注射用益氣復(fù)脈（凍干）對(duì)慢性心力衰竭大鼠的藥效和作用機(jī)制研究

翟 優(yōu)，吳明明，鄧林華，高 丹，張積思，張 元，劉思遠(yuǎn)，梅雨航，王振亮，趙英強(qiáng)*

注射用益氣復(fù)脈（凍干）對(duì)慢性心力衰竭大鼠的藥效和作用機(jī)制研究

翟 優(yōu)1，吳明明1，鄧林華2，高 丹3，張積思1，張 元1，劉思遠(yuǎn)4，梅雨航5，王振亮1，趙英強(qiáng)3*

1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700 3. 天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300150 4. 北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京 100700 5. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110847

探究注射用益氣復(fù)脈（凍干）在改善心梗后所致慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）大鼠的作用及機(jī)制。將冠狀動(dòng)脈左前降支手術(shù)結(jié)扎造模成功后的75只SD大鼠隨機(jī)分為模型組，益氣復(fù)脈低、高劑量（464.3、928.6 mg/kg）組，卡托普利（3.35 mg/kg）組和益氣復(fù)脈（464.3 mg/kg）＋卡托普利（3.35 mg/kg）組，另取15只僅切口縫合但不結(jié)扎的SD大鼠作為假手術(shù)組。給予藥物干預(yù)2周后，用小動(dòng)物超聲診斷儀檢測(cè)大鼠心功能；采用ELISA試劑盒檢測(cè)各組大鼠血清中心鈉肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）、內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）、心肌肌鈣蛋白（cardiac troponin，cTn）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）含量和肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力；采用蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察各組大鼠心臟組織病理變化；采用Western blotting檢測(cè)各組大鼠心臟中能量代謝相關(guān)蛋白表達(dá)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心功能指標(biāo)左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、二尖瓣血流頻譜E峰/A峰（E/A）和左室短軸縮短率（LVFS）均明顯下降（＜0.001），血清中ANP、BNP、cTn、ET-1、IL-6、TNF-α水平和CK、CK-MB活力均顯著升高（＜0.001），SOD活性和ATP水平顯著下降（＜0.001），左心室組織出現(xiàn)心肌纖維斷裂及心肌細(xì)胞變性、壞死等病理改變，心臟中磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、p-AMPK、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4（glucose transporter-4，GLUT-4）和肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1（carnitine palmitoyltransferase-1，CPT-1）蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）。與模型組比較，各給藥組LVEF、E/A和LVFS均顯著提高（＜0.05、0.01、0.001），血清中ANP、BNP、cTn、ET-1、IL-6、TNF-α水平和CK-MB、CK活力均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），ATP水平和SOD活力顯著升高（＜0.01、0.001），大鼠心肌損傷得到明顯改善，心臟中p-AMPK、AMPK、GLUT-4和CPT-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01、0.001）。益氣復(fù)脈可以通過(guò)提高CHF大鼠的射血分?jǐn)?shù)和舒縮功能改善心功能，通過(guò)降低大鼠血清心肌損傷、氧化應(yīng)激水平并改善能量代謝，從而改善CHF大鼠心衰癥狀，改善能量代謝可能是其重要的作用機(jī)制之一。

注射用益氣復(fù)脈（凍干）；慢性心力衰竭；心功能；氧化應(yīng)激；炎癥；能量代謝

心力衰竭簡(jiǎn)稱心衰，是一種心臟結(jié)構(gòu)或功能性疾病導(dǎo)致的心室充盈或射血能力受損的復(fù)雜臨床綜合征，也是大多數(shù)心血管疾病如高血壓性心臟病、擴(kuò)張性心肌病、急性心肌梗死、先天性心臟病和肺心病等的終末期階段和導(dǎo)致死亡的主要原因[1]。常見的心衰動(dòng)物模型有大鼠、豚鼠、家兔、犬、小型豬和斑馬魚等，而大小鼠是最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[2-3]；在眾多心衰動(dòng)物模型中，大鼠因其易操作、價(jià)格實(shí)惠，且心臟結(jié)構(gòu)更趨向于人類，也是更接近人類的研究對(duì)象。大鼠慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）造模方式主要有壓力負(fù)荷型（腹主動(dòng)脈縮窄法、肺動(dòng)脈高壓法、鹽負(fù)荷法），心肌缺血型（冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法）和心臟抑制型（阿霉素法、異丙腎上腺素法）[3]。其中冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法制作的模型由于更接近人類充血性心衰的病理生理演變過(guò)程而被較多的研究者采納。前期通過(guò)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支造成急性心梗，經(jīng)過(guò)5～8周的心臟代償性適應(yīng)，急性心梗逐漸演變到心衰[4-5]。

