不同產地顯齒蛇葡萄以及近緣種指紋圖譜的建立及有效成分分析

凌偉紅，陳 燕，馮 淼，王超純，龔慧敏，田春蓮, , 4*

不同產地顯齒蛇葡萄以及近緣種指紋圖譜的建立及有效成分分析

凌偉紅1，陳 燕2，馮 淼1，王超純1，龔慧敏3，田春蓮1, 3, 4*

1. 吉首大學 林產化工工程湖南省重點實驗室，湖南 張家界 427000 2. 張家界市永定區農業農村局，湖南 張家界 427000 3. 吉首大學生物資源與環境科學學院，湖南 吉首 416000 4. 杜仲綜合利用技術國家地方聯合工程實驗室，湖南 吉首 416000

建立顯齒蛇葡萄以及近緣種的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并對有效成分進行定量分析。使用Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相為乙腈-0.01%磷酸，檢測波長為280、360 nm，體積流量為1 mL/min，進樣量20 μL，柱溫30 ℃下梯度洗脫，建立顯齒蛇葡萄以及近緣種HPLC指紋圖譜，結合相似度評價、層次聚類分析（clustering analysis，CA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）與正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares method-discriminant analysis，OPLS-DA）等化學模式識別方法，評價不同產地顯齒蛇葡萄及近緣種的質量。建立的HPLC指紋圖譜方法符合方法學要求，18批顯齒蛇葡萄屬樣品指紋圖譜有31個共有峰，經對照品定性指認4、9、11、14、15和24號峰對應的化合物分別為沒食子酸、兒茶素、二氫楊梅素、蘆丁、楊梅苷和楊梅素，且相似度＞0.8；所有樣品按產地經CA分為2類，PCA結果與其一致；OPLS-DA篩選出不同產地顯齒蛇葡萄及近緣種的13～14個差異標志物，以二氫楊梅素和楊梅素為主要差異標志物。建立的指紋圖譜方法穩定、可靠、重復性好，結合化學模式識別可用于作為藤茶原料的蛇葡萄屬植物的質量評價。

藤茶；顯齒蛇葡萄；HPLC指紋圖譜；化學模式識別；正交偏最小二乘法-判別分析；沒食子酸；兒茶素；二氫楊梅素；蘆丁；楊梅苷；楊梅素

藤茶是由葡萄科（Vitaceae）蛇葡萄屬L. 植物的嫩莖葉加工而成，又稱莓茶、甜茶藤、龍須茶和甘露茶[1]。藤茶是我國南方地方習用類茶，常用于治療口腔潰瘍、咽喉腫痛、感冒發熱、濕熱黃疸、目赤腫痛和癰腫瘡癤等癥狀[2]。藤茶的化學成分、保健屬性和功能特性已受到學者的廣泛關注，有望成為預防與高脂肪飲食有關的代謝性疾病的輔助飲食[3-4]。顯齒蛇葡萄(Hand.-Mazz.) W. T. Wang為主要藤茶加工原料，富含黃酮類、甾體類、萜類、多酚等有效成分，其中黃酮類成分抗病毒、抗菌、抗炎、調節免疫等功效顯著[5]。顯齒蛇葡萄分布區域廣，主產于湖南、湖北、廣東、廣西、云南等地[6]，產地環境及生長條件造成有效成分差異較大。目前，地方標準僅以二氫楊梅素含量作為質量控制的考察指標，無法完整反映顯齒蛇葡萄內在品質和產地質量差異，限制了顯齒蛇葡萄葉作為新資源食品的應用。因此，建立一種整體、全面的藤茶植物質量控制方法尤為重要。

