽汁中，分別在10、15、20、25、30、35、40 ℃條件下振蕩（120 r/min）培養16 d，按照“2.1.2”項方法檢測牛膽汁中的膽紅素和膽酸的含量。從圖6可見，菌株NDZNM-01在30 ℃培養時，發酵至16 d膽酸含量最高，達到6.42%；在25 ℃和30 ℃培養時，發酵至14 d膽酸轉化效率進入緩慢增長期；在35 ℃和40 ℃培養時，發酵至12 d膽酸轉化率進入緩慢增長期；在膽汁的發酵溫度為10、15、20 ℃時，膽酸含量與發酵時間正相關，未出現緩慢增長期。

圖6 發酵溫度對NDZNM-01膽酸轉化能力的影響

從圖7可見，菌株NDZNM-01在牛膽汁中的發酵溫度為30 ℃培養時，發酵至16 d膽紅素含量最高，達到2.01%，在發酵至14 d時膽紅素轉化率進入緩慢增長期；發酵溫度為35、40 ℃時，發酵至12 d膽紅素轉化率進入緩慢增長期；在發酵溫度為10、15、20、25 ℃時，膽紅素含量與發酵時間正相關，未出現緩慢增長期。

4 討論

天然牛黃是牛病理性膽囊結石，微生物感染膽囊是膽囊膽汁形成牛黃結石的病理性條件之一[8]。但牛膽汁本身具有廣譜性抑菌作用，多數腸道細菌無法在牛膽汁中存活，更不具有牛黃轉化能力[9]。

因此，篩選既具有牛黃轉化活性又能長時間存活于牛膽汁中的微生物菌種是應用牛膽汁為底物發酵生產體外培育牛黃的關鍵。鑒于多數腸道細菌在牛膽汁中的存活時間難以超過48 h，篩選耐受牛膽汁的高效牛黃轉化菌，是提高體外培育牛黃生產效率，降低生產成本的關鍵。

圖7 發酵溫度對NDZNM-01膽紅素轉化能力的影響

本研究從形成牛黃的膽囊膽汁中分離得到46株細菌，鑒定出一種能夠長時間耐受牛膽汁的菌株（NDZNM-01），該菌株具有較高的牛黃轉化效率。根據對NDZNM-01生理生化鑒定結果，初步判定菌株NDZNM-01為檸檬酸桿菌屬細菌。根據NDZNM-01的16S rRNA基因片段的PCR擴增、測序與聚類分析結果，菌株NDZNM-01與其他3種檸檬酸桿菌屬的細菌聚在一個分支上，但形成單系，屬于新發現的菌株。綜合對菌株NDZNM-01的形態觀察、生理生化鑒定，以及分子鑒定結果，可以判斷菌株NDZNM-01屬于一種檸檬酸桿菌屬的腸道細菌。

應用菌株NDZNM-01發酵新鮮牛膽汁，其中的膽酸和膽紅素含量極顯著提高。在發酵溫度為30 ℃培養時，發酵16 d的膽紅素與膽酸的含量分別達到2.01‰和6.42%，膽紅素含量比天然牛膽汁增加了2.35倍，膽酸含量增加了2.13倍。最終，我們將該牛黃轉化細菌命名為NDZNM-01 Wang Houwei，并交由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏（編號：CGMCC24893，日期：2022.05.12），一并申請國家發明專利保護。本研究首次報道了一種檸檬酸桿菌屬的牛黃轉化菌株，這與以往應用大腸桿菌作為牛黃轉化菌株不同，具有原始創新性。今后將進一步應用途徑工程技術對該牛黃轉化菌株進行遺傳改造，提升其牛黃轉化效率。本研究結果為實現體外培育牛黃生產的降本增效，實現牛黃的普惠眾生和振興中醫藥事業具有一定的影響和意義。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國藥典 [S]. 一部. 2020: 181.

[2] 國家中醫藥管理局中華本草編委會, 中華本草（第九冊）[M]. 上海: 上?？茖W技術出版社出版, 1999: 694.

[3] 趙國平, 戴慎, 陳仁壽, 南京中醫藥大學編著. 中藥大辭典 [M]. 第2版. 上海: 上?？茖W技術出版社, 2006: 565.

[4] 《全國中草藥匯編》編寫組. 全國中草藥匯編（上冊）[M]. 第2版. 北京: 人民衛生出版社, 1996: 208.

[5] 吳濤, 張程亮, 蔡紅嬌, 等. 牛黃及體外培育牛黃的藥理作用研究進展 [J]. 中國藥師, 2014, 17(8): 1396-1399.

[6] 蔡紅嬌, 裘法祖, 劉仁則. 體外培育牛黃的藥學研究 [J]. 中國天然藥物, 2004, 2(6): 335-338.

[7] R. E. 布坎南，N. E. 吉本斯, 等. 伯杰細菌鑒定手冊[M]. 第8版. 北京: 科學出版社, 1984: 729-759.

[8] Levine M, Lohinai Z M. Resolving the contradictory functions of lysine decarboxylase and butyrate in periodontal and intestinal diseases [J]., 2021, 10(11): 2360.

[9] Bia?ucha A, Gospodarek-Komkowska E, Kwiecińska- Piróg J,. Influence of selected factors on biofilm formation bystrains [J]., 2020, 9(1): 43.

[10] Willem M de Vos, Herbert T, Matthias V H,. Gut microbiome and health: Mechanistic insights [J]., 2022, 71(5): 1020-1032.

Isolation and identification of a bile-toleranttransforming bacteria and its transformation activity

WANG Hou-wei1, DOU Yan-ling2, ZHAO Jin-long1, SUN Yan1

1. School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355 China 2. School of Intelligence and Information Engineering, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China

To isolate and identify a Niuhuang () transformed bacterium that can tolerate bovine bile, and apply it to the transformation ofcultivated.The strain (NDZNM-01) that could survive in bovine bile for a long time with hightransformation ability was screened and isolated from bovine bile, which external morphology, physicochemical properties, taxonomic status, ability to tolerate bovine bile, and transformation activity ofwere observed and determined.According to the detection results of the external morphology and physiological and biochemical characteristics of NDZNM-01, it was preliminarily determined to be a bacterium of the genus. According to the results of cluster analysis of 16S rDNA sequence, it was shown that NDZNM-01 and the other threebacteria clustered into one branch, but formed a single line, belonging to a newly discovered strain. Using strain NDZNM-01 to ferment fresh bovine bile, the content of bilirubin increased by 2.35 times and the content of bile acid increased by 2.13 times.Based on results of the morphological observation, physiological and biochemical identification, and molecular identification, it can be judged that strain NDZNM-01 belongs to an intestinal bacterium of the genusthat can tolerate bovine bile, and has the activity of efficiently converting bovine bile into. Thetransformed bacterium was finally namedNDZNM-01 Wang Houwei, and the collection number was CGMCC24893.

transforming bacteria;; bovine bile;sativus cultivated; molecular identification

R286.2

A

0253 - 2670(2023)17 - 5742 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.17.027

2023-03-03

山東省自然科學基金資助項目（ZR2013HM035）；濟南科技發展計劃資助項目（201102021）；山東省高?？萍加媱澷Y助項目（J11LF29）

王厚偉，研究生導師，副教授，研究方向為中藥大健康生物技術與名貴特色中藥研發。Tel: 13791138419 E-mail: houweiw@163.com

竇彥玲，副教授，從事計算機科學與技術研究。Tel: 15864533191 E-mail: yanlingdou@163.com

[責任編輯 時圣明]