生脈散出自張?jiān)氐摹夺t(yī)學(xué)啟源》，由人參、麥冬、五味子3味藥組成，目前生脈散的現(xiàn)代制劑主要有口服藥、注射劑和凍干粉針劑型，主要代表產(chǎn)品有生脈飲、生脈注射劑和注射用益氣復(fù)脈（凍干）。其中益氣復(fù)脈組方為紅參、麥冬、五味子，益氣復(fù)脈、養(yǎng)陰生津[6]，用于冠心病勞累性心絞痛氣陰兩虛證，癥見胸痹心痛、心悸氣短和冠心病所致慢性左心功能不全I(xiàn)I、III級(jí)氣陰兩虛證等[7]。中醫(yī)認(rèn)為氣血津液是維持人體生命活動(dòng)的基本物質(zhì)，心氣虛會(huì)導(dǎo)致多種生理機(jī)能下降，也是心衰的最基本病機(jī)[8]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為心衰時(shí)，存在能量代謝障礙；同時(shí)炎癥因子如C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6等均明顯升高，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和發(fā)生，造成心肌重塑的惡性循環(huán)，加速心衰的發(fā)展進(jìn)程[9]。CHF在疾病的不同階段其中醫(yī)證型分布也不同，陽(yáng)虛水泛證、痰飲阻肺證主要出現(xiàn)在急性加重期，慢性穩(wěn)定期以氣虛血瘀證、心肺氣虛證和氣陰兩虛血瘀證為主[10-11]。代謝組學(xué)研究表明，氣陰兩虛證患者苯丙氨酸、甘氨酸、高絲氨酸、葡萄糖、磷酸肌酸含量較低，因此CHF的治療可能通過(guò)調(diào)節(jié)能量代謝、脂代謝、氨基酸代謝等多條途徑發(fā)揮作用[12-13]。本研究通過(guò)構(gòu)建經(jīng)典的冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎所致的CHF大鼠探討益氣復(fù)脈對(duì)心功能的改善作用，并從能量代謝角度探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠130只，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2021-0011。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵從天士力實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理及福利倫理委員會(huì)）批準(zhǔn)通過(guò)后執(zhí)行（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理號(hào)為TSL-IACUC-2023-19）。實(shí)驗(yàn)開始前，所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)環(huán)境為SPF級(jí)，實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食飲水，隔日更換墊料1次。

1.2 藥品與試劑

注射用益氣復(fù)脈（凍干，批號(hào)20201205，有效期30個(gè)月，每瓶裝0.65 g）由天津天士力之驕藥業(yè)有限公司提供；卡托普利片（批號(hào)22101912）購(gòu)自常州制藥廠有限公司；0.9%氯化鈉注射液（批號(hào)2001153204）購(gòu)自石家莊四藥有限公司；注射用青霉素鈉（批號(hào)10122004073）購(gòu)自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司；異氟烷（批號(hào)045742）購(gòu)自EZVET公司；甲醛（批號(hào)F809702）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；無(wú)水乙醇（批號(hào)220221）購(gòu)自天津市康科德科技有限公司；二甲苯（批號(hào)20200508）購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色液（批號(hào)210420）購(gòu)自廈門邁威生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、心鈉肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）、心肌肌鈣蛋白（cardiac troponin，cTn）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB）、內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）、IL-6、TNF-α、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）ELISA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)均為20230310）購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；裂解液、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE上樣緩沖液、Marker、ECL超敏發(fā)光試劑盒（批號(hào)分別為P0013B、P0012AC、P0010、P0015L、P0068、P0018AM）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PVDF膜（批號(hào)IPVH00010）購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)A0208）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、p-AMPK、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1（carnitine palmitoyltransferase-1，CPT-1）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4（glucose transporter-4，GLUT-4）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子-1α（peroxisome proliferator activated receptor coactivator-1α，PGC-1α）抗體（批號(hào)ab32047、ab92701、ab189182、ab188317、ab188102）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3 儀器