化學識別模式結合指紋圖譜可將指紋圖譜中的有效信息提取，以獲得完整的質量信息，在中藥材鑒別的作用日益凸顯[7-8]。目前，藤茶HPLC指紋圖譜研究多為方法學考察，應用聚類分析（clustering analysis，CA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）對顯齒蛇葡萄分類描述[4, 9-12]，吳佳等[13]首次采用CA、PCA結合正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares method - discriminant analysis，OPLS-DA）篩選其普葉和龍須的7個差異性成分。藤茶原料植物為顯齒蛇葡萄，但同屬植物廣東蛇葡萄與羽葉蛇葡萄也為加工原料[14]，導致藤茶產品同名異物。因此，為有效甄別藤茶及其易混品，從材料源頭控制藤茶品質，本研究采用HPLC雙波長切換法，建立藤茶植物定量指紋圖譜，結合相似度評價、CA、PCA、OPLS-DA等化學識別模式，鑒別各地用于加工藤茶的3種蛇葡萄屬植物并篩選差異標志物，以期為藤茶質量控制、標準制訂提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；FA1004型萬分之一電子天平（上海舜宇恒平儀器有限公司）；EX125DZH型奧豪十萬分之一電子天平（上海析平科學儀器有限公司）；DSA300-GL1型超聲波清洗儀（福州德森精工有限公司）。

1.2 試藥

對照品兒茶素（批號200829）、蘆丁（批號RP190213）購自成都麥德省科技有限公司；沒食子酸（批號202011-201215）、楊梅苷（批號202012-201218）購自中原植提標準品實驗耗材中心；二氫楊梅素（批號20190610）購自中國生物制品檢定所；楊梅素（批號L1623059）購自上海麥克林生化科技有限公司，質量分數均＞98%。乙腈為色譜純，磷酸等其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

1.3 樣品

20批次樣品于2021年5月下旬～6月初采自湖南、湖北、廣西、云南4省18個產地（表1），經吉首大學廖儒博研究員鑒定S1～S18為顯齒蛇葡萄(Hand. -Mazz.) W. T. Wang，S19為羽葉蛇葡萄(Lévl. et Vant.) Rehd.，S20為廣東蛇葡萄(Hook. et Arn.)Planch的4年生植物。取長5～7 cm的嫩莖葉50 ℃烘干，分別粉碎，過40目篩備用。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取二氫楊梅素、楊梅素、楊梅苷、沒食子酸、兒茶素、蘆丁適量置入5 mL量瓶中，加入60%的甲醇溶解并定容，搖勻，得140 μg/mL沒食子酸、10 406 μg/mL二氫楊梅素、2034 μg/mL楊梅苷 162 μg/mL楊梅素、78 μg/mL兒茶素、126 μg/mL蘆丁的照品溶液，按一定梯度稀釋，得不同質量濃度的對照品溶液。

表1 樣品及來源信息

Table 1 Samples and source information

編號產地品種編號產地品種 S1湖南永定三家館顯齒蛇葡萄S11湖南雙牌上梧江顯齒蛇葡萄 S2湖南永定溫塘顯齒蛇葡萄S12湖南桂東四都顯齒蛇葡萄 S3湖南永定王家坪顯齒蛇葡萄S13湖北來鳳綠水顯齒蛇葡萄 S4湖南永定沅古坪顯齒蛇葡萄S14湖北來鳳舊司顯齒蛇葡萄 S5湖南永定茅巖河顯齒蛇葡萄S15湖北來鳳芭蕉溪顯齒蛇葡萄 S6湖南永定羅塔坪顯齒蛇葡萄S16湖北來鳳牛耳坪顯齒蛇葡萄 S7湖南永定教字埡顯齒蛇葡萄S17云南廣南者兔顯齒蛇葡萄 S8湖南桑植橋自灣顯齒蛇葡萄S18廣西西林古障顯齒蛇葡萄 S9湖南永順潤雅顯齒蛇葡萄S19湖北來鳳舊司羽葉蛇葡萄 S10湖南雙牌孝層場顯齒蛇葡萄S20湖北來鳳舊司廣東蛇葡萄

2.2 供試品溶液的制備

分別稱取0.1 g樣品于圓底燒瓶，加入10 mL 60%甲醇溶液后稱定質量，超聲45 min，冷卻至室溫，再次稱量，加60%甲醇溶液適量補足質量，過0.45 μm濾膜，4 ℃保存，供試品溶液備用[11]。