T1000型電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）；ST16R型高速冷凍離心機(jī)、902-ULTS型?80 ℃低溫冰箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；小動(dòng)物超聲診斷儀（百盛Saote公司）；Tecan Infinite M200型多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；VEM型小動(dòng)物麻醉機(jī)（上海贊徳醫(yī)療器械有限公司）；ASP300S型全自動(dòng)脫水機(jī)、RM2235型切片機(jī)、EG1150型包埋機(jī)、HI1220型烘片機(jī)、HI1210型展片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；ECLIPSE Ni-U型生物顯微鏡（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 CHF大鼠模型的制備

將115只SD大鼠通過(guò)小動(dòng)物麻醉機(jī)用異氟烷麻醉，仰臥位固定在手術(shù)板上，大鼠胸部左側(cè)2～5肋處剃毛，碘伏消毒后，用手術(shù)剪在3～4肋處剪開皮層，逐層鈍性分離肌肉層，暴露出肋骨后，在心臟跳動(dòng)最明顯的肋間隙間，快速擠出心臟，在左心耳根部下方進(jìn)行結(jié)扎。結(jié)扎后將心臟送回胸腔內(nèi)，擠出空氣，用止血鉗夾住剪開的兩側(cè)皮層，觀察大鼠呼吸恢復(fù)，進(jìn)行縫合（為避免氣胸的形成，擠心臟和結(jié)扎心臟冠狀動(dòng)脈左前降支的時(shí)間應(yīng)盡可能短）。縫合結(jié)束后，用碘伏擦拭縫合處，觀察5～10 min。待大鼠恢復(fù)意識(shí)后，即可進(jìn)食進(jìn)水，放回飼養(yǎng)室正常飼養(yǎng)。所有大鼠于術(shù)后連續(xù)3 d腿部im青霉素鈉。另取15只大鼠作為假手術(shù)組，只進(jìn)行切口和縫合，不進(jìn)行結(jié)扎。

2.2 分組及給藥

術(shù)后6周將造模成功后存活的81只大鼠檢測(cè)心功能，計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF），將LVEF≤40%作為CHF模型成功的標(biāo)志。將符合標(biāo)準(zhǔn)的75只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組，益氣復(fù)脈低、高劑量（464.3、928.6 mg/kg，分別相當(dāng)于臨床劑量的1、2倍）組，卡托普利（3.35 mg/kg）組和益氣復(fù)脈（464.3 mg/kg）＋卡托普利（3.35 mg/kg）組，每組15只。益氣復(fù)脈組尾iv益氣復(fù)脈并ig 0.9%氯化鈉注射液，卡托普利組ig卡托普利片（以0.9%氯化鈉注射液配制成0.67 mg/mL的溶液）并iv 0.9%氯化鈉注射液，假手術(shù)組和模型組尾iv并ig等體積0.9%氯化鈉注射液（5 mL/kg），連續(xù)給藥14 d。

2.3 指標(biāo)觀察

2.3.1 大鼠一般情況觀察 給藥期間認(rèn)真觀察動(dòng)物的一般情況，包括大鼠的外觀、毛發(fā)、行為活動(dòng)、攝食情況、反應(yīng)力及精神狀態(tài)，每周記錄大鼠體質(zhì)量2次，末次給藥前稱定質(zhì)量。

2.3.2 心功能檢測(cè) 給藥14 d后用超聲診斷儀檢測(cè)大鼠心功能變化，評(píng)估心臟功能。記錄測(cè)量的心臟彩超重要參數(shù)，如左室舒張末期直徑（LVIDd）、左室收縮末期直徑（LVIDs）、左室收縮末容積（LVESV）、左室短軸縮短率（LVFS）、E峰（舒張?jiān)缙谛氖页溆俣茸畲笾担?、A峰（舒張晚期心室充盈速度最大值）等心動(dòng)參數(shù)。