2.3 色譜條件

采用Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相為0.01%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～8 min，5%～15% A；8～18 min，15%～24% A；18～25 min，24%～40% A；25～35 min，40%～50% A）；檢測波長：0～15 min，280 nm；15～35 min，360 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 將含沒食子酸、二氫楊梅素、楊梅苷、楊梅素、兒茶素、蘆丁的對照品溶液梯度稀釋，得不同質量濃度的對照品溶液，分別按“2.3”項色譜條件進樣，將對照品溶液的質量濃度與峰面積線性回歸，得回歸方程（表2），6種成分的相關系數（2）均大于0.999，各成分在濃度范圍內線性關系良好。

表2 線性關系數據

Table 2 Linear relationship data

對照品回歸方程線性范圍/(μg·mL?1)R2 沒食子酸Y＝40.196 X－41.2541.40～140.000.999 5 二氫楊梅素Y＝2.041 2 X－56.867104.06～10 406.000.999 9 楊梅苷Y＝19.843 X＋371.9720.34～2 034.000.999 6 楊梅素Y＝33.787 X＋142.8616.20～162.000.999 4 兒茶素Y＝4.740 8 X－1.009 77.80～78.000.999 7 蘆丁Y＝28.98 X－20.2251.26～126.000.999 8

2.4.2 精密度試驗 稱取S2樣品0.1 g，按“2.2”項方法制備供試品溶液，按“2.3”項色譜條件重復進樣6次，記錄各共有峰的保留時間及峰面積，并計算RSD。結果保留時間的RSD為0.53%～1.42%，峰面積的RSD為0.78%～1.92%，儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 取S2樣品0.1 g，按“2.2”項方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h時按“2.3”項色譜條件進樣測定，記錄各共有峰的保留時間及峰面積，并計算RSD。結果相對保留時間的RSD為0.89%～1.73%，相對峰面積RSD為0.61%～1.62%，表明供試品在24 h內穩定。

2.4.4 重復性試驗 稱取同一份S2樣品0.1 g，共6份，按“2.2”項方法制備成6份供試品溶液，按“2.3”項色譜條件進樣，記錄各共有峰的保留時間及峰面積。得出保留時間RSD為0.829%～1.26%，相對峰面積的RSD為2.24%～4.41%，表明方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 稱取5份S2樣品0.1 g，按“2.2”項方法制備樣品液，取500 μL樣品溶液按比例（1∶1）加入相應的對照品溶液，按“2.3”項方法測定，記錄峰面積，并計算各成分的加樣回收率及RSD。沒食子酸、兒茶素、二氫楊梅素、蘆丁、楊梅苷、楊梅素的加樣回收率結果分別為104.22%、102.73%、101.73%、96.48%、101.25%、98.76%，RSD分別為2.5%、0.6%、2.3%、1.0%、0.5%、1.5%，表明本方法的加樣回收率良好。

2.5 指紋圖譜的建立和相似度評價

取20批樣品供試液20 μL按“2.3”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。將S1～S18的色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012A版），以S1圖譜為參照匹配共有峰，時間窗寬度設為0.2 min，生成疊加圖譜，采用中位數法生成對照指紋圖譜[15]。再將對照、S19、S20的圖譜導入，并評價相似度。圖1和圖2分別為對照指紋圖譜及HPLC指紋圖譜，標定出31個共有峰，通過與混合對照品出峰時間相匹配，確認峰4為沒食子酸、峰9為兒茶素、峰11為二氫楊梅素、峰14為蘆丁、峰15為楊梅苷、峰24為楊梅素。峰11保留時間（16.161 min）居中、峰面積大且分離度良好，作為參照峰計算出樣品共有峰相對保留時間RSD＜0.86%，說明樣品共有峰出峰時間穩定；但共有峰相對峰面積RSD為21.47%～117.93%，相差較大，表明S1～S20共有化合物的含量差異較大。樣品與對照指紋圖譜相似度（表3）分別為S1～S16（0.943～0.998），S17、S18（0.869、0.868），S19、S20（0.319、0.389），表明湖南和湖北產顯齒蛇葡萄化學成分種類相似度極高，而廣西、云南產顯齒蛇葡萄與前2個產地有差異，不同種蛇葡萄屬植物化學成分種類差異大。