LVEF＝(舒張期心室容積－收縮期心室容積)/舒張期心室容積

LVFS＝(舒張期心室內(nèi)徑－收縮期心室內(nèi)徑)/舒張期心室內(nèi)徑

2.3.3 血清生化指標(biāo) 心功能檢測(cè)結(jié)束后，每組取10只大鼠，采用小動(dòng)物麻醉機(jī)以異氟烷麻醉，腹主動(dòng)脈取血6～8 mL，3000 r/min離心10 min，取上清，于?80 ℃保存。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書分別檢測(cè)ANP、BNP、CK、CK-MB、ET-1、cTn、IL-6、TNF-α、SOD和ATP的含量。

2.3.4 心臟指數(shù)的測(cè)定 取血后快速開胸取心臟，用濾紙擦拭多余的殘血，稱定全心濕質(zhì)量，計(jì)算心臟指數(shù)，并用游標(biāo)卡尺快速測(cè)量大鼠自然狀態(tài)下心臟橫向長(zhǎng)度。每組快速取6只大鼠的心臟剪取心臟左心室，稱定質(zhì)量，以左心室質(zhì)量與全心質(zhì)量之比為左心室指數(shù)，快速用錫箔紙包好，用液氮快速冷凍固定后，置于?80 ℃冰箱中保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3.5 大鼠心臟HE染色 每組取4只大鼠的完整心臟，用生理鹽沖洗3次后放入10%的甲醛溶液進(jìn)行固定，固定1周后切取心臟中段4～5 mm厚度，進(jìn)行心臟組織脫水、包埋、切片和HE染色，封片并在顯微鏡下進(jìn)行大鼠心臟病理觀察。

2.3.6 Western blotting檢測(cè)心肌組織相關(guān)蛋白表達(dá) 取假手術(shù)組、模型組和益氣復(fù)脈低劑量組剩余5只大鼠心臟，去除左心室外的其余部分，加入裂解液裂解組織，高速離心后取上清液，采用BCA試劑盒定量蛋白濃度，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，分別孵育一抗、二抗，顯影，經(jīng)凝膠成像儀曝光后分析條帶灰度。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 益氣復(fù)脈對(duì)CHF大鼠生存狀況、心臟指數(shù)及左心室指數(shù)的影響

假手術(shù)組大鼠皮毛始終有光澤，攝食正常，心動(dòng)敏捷，精神狀態(tài)良好；造模后的大鼠漸漸有皮毛枯槁、活動(dòng)量減少、行動(dòng)遲緩等現(xiàn)象；給藥后大鼠毛色逐漸有光澤，行動(dòng)逐漸敏捷，說(shuō)明益氣復(fù)脈具有較好的改善CHF大鼠生存質(zhì)量的作用。

如表1所示，與假手術(shù)組比較，造模后的大鼠體質(zhì)量減輕，增長(zhǎng)緩慢；與模型組比較，各給藥組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)稍加快，但無(wú)顯著性差異。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心臟橫向長(zhǎng)度偏大，心臟指數(shù)和左心室指數(shù)明顯增加（＜0.01），說(shuō)明CHF模型造模成功，大鼠心臟已發(fā)生心室重構(gòu)；與模型組比較，各給藥組心臟指數(shù)和左心室指數(shù)均明顯減?。ǎ?.05），心臟橫向長(zhǎng)度縮短，說(shuō)明益氣復(fù)脈具有較好的改善心室重構(gòu)的作用。

3.2 益氣復(fù)脈對(duì)CHF大鼠心功能的影響

LVFS和LVEF是評(píng)價(jià)心功能的重要黃金指標(biāo)。如表2所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠E/A值、LVEF和LVFS均顯著降低（＜0.001），而LVIDd、LVIDs和LVESV均顯著升高（＜0.001），說(shuō)明模型組大鼠存在嚴(yán)重的心臟功能障礙；與模型組比較，給藥后，各給藥組E/A值、LVEF和LVFS均顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），LVIDs和LVESV均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），說(shuō)明益氣復(fù)脈可以顯著改善CHF大鼠的心功能，改善心臟的收縮和舒張功能。

表1 益氣復(fù)脈對(duì)CHF大鼠體質(zhì)量、心臟指數(shù)和左心室指數(shù)的影響(, n = 6～10)

與假手術(shù)組比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01###＜0.001，下表同

*< 0.05**< 0.01***< 0.001sham group;#< 0.05##< 0.01###< 0.001model group, same as below tables

表2 益氣復(fù)脈對(duì)CHF大鼠心功能的影響(, n = 6)

3.3 益氣復(fù)脈對(duì)CHF大鼠血清生化指標(biāo)的影響

ANP、BNP是反映心臟心衰程度的經(jīng)典標(biāo)志物，其含量可直接反映心衰的嚴(yán)重程度；cTn和ET-1是反映機(jī)體心功能的指標(biāo)。如表3所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中ANP、BNP、cTn和ET-1水平均顯著升高（＜0.001），ATP含量顯著降低（＜0.001）；與模型組比較，給藥組ANP、BNP、cTn和ET-1含量均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），益氣復(fù)脈各劑量組和聯(lián)合給藥組ATP含量顯著升高（＜0.001），說(shuō)明益氣復(fù)脈可以在一定程度上改善CHF大鼠心功能，提高心臟供能。

TNF-α和IL-6是典型的炎癥因子，如表4所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中TNF-α和IL-6水平均顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中TNF-α和IL-6水平均顯著降低（＜0.001），說(shuō)明益氣復(fù)脈有助于改善CHF大鼠的炎癥。

心肌細(xì)胞中CK和CK-MB的滲漏導(dǎo)致其在血清中濃度升高，可以反映心肌損傷的程度。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中CK-MB和CK活性均顯著升高（＜0.001），說(shuō)明CHF大鼠心肌細(xì)胞大量壞死，導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)CK-MB和CK大量進(jìn)入血液循壞系統(tǒng)。與模型組比較，各給藥組血清中CK-MB和CK活性均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），說(shuō)明益氣復(fù)脈可以減少CHF大鼠心肌細(xì)胞的壞死（表4）。

表3 益氣復(fù)脈對(duì)CHF大鼠血清中ANP、BNP、cTn、ET-1和ATP含量的影響(, n = 10)

表4 益氣復(fù)脈對(duì)CHF大鼠血清中TNF-α、IL-6水平和CK、CK-MB、SOD活力的影響(, n = 10)

SOD活力的增加代表著機(jī)體抗氧化能力的恢復(fù)，與假手術(shù)組比較，模型組血清SOD活力顯著降低（＜0.001）；與模型組比較，益氣復(fù)脈各劑量組和聯(lián)合給藥組SOD活力顯著升高（＜0.01、0.001），說(shuō)明益氣復(fù)脈有助于促進(jìn)機(jī)體的抗氧化能力（表4）。

3.4 益氣復(fù)脈對(duì)CHF大鼠心臟病理變化的影響

如圖1所示，假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，無(wú)明顯的病理變化；與假手術(shù)組比較，模型組的心肌細(xì)胞纖維排列紊亂，心肌細(xì)胞溶解并伴有出血現(xiàn)象；給予益氣復(fù)脈和卡托普利后，心肌細(xì)胞溶解現(xiàn)象和出血現(xiàn)象較少，說(shuō)明益氣復(fù)脈對(duì)于心肌細(xì)胞損傷具有一定的改善作用。如表5所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠病理評(píng)分明顯增加（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠病理評(píng)分均顯著降低（＜0.05、0.01），說(shuō)明益氣復(fù)脈可以改善CHF大鼠心肌細(xì)胞病理變化。

圖1 益氣復(fù)脈對(duì)CHF大鼠心臟病理變化的影響(HE, ×100)

表5 各組大鼠心臟病理評(píng)分(, n = 4)

3.5 益氣復(fù)脈對(duì)CHF大鼠心臟中能量代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖2所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心臟中p-AMPK、AMPK、GLUT-4和CPT-1蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），PGC-1α蛋白表達(dá)呈降低趨勢(shì)；與模型組比較，益氣復(fù)脈低劑量組p-AMPK、AMPK、GLUT-4和CPT-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），PGC-1α蛋白表達(dá)呈升高趨勢(shì)。