4-沒食子酸 9-兒茶素 11-二氫楊梅素 14-蘆丁 15-楊梅苷 24-楊梅素

圖2 20批次樣品HPLC指紋圖譜疊加圖

表3 20批樣品與對照圖譜的相似度結果

Table 3 Similarity results of fingerprints of 20 batches of raw material plants and reference atlas samples

編號相似度編號相似度編號相似度編號相似度 S10.996S60.970S110.993S160.994 S20.966S70.943S120.984S170.869 S30.998S80.987S130.995S180.868 S40.986S90.994S140.992S190.319 S50.995 S100.975S150.993S200.389

2.6 化學模式識別研究

2.6.1 聚類分析（cluster analysis analysis，CA）以地域及種類將樣品分組，然后以31個共有峰相對峰面積為變量，運用微生信在線繪圖（http://www.bioinformatics.com.cn），采用組間均聯法，選擇平方Euclideam距離為測度進行系統聚類，繪制聚類熱圖[16]。熱圖顏色代表歸一化后的值，顏色越紅說明共有峰相對峰面積越大，顏色越藍表示共有峰相對峰面積越小。如圖3所示，除S18外，其他樣品被分為2類，S20、S19、S7、S12、S9、S6聚為第I類，其他聚為第II類，每類又分2小類，第Ⅰ類S19、S20單獨聚成1小類，顯示顯齒蛇葡萄與廣東蛇葡萄、羽葉蛇葡萄差異較大，第Ⅱ類中S13、S14、S16聚為1小類，說明湖北產顯齒蛇葡萄與其他產地不同。同時，熱圖顯示廣西顯齒蛇葡萄未知峰17、6、26、23的相對峰面積比其他樣品高，S19、S20的15號峰楊梅苷相對峰面積高于S1～S18，S20未知峰1、2、21相對峰面積高于S1～S18。聚類分析表明，不同產地來源的顯齒蛇葡萄質量與地理差異存在一定相關性，不同種的蛇葡萄屬植物化學成分差異較大。

圖3 不同顯齒蛇葡萄樣品聚類熱圖

2.6.2 主成分分析（principal component analysis，PCA）采用SPSS 22.0系統標準化處理31個共有峰峰面積，對S1～S20指紋圖譜所得的6個共有峰PCA，見表4，以特征值＞1為標準，提取8個主成分（1～8），累積方差貢獻率90.41%（＞80%），可代表所有樣品指紋圖譜共有峰的絕大多數信息。主成分載荷矩陣反映了各變量對主成分的貢獻大小及方向，載荷值越大，對主成分的貢獻越大[17]，由圖4可知，峰29、18、20、25對主成分1貢獻較大，峰11、13、23、24對主成分2貢獻較大，除峰23對第2主成分呈負相關外，其他均呈正相關。依各主成分貢獻率，按公式計算綜合得分值（F）。

表4 特征值和方差貢獻率

Table 4 Characteristic value and variance contribution rate

主成分特征值方差比/%累積貢獻率/% 111.305 9636.4736.47 2 5.102 7216.4652.93 3 3.103 2410.0162.94 4 2.911 98 9.3972.34 5 2.185 28 7.0579.38 6 1.446 59 4.6784.05 7 1.063 90 3.4387.48 8 1.005 05 3.2490.41