與假手術(shù)組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001

4 討論

心衰的發(fā)生與能量代謝、心室重構(gòu)引起血液動(dòng)力學(xué)障礙、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、細(xì)胞內(nèi)鈣離子循環(huán)障礙、氧化應(yīng)激、內(nèi)皮功能障礙、炎癥、雌激素匱乏等有關(guān)，這些因素均是相互影響和交叉存在的[14]。ANP和BNP為心力衰竭的黃金指標(biāo)。為了適應(yīng)病理性變化，機(jī)體啟動(dòng)自我調(diào)節(jié)機(jī)制，增加ANP和BNP的釋放，使血管擴(kuò)張，緩解心臟負(fù)荷，從而改善心衰的癥狀，因此ANP和BNP水平的高低與心衰程度呈正相關(guān)[15]。早在1956年就有學(xué)者證實(shí)在心衰患者中炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6和IL-1β水平較正常人升高4倍，說(shuō)明炎癥在CHF中的病理生理過(guò)程具有重要作用[16]。SOD可反映機(jī)體的抗氧化能力。CHF時(shí)心肌細(xì)胞發(fā)生壞死，導(dǎo)致CK和CK-MB在血清中濃度升高，因此CK和CK-MB在一定程度上可以反映心肌細(xì)胞損傷的程度[17]。在本研究中，益氣復(fù)脈低、高劑量組和與卡托普利聯(lián)合使用均可降低心衰標(biāo)志物ANP、BNP的含量，降低炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平，降低CK和CK-MB活性，提高心肌組織抗氧化能力，從而提高心功能，改善CHF。

為滿足氧化代謝和ATP的需要，人體的心臟是攝氧量最高的器官，同時(shí)也是耗能最高的器官[18]。為維持心臟舒縮功能和心肌細(xì)胞內(nèi)的離子穩(wěn)定，需要豐富且充足的能量供應(yīng)。正常心臟中，約80%的ATP來(lái)源于脂肪酸β氧化，其余的20%來(lái)自葡萄糖的氧化；而葡萄糖代謝涉及糖酵解與葡萄糖氧化，糖酵解過(guò)程發(fā)生在線粒體外的細(xì)胞質(zhì)中，產(chǎn)能效率低，所產(chǎn)生的ATP占整個(gè)心臟不足10%[19-20]。雖然脂肪酸氧化能產(chǎn)生大量的ATP，但在產(chǎn)生等量的ATP時(shí)，脂肪酸耗氧量比碳水化合物多約10%。但在CHF時(shí)，心肌存在缺血缺氧和耗氧量增加的現(xiàn)象，能量代謝障礙產(chǎn)生，此時(shí)，因葡萄糖氧化磷酸化水平的不足，只能靠糖酵解來(lái)提供少量的能量，最終導(dǎo)致乳酸和氫離子的堆積，機(jī)體自動(dòng)激活離子交換轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致鈣離子超載，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。鈣超載的程度與心肌細(xì)胞的受損程度呈正相關(guān)，而鈣超負(fù)荷又進(jìn)一步導(dǎo)致線粒體損傷，內(nèi)呼吸功能受損，氧化代謝減弱，糖酵解增加，能量產(chǎn)生不足，形成惡性循環(huán)，也加劇了CHF的惡化[21-23]。AMPKs是心臟能量代謝的調(diào)節(jié)器[24]，細(xì)胞中ATP降低時(shí)，AMPK被激活并且能調(diào)節(jié)多種與能量平衡相關(guān)的生理過(guò)程，在心臟中AMPK激活能增加脂肪酸氧化，且在通過(guò)CPT-1的作用下，長(zhǎng)鏈脂肪酸可以轉(zhuǎn)化成脂肪酰輔酶A，增加脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行脂肪酸β氧化[24-26]。AMPK的激活能促進(jìn)肌小節(jié)上GLUT-4對(duì)葡萄糖的吸收；AMPK激活也能直接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子和共調(diào)節(jié)因子如PGC-1α[24]。益氣復(fù)脈可以通過(guò)調(diào)控p-AMPK、AMPK、GLUT-4、CPT-1蛋白的表達(dá)，從而提高糖類能量代謝產(chǎn)能效率，改善能量代謝。

綜上，益氣復(fù)脈可以通過(guò)降低血清中炎癥因子水平、提高心肌抗氧化能力、提升ATP含量、減緩CHF大鼠的病理?yè)p傷程度等途徑，改善能量代謝，緩解心衰癥狀，從而改善心功能。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect and mechanism of Yiqi Fumai Lyophilized Injection on rats with chronic heart failure

ZHAI You1, WU Ming-ming1, DENG Lin-hua2, GAO Dan3, ZHANG Ji-si1, ZHANG Yuan1, LIU Si-yuan4, MEI Yu-hang5, WANG Zhen-liang1, ZHAO Ying-qiang3

1. Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 2. Dongzhimen Hospital Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China 3. Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300150, China 4. School of Acupuncture-Moxibustion and Tuina of Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China 5. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847, China

To explore the pharmacodynamic effect and mechanism of Yiqi Fumai Lyophilized Injection (注射用益氣復(fù)脈, YQFM) on improving rats with chronic heart failure (CHF) caused by myocardial infarction.Seventy-five SD rats were randomly divided into model group, YQFM low-and high-dose (464.3, 928.6 mg/kg) groups, captopril (3.35 mg/kg) and YQFM (464.3 mg/kg) + captopril (3.35 mg/kg) group, and 15 SD rats with incision suture but no ligation were selected as sham group. After two weeks of drug intervention, the cardiac function of rats was detected by small animal ultrasonic diagnostic instrument. Levels of central natriuretic peptide (ANP), brain natriuretic peptide (BNP), endothelin-1 (ET-1), cardiac troponin (cTn), interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α), adenosine triphosphate (ATP) and creatine kinase (CK), creatine kinase isoenzyme-MB (CK-MB), superoxide dismutase (SOD) activities in serum were detected by ELISA; HE staining was used to observe the pathological changes of heart tissue in rats in each group. Western blotting was used to detect the expressions of energy metabolism-related proteins in hearts of rats in each group.Compared with sham group, the left ventricular ejection fraction (LVEF), E/A peak of mitral flow spectrum (E/A) and shortening rate of left ventricular short axis (LVFS) in model group were significantly decreased (< 0.001), levels of ANP, BNP, cTn, ET-1, IL-6, TNF-α and CK activity in serum were significantly increased (< 0.001), SOD activity and ATP level were significantly decreased (< 0.001), pathological changes such as myocardial fiber breakage, myocardial cell degeneration and necrosis occurred in the left ventricle, AMP-activated protein kinase (AMPK), p-AMPK, glucose transporter-4 (GLUT-4) and carnitine palmitoyl transferase-1 (CPT-1) protein expression levels were significantly decreased (< 0.05, 0.01, 0.001). Compared with model group, LVEF, E/A and LVFS in each administration group were significantly increased (< 0.05, 0.01, 0.001), levels of ANP, BNP, cTn, ET-1, IL-6, TNF-α and CK-MB and CK activities in serum were significantly decreased (< 0.05, 0.01, 0.001), SOD activity and ATP level were significantly increased (< 0.01, 0.001), myocardial injury in rats was obviously improved, p-AMPK, AMPK, GLUT-4 and CPT-1 protein expression levels in heart were significantly increased (< 0.05, 0.01, 0.001).YQFM can improve cardiac function by increasing ejection fraction and systolic and diastolic function in CHF rats, and improve heart failure symptoms and energy metabolism by reducing serum myocardial injury and oxidative stress levels in CHF rats, which may be one of its important mechanisms.

Yiqi Fumai Lyophilized Injection; chronic heart failure; cardiac function; oxidative stress; inflammation; energy metabolism

R285.5

A

0253 - 2670(2023)17 - 5649 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.17.018

2023-06-07

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2019YFC1710005）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82205081）；中國(guó)博士后科學(xué)基金第16批特別資助項(xiàng)目（2023T160069）；2021年度科技協(xié)同創(chuàng)新專項(xiàng)（XTCX2021-09）

翟 優(yōu)，男，講師，博士，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥防治心血管疾病。E-mail: zhaiyou036@163.com

趙英強(qiáng)，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，從事中醫(yī)藥防治心血管疾病的研究。E-mail: zhaoyingqiang1000@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]