圖4 公共因子得分和載荷散點圖

F＝0.364 7 F1＋0.164 6 F2＋0.100 1 F3＋0.093 9 F4＋0.070 5 F5＋0.046 7 F6＋0.034 3 F7＋0.032 4 F8

由表5所知，綜合排名前3為S13、S16、S18，最小是S19。PCA與聚類分析結果基本一致。

2.6.3 正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）以指紋圖譜31個共有峰為變量系數，參照文獻方法[14]將31個共有峰峰面積導入SIMAC 14.1軟件進行OPLS-DA，并繪制散點得分圖（圖5）。S13～S16分布在中線右側，S19、S20在圖的左下角，其結果與PCA結果一致。為尋找藤茶植物的差異標志物，結合OPLS-DA模型中變量重要性投影值（variable importance forthe projection，VIP值）分析，以VIP＞1.0為閾值，從不同地域顯齒蛇葡萄篩選出14個差異標志物（圖6-A），影響程度為峰7＞峰28＞峰24（楊梅素）＞峰26＞峰17＞峰29＞峰9（兒茶素）＞峰11（二氫楊梅素）＞峰31＞峰13＞峰22＞峰5＞峰16＞峰23。圖6-B顯示近緣植物羽葉蛇葡萄、廣東蛇葡萄、顯齒蛇葡萄有13個差異標志物，影響程度為峰18＞峰17＞峰29＞峰1＞峰13＞峰31＞峰11（二氫楊梅素）＞峰10＞峰27＞峰24（楊梅素）＞峰5＞峰6＞峰28。差異標志物數量見表6，顯齒蛇葡萄12～17個，3種蛇葡萄屬植物11～13個，為進一步確認差異標志物，通過計算各共有峰峰面積占總共有峰峰面積的占比以及各共有峰峰面積的RSD值，可知楊梅素（峰24）與二氫楊梅素（峰11）占共有峰峰面積比率大且RSD值偏高，說明二氫楊梅素和楊梅素是影響顯齒蛇葡萄產地差異的主要因素，也是區別其他藤茶原料的主要指標。

表5 主成分得分和綜合排名

Table 5 Principal component score and comprehensive score

編號主成分得分排名 F1F2F3F4F5F6F7F8F S13 1.156 0.952 1.234 2.046?0.275?1.119 0.332?0.957 0.803 1 S16 0.866 0.975 1.063 0.332 0.509?0.023?0.099 1.728 0.701 2 S18 2.370?1.988?0.104?1.155 2.313?0.220 1.104 0.033 0.610 3 S14 0.909 0.955?0.752 0.870?0.056?0.172?0.924?0.326 0.441 4 S15 0.602 0.158 0.790?0.081?0.364 0.254 0.427?0.412 0.304 5 S10 0.706?0.349 0.318 0.534?0.902 0.603?0.867?0.464 0.202 6 S11 0.596?0.187?0.683 0.106?0.100 2.287?1.260?0.556 0.167 7 S7?0.305?0.287 2.459 0.165?0.328?0.050?0.460 0.096 0.065 8 S5?0.008 0.603?0.577 0.015?0.361?0.344 0.284 1.242 0.048 9 S1 0.093 0.587?2.406 0.931 0.955 0.444?0.585 0.045 0.04710 S3 0.199 0.452?1.030 0.177?0.302?0.828 0.005 0.845 0.02811 S12?0.505 0.827 0.861?1.304 0.576 0.387?0.466 1.546 0.00912 對照 0.030?0.001 0.091?0.329?0.686?0.044?0.095?0.043?0.06613 S4?0.455 0.154?0.132?0.498?0.415 1.479 0.065?0.161?0.16414 S9?1.148 1.545 0.089?0.580 1.809?0.810 0.857?2.609?0.17515 S8 0.111?0.777 0.263?1.311?0.927 0.931 0.663?0.726?0.20716 S2?0.550 0.577?0.851?0.705?0.685?1.006 1.787 1.348?0.24717 S6?1.511 0.587 0.068?1.095?0.142 0.688 0.003?0.450?0.54318 S20?1.696?1.800?0.027 2.449 0.198 0.921 1.995 0.357?0.55119 S17 0.217?1.357?0.862?0.740?2.162?1.914?0.326?0.970?0.58420 S19?1.677?1.626 0.186 0.174 1.345?1.465?2.443 0.432?0.88721

圖5 OPLS-DA 得分散點圖(A) 和OPLS-DA置換檢驗圖 (B)

圖6 S1～S18樣品（A）和S19～S20、對照（B）各共有峰的VIP圖

表6 不同樣品的差異標志物

Table 6 Differential markers of different samples

樣品差異代謝物共有峰號總數/個 顯齒蛇葡萄（湖南-湖北）27、29、28、4、3、17、31、16、30、5、7、25、18、2014 顯齒蛇葡萄（湖南-云南）24、9、13、1、11、23、3、4、31、14、2、2212 顯齒蛇葡萄（湖南-廣西）26、17、23、27、29、16、7、11、6、20、31、5、10、18、28、24、2517 顯齒蛇葡萄（湖北-云南）24、9、1、3、4、13、2、11、8、14、19、2312 顯齒蛇葡萄（湖北-廣西）26、7、28、23、11、24、9、10、13、17、2、6、14、3014 顯齒蛇葡萄（云南-廣西）26、7、1、6、4、24、13、19、27、8、9、28、2913 顯齒蛇葡萄-羽葉蛇葡萄18、29、13、31、11、27、5、28、22、24、25、15、2013 顯齒蛇葡萄-廣東蛇葡萄13、17、24、28、11、27、6、25、1、16 、18、31、2613 羽葉蛇葡萄-廣東蛇葡萄18、29、1、31、17、10、5、6、2、22、1111

2.7 不同產地顯齒蛇葡萄及近緣種植物中酚類成分的測定

取20批樣品粉末各適量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品中6種待測成分的含量，平行操作3次，結果見表7。20批樣品中6種成分含量熱圖見圖7。二氫楊梅素和楊梅素在顯齒蛇葡萄含量較高，但楊梅苷含量最低。就各地區顯齒蛇葡萄上述成分含量差異明顯，原產地張家界羅塔坪樣品中二氫楊梅素含量最高。羽葉蛇葡萄與廣東蛇葡萄中楊梅苷含量明顯高于顯齒蛇葡萄，說明楊梅苷可作為廣東蛇葡萄、羽葉蛇葡萄質量評價的主要指標成分。

3 討論

目前，關于藤茶的質量標準是以二氫楊梅素含量作為藤茶質量判定標準，但中藥化學成分復雜多樣，有效成分難以一一明確，因此，如何在化學成分不完全明確的前提下對藥材進行質量控制十分有必要。而指紋圖譜技術與相似度、聚類、主成分分析等化學計量學手段可以用于綜合評價中藥質量優劣，避免了以單一成分含量來評價藥品質量好壞的弊端。多酚類化合物抗氧化、抗病毒、抗心腦血管疾病、抗腫瘤等生物活性顯著，類黃酮是多酚類化合物的典型代表，二氫楊梅素、楊梅素、楊梅苷為3種藤茶植物嫩莖葉的主要化學成分[13]，兒茶素是詮釋茶葉保健功能的主要物質基礎，具有抗菌、抗突變、抗癌和保護神經系統等功效[18]，兒茶素在藤茶茶多酚中占60%～80%[19]，沒食子酸是一種富含于藤茶植物中的多酚類化合物，具有抗癌等多種生物活性[20]。因此，選用上述成分作為質量評價的主要指標。本研究基于HPLC指紋圖譜技術，得到31個共有峰，指認其中6個共有成分，與已報道的顯齒蛇葡萄（藤茶）指紋圖譜的文獻相比[9,21]，本研究得到的共有峰更多，且指認出的成分不僅為黃酮成分，并通過相似度分析初步評價了20批不同樣品的相似性。同時，本研究利用PCA和OPLS-DA等化學模式識別分析技術評價了不同藤茶原料植物間的質量差異，初步篩選出了不同產地顯齒蛇葡萄及其近緣種的差異性標志物。此外，研究發現羽葉蛇葡萄與廣東蛇葡萄中楊梅苷含量明顯高于顯齒蛇葡萄。因此，該研究可為顯齒蛇葡萄、羽葉蛇葡萄與廣東蛇葡萄的藥材質量標準的建立提供科學依據，并為藤茶植物綜合開發提供技術參考。

表7 20批樣品6種酚類活性成分含量

Table7 Content of six polyphenol active components in 20 batch of samples

編號二氫楊梅素/%楊梅素/%楊梅苷/%蘆丁/%兒茶素/%沒食子酸/% S129.014 91.040 71.031 90.824 40.308 50.041 7 S233.137 01.907 91.138 30.340 10.255 40.051 6 S329.971 31.068 01.000 00.371 30.275 90.075 8 S428.204 20.603 60.741 50.584 70.160 00.077 1 S531.027 9 1.117 9 1.133 00.563 6 0.310 8 0.098 8 S635.731 10.579 71.060 10.475 20.237 40.089 4 S714.867 90.425 81.058 20.312 50.072 10.167 0 S814.874 20.361 30.433 60.312 60.085 80.094 9 S935.420 01.120 60.910 30.492 90.264 50.102 4 S1013.894 00.430 70.686 00.466 50.102 80.116 2 S1121.193 50.573 40.681 10.733 80.093 00.079 3 S1233.411 01.627 91.113 20.417 10.058 60.161 8 S1325.795 70.893 50.684 10.460 50.290 90.152 5 S1429.793 71.173 70.662 80.496 50.289 70.104 4 S1523.744 80.627 90.639 50.312 10.225 70.140 3 S1634.809 61.146 90.753 80.456 90.175 10.146 0 S17 6.179 60.049 10.357 00.148 70.026 30.029 5 S18 7.773 40.295 90.513 60.222 20.077 30.116 7 S19 1.313 10.105 54.139 50.407 10.069 80.106 5 S20 3.194 60.050 52.761 00.736 30.101 00.065 6

圖7 20批樣品6種成分含量熱圖

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國科學院植物研究所. 中國高等植物圖鑒（第二冊: 補編） [M]. 北京: 科學出版社, 1983: 246-272.

[2] 張云坤, 李娟, 黃丹, 等. 中藥藤茶化學成分及抗感染作用研究進展 [J]. 世界科學技術—中醫藥現代化, 2021, 23(6): 2012-2022.

[3] Carneiro R C V, Ye L Y, Baek N,. Vine tea (): A review of chemical composition, functional properties, and potential food applications [J]., 2021, 76: 104317.

[4] Zhang Q L, Zhao Y F, Zhang M Y,. Recent advances in research on vine tea, a potential and functional herbal tea with dihydromyricetin and myricetin as major bioactive compounds [J]., 2021, 11(5): 555-563.

[5] 劉暢, 鄧薇, 劉小英, 等. 藤茶生物活性成分及其制備工藝研究進展 [J]. 食品工業, 2015, 36(4): 233-237.

[6] 熊皓平, 何國慶, 楊偉麗, 等. 顯齒蛇葡萄生化成分分析 [J]. 中國食品學報, 2004, 4(3): 68-71.

[7] You G J, Li H H, Liu Y N,. Comparative analyses ofwith different appearance traits and from different geographical origins using HPLC fingerprints and chemossmetrics [J]., 2020, 83(12): 1443-1451.

[8] Bai J, Yue P, Dong Q,. Identification of geographical origins ofbased on HPLC multi-wavelength fusion profiling combined with average linear quantitative fingerprint method [J]., 2021, 11(1): 5126.

[9] 范莉, 侯小龍, 王文清, 等. 指紋圖譜結合一測多評模式在藤茶質量評價中的應用研究 [J]. 中草藥, 2016, 47(22): 4076-4081.

[10] 蘇素嬌, 李娜, 陳亮, 等. 藤茶的HPLC指紋圖譜及化學模式識別研究 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2013, 19(22): 144-147.

[11] 石依姍. 特色民族藥材藤茶質量評價及其袋泡茶工藝研究[D]. 武漢: 華中科技大學, 2020.

[12] 張朝陽, 馬世龍, 秦邦, 等. 野生藤茶資源的鑒別及指紋圖譜評價 [J]. 山東農業大學學報: 自然科學版, 2022, 53(2): 188-196.

[13] 吳佳, 葉文卉, 盧宗元, 等. 藤茶不同部位指紋圖譜及其差異研究 [J]. 天然產物研究與開發, 2020, 32(9): 1507-1514.

[14] 劉翔, 李紫微, 秦松云. 重慶蛇葡萄屬藥用植物資源研究 [J]. 資源開發與市場, 2007, 23(6): 517-518.

[15] 周冰倩, 高喜梅, 楊穎, 等. 不同來源竹茹藥材HPLC指紋圖譜和化學計量學分析 [J]. 中草藥, 2022, 53(3): 853-857.

[16] 張琳琳, 張文婷, 唐登峰, 等. 基于指紋圖譜、多指標含量測定及化學計量學的寧心寶膠囊質量評價 [J]. 中國藥學雜志, 2019, 54(17): 1425-1431.

[17] 謝蘇夢, 季巧遇, 呂尚, 等. 不同產地野菊花HPLC指紋圖譜建立及化學模式識別研究 [J]. 中草藥, 2021, 52(24): 7616-7623.

[18] Musial C, Kuban-Jankowska A, Gorska-Ponikowska M. Beneficial properties of green tea catechins [J]., 2020, 21(5): 1744.

[19] 李佳川, 李思穎, 王優, 等. 藤茶化學成分、藥理作用及質量標志物(Q-marker)預測分析 [J]. 西南民族大學學報: 自然科學版, 2021, 47(3): 254-266.

[20] Tuli H S, Mistry H, Kaur G,. Gallic acid: A dietary polyphenol that exhibits anti-neoplastic activities by modulating multiple oncogenic targets [J]., 2022, 22(3): 499-514.

[21] 汪秋蘭, 王文清, 萬青, 等. 基于HPLC-PDA指紋圖譜、化學模式識別及多成分定量分析評價藤茶藥材的質量 [J]. 中國藥師, 2021, 24(8): 558-565.

HPLC fingerprint and chemical pattern recognition offrom different producing areas

LING Wei-hong1, CHEN Yan2, FENG Miao1, WANG Chao-chun1,GONG Hui-min3, TIAN Chun-lian1,3,4

1. Hunan Key Laboratory of Forest Products and Chemical Industry Engineering, Jishou University, Zhangjiajie 427000, China 2. Zhangjiajie Yongding County Agricultural and Rural Bureau, Zhangjiajie427000, China 3. College of Biology and Environmental Sciences, Jishou University, Jishou 416000, China 4. National and Local United Engineering Laboratory of Integrative Utilization Technology of, Jishou University, Jishou 416000, China

To establish the HPLC fingerprint of Xianchi Sheputao () and perform chemical pattern recognition.The gradient elution was carried out on an Ultimate XB-C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) with a mobile phase of acetonitrile-0.01% phosphoric acid, detection at 280 nm and 360 nm, a volume flow rate of 1 mL/min, an injection volume of 20 μL and a column temperature of 30 ℃. HPLC fingerprints ofand closely related species was established and a combination of chemical pattern recognition methods such as similarity evaluation, cluster analysis (CA), principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA), were used to evaluate the quality ofand closely related species from different producing areas.The HPLC fingerprint method was developed in accordance with the methodological requirements, with 31 common peaks from 18 batches ofThe peaks 4, 9, 11, 14, 15 and 24 were qualitatively identified as gallic acid, catechin, dihydromyricetin, rutin, myricetrin andmyricetin , respectively, and the similarity was more than 0.8. The samples were divided into two categories according to different origins through CA and the results of PCA were consistent with it. Moreover, thirteen to fourteen markers of variation were identified in OPLS-DA, with dihydromyricetin and myricetin as the main markers of variation in the different origins ofand closely related species.The established fingerprint method is stable, reliable and reproducible; Combined with chemical pattern recognition, it can be used for the quality evaluation ofgenus as raw material plant of vine tea.

vine tea;(Hand.-Mazz.) W. T; HPLC fingerprint; chemical pattern recognition; orthogonal partial least squares-discriminant analysis; gallic acid; catechin; dihydromyricetin; rutin; myricetrin; myricetin

R286.2

A

0253 - 2670(2023)17 - 5725 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.17.025

2023-02-03

湖南省科技廳資助項目（2019NK4164）；林產化工工程湖南省重點實驗室開放基金（LCHG21908）

凌偉紅（1997—），女，碩士研究生，從事天然產物研發及藥物質量控制研究。Tel: 15580542151 E-mail: 1455426685@qq.com

田春蓮，教授，碩士生導師，主要從事中藥、民族藥質量控制及新藥研發工作。E-mail: tianchunlian1970@163.com

[責任編輯 時圣